金属β-内酰胺酶的研究进展

陈照强;刘一方;朱宁;陈姣;郑珩

【摘 要】金属β-内酰胺类酶是一类需要金属离子协助才能发挥催化活性的一类广谱β-内酰胺酶,它能水解包括碳青霉烯在内的几乎所有的β-内酰胺类抗生素,且不被临床所用的β-内酰胺类抗生素所抑制.由于该酶位于质粒(整合子)上,极易在细菌中扩散,近期发现的携带NDM-1金属β-内酰胺酶超级细菌证实了这一担忧.因此,本文从分类、结构、催化机制以及进化等方面对金属β-内酰胺酶的研究进展进行了综述,希望对抗菌治疗的研究提供帮助. 【期刊名称】《国外医药（抗生素分册）》 【年(卷),期】2011(032)003 【总页数】5页(P111-115)

【关键词】金属β-内酰胺酶;耐药性;作用机制;进化 【作 者】陈照强;刘一方;朱宁;陈姣;郑珩

【作者单位】中国药科大学生命科学与技术学院,南京,210009;中国药科大学生命科学与技术学院,南京,210009;中国药科大学生命科学与技术学院,南京,210009;中国药科大学生命科学与技术学院,南京,210009;中国药科大学生命科学与技术学院,南京,210009 【正文语种】中 文 【中图分类】Q814

β-内酰胺类抗生素在临床及农业上的广泛使用，使得细菌对之耐药性不断增强并广泛传播，其中产生β-内酰胺酶是细菌耐药的重要机制之一。Ambler[1]将β-内酰胺酶分为了A,B,C和D四类，其中A,C,D是丝氨酸β-内酰胺酶，它们活性位点有一个丝氨酸残基，帮助催化水解；金属酶属于B类β-内酰胺酶，它们发挥催化活性需要一个或两个金属离子的协助。金属β-内酰胺酶具有稳定且高效的碳青霉烯类（丝氨酸酶不能将其水解）的水解活性，可以催化水解除了单环外几乎所有的β-内酰胺类抗生素。另外金属β-内酰胺酶不能被临床上的现有β-内酰胺酶抑制剂所抑制。目前为止，MBLs（metallo β-lactamases）已经在多种菌株中分离出，如脆弱拟杆菌，铜绿假单胞菌，气单胞菌，黏质沙雷菌，金黄杆菌等。另外，在炭疽杆菌中也发现编码MBLs的沉默基因[2]。更加糟糕的是获得性的金属β-内酰胺酶的出现和传播，它们是由可移动的DNA元件编码，大部分在革兰阴性病原菌中包括肠杆菌科，铜绿假单胞菌科，不动杆菌科。新近报道的“新德里”超级细菌，体内携带了NDM-1型金属β-内酰胺酶基因[2]，在NDM及其它耐药基因的作用下，该类细菌对几乎所有类型的抗生素都有耐药性，其患者将面临无药可救的境地。NDM超级细菌的出现，在为我们滥用抗生素敲响警钟的同时，也为耐药性及相关新抗研究提出了挑战。因此，研究金属β-内酰胺酶，开发新型耐酶抗生素或酶抑制剂，对于应对日趋严重的细菌耐药性问题具有重要意义。 1 金属β-内酰胺酶的分类

金属β-内酰胺酶基于序列的相似性又被分成了3个亚类B1，B2，B3[4]（采用BBL标准编码可以方便对它们进行序列比对[5]）。每一类都有晶体结构被测出来（图1）。

B1亚类的酶序列相似度超过23%，这些酶包括来自枯草芽孢菌的Bcll酶，来自脆弱拟杆菌的CcrA酶，金黄杆菌的的BlaB酶，短稳杆菌的EBR-1酶[6]，从铜绿假

单胞菌、黏质沙雷氏菌、肺炎克雷伯菌和鲍曼不动杆菌中分离得到获得性的IMP型金属β-内酰胺酶，以及从铜绿假单胞菌产生的VIM型及SPM-1型（见表1）。 B2亚类的酶和B1亚类的酶只有11%的相似度。这一类中包括由不同种的气单胞菌属产生的酶（大部分研究用的是嗜水气单胞菌产生的CphA酶，以及由A.veronii菌产生的lmiS酶，以及由泉居沙雷菌产生的Sfh-I酶）（见表1）。 B3亚类的金属β-内酰胺酶和其它类的酶相比只有9个保守的残基。B3类包括临床分离的菌株S.maltophilia [7]产生的L1酶， E.meningoseptica产生的GOB-1酶，军团杆菌产生的FEZ-1酶，以及环境中Bradyrhizobium japonicum细菌产生的BJP-1酶[2]。

图1 B类金属酶的晶体结构Figure 1 The structures of class B metalloenzymes

2 金属β-内酰胺酶水解抗生素的机制

B1和B3亚类的金属β-内酰胺酶多是广谱酶，能够水解除单环以外的几乎所有β-内酰胺类抗生素 [5](见表1)。来自于嗜冷 Shewanella frigidimaria菌的SFB-1是独特的B1类β-内酰胺酶，它不能够水解氨苄西林，羟基噻吩青霉素，第三代的头孢菌素以及美罗培南。B2类酶主要是针对碳青霉烯类抗生素的，它们能够高效的催化分解碳青霉烯类抗生素，也会对青霉素和头孢菌素表现弱的活性。 Bounaga等[8]在1998年提出了B1亚类的单锌酶Bcll水解抗生素的作用机制。锌离子和His116，His118，His196及水分子相互作用。在这个过程中，锌离子起到路威斯酸的作用，降低水分子的pK值，使水能以羟基的形式存在于中性溶液中。120位的天门冬氨酸，作为普通的碱，对羟基基团去质子化，从而产生一个双阴离子的四面体的第二中间物，并通过锌离子进一步稳定的。接着，Asp120把质子传递给内酰胺环上的氮原子，参与环的打开。

基于CcrA和L1酶对头孢硝噻吩水解的研究，Wang等在1999年提出了双锌金

属β-内酰胺酶的作用机制[9]。在β-内酰胺抗生素底物加入到酶中后，Znl-羟基作为亲核试剂进攻β-内酰胺的羰基产生1个阴离子四面体中间复合物，然后C-N键断裂，β-内酰胺环水解。Zn2可直接与底物相互作用，摆正底物的位置使其易受亲核试剂进攻，并在转换中稳定载负电荷的即将离去的β-内酰胺基团。另外，当底物结合时，Zn2顶部的水配位基被取代，使得载负电的中间复合物和Zn2间存在强大的静电相互作用，防止底物在C-N键裂解时质子化，促进了产物的产生和催化效率的提高。配位体在Znl处从溶液中取1分子水交换中间复合物的酰基基团，酶的活性位点重新形成，为下一次催化作好了准备[7]。 表1 B类金属酶的分类Table 1 The classi fi cation of class B

metalloenzymes—：在相应的数据库中没找到。亚类 酶 菌株 年份 GenBank编号 Accession编号(蛋白质) PDB编号B1 BcII B.cereus 1966 M111 AAA22276 1MQO CcrA B.fragilis 1990 M63556 AAA22904 1A8T BlaB E.meningoseptica 1998 AF1298 O08498 1M2X IND-1 C.indologenes 1999 EF394437 ABO21411 —EBR-1 E.brevis 2002 AF416700 AAN32638 —SFB-1 Shewanella frigidimarina 2005 AY590119 AAT90847 —SLB-1 Shewanella livingstonensis 2005 AY590118 AAT90846 —获得性-B1 IMP-1 P.aeruginosa 1994 AY168635 AAN87168 1JJE VIM-1 A.baumannii 1999 Y18050 CAE46717 —VIM-2 A.baumannii 2000 AF1915 AAK26253 2YZ3 IMP-2 S.marcescens 2000 AB182996 BAD26594 —SPM-1 P.aeruginosa 2002 AY341249 AAR15341 2FHX VIM-4

K.penumoniae 2003 AY135661 AAR22402 —GIM-1 P.aeruginsa 2004 AJ620678 CAF05908 —SIM-1 A.baumannii 2005 AY887066 AAX76774 —NDM-1 E.coli 2010 AB5712 BAJ10873.1 —B2 CphA A.hydrophila 1991 X57102 P26918 1X8I Imis Aeromoas veronii 1996 Y01415

CAA71411 —Sfh-1 S.fonticola 2003 AF197943 AAF09244 —B3 L1 S.maltophilia 1991 AB2942 CAB75346 2H6A GOB-1 E.meningoseptica 2000 AF090141 ABO21417 —FEZ-1 L.gormanii 2000 Y176 CAB96921 1JT1 THIN-B j.lividum 2001 AJ250876 CAC33832 —Mbl1b C.crescentus 2001 AJ315850 CAC48262 —CAU-1 C.vibrioides 2001 AJ308331 CAC87665 —BJP-1B.japoncium2006—NP_7728703LVZ 3 金属β-内酰胺酶的超级家族

Neuwald等在1997年提出并定义了MBL超级家族这一概念[10]，除了水解β-内酰胺的金属酶外，它还包括了水解硫醇酯，磷酸二酯，硫酯键的酶以及氧化还原酶。这个有6000成员的超级家族中的绝大部分都有5个保守域：Asp84，His116-X-His118-XAsp120- His121， His196, Asp221，His263（为了便于比较分析，MBL超级家族位置编号使用BBL规则[5]），这些蛋白质的折叠或者某一个域的折叠都是αββα型，和含锌离子的β-内酰胺酶结构相似。在这些保守域当中，Asp84在二级结构中能发生变形，可能起到维持蛋白质的折叠作用。其他保守的残基都包含在金属的配位基中。这些酶中的绝大多数，第一个金属离子结合的位点有His116, His118 和 His 196，而第二个金属离子结合位点有Asp120, His121和 His263。和传统金属β-内酰胺酶相比，一个主要的不同点在于221位是否存在Asp，在β-内酰胺酶中这个位置是半胱氨酸（B1）或者丝氨酸（B3）。Asp221和一个水分子连接两个金属离子，GenBank中的许多酶也有这样的作用模式，但是绝大多数没有类似的功能。Daiyasu 等人已经根据生物功能把这些蛋白质分为17个群[11]，目前研究表明，只有3个群的这种作用模式是具有功能特性的，即：（1）传统的金属β-内酰胺酶,（2）乙二醛酶,（3）红素氧还蛋白。 这个超级家族催化类型的多样性，也解释了某些成员可以在面临抗生素的情况下，如何轻易的进化成金属β-内酰胺酶。已有研究表明金属β-内酰胺酶可能来是由一

个不具有内酰胺酶活性的祖先，经过趋异进化形成的。 4 金属β-内酰胺酶的进化

在抗生素的选择性压力下，金属β-内酰胺酶可能会变异成更高效的酶，或能水解新的底物，这已被一些人工进化实验所证实。对CcrA酶进行单点突变C121R的研究表明，来自脆弱拟杆菌的双金属β-内酰胺酶CcrA可能是由来自蜡状芽孢杆菌的单金属β-内酰胺酶Bcll进化而来的[12]。Bcll在121位是精氨酸，它可能是该酶与Zn2结合能力弱，以及催化效率相对较低有关。虽然CcrA–C121R 的突变体仍然能结合两个锌离子，但对头孢硝赛酚的水解效率却比于野生型的降低了一个数量级。如果通过螯合剂PAR和酶中的一个锌离子螯合，使得突变体成为单锌酶，则催化效率再次降低了一个数量级。对这两个酶（CcrA，Bcll）而言，单锌的催化效率大约是双锌的三分之一。β-内酰胺环中的酰胺键断裂后，第二个锌离子可稳定带负电荷的中间物，促进了限速步骤从酰胺键的断裂转为带负电荷的中间物的质子化。据此Fast 等认为，R121C的突变和第二个锌离子的结合都能增加催化效率，这可能是MBLs进化的重要步骤。

Murphy等测定了来自铜绿假单胞菌的MBL（SPM-1）的x射线晶体结构，并推测它可能会进化为一个更高效的酶[13]。在这个晶体结构中，SPM-1仅仅在Zn1的结合位点上结合了一个锌离子，Zn2结合位点没有能够结合锌离子，其原因可能是Cys221残基被氧化。此外SPM-1在84位是丝氨酸残基，而在更多高效的双核酶比如IMP-1 和 CcrA中是天冬氨酸残基。在IMP-1中，Asp84和Lys69形成了一个盐桥，再和Asp120的羰基静电相互作用，定位侧链的方向，使其和Zn2更好的配合。在CcrA中，Asp84并没有和Ser69形成盐桥，而是与一个钠离子配位，再和Asp120的羰基配位，这样的相互作用似乎使Asp120的侧链更好定位，从而有效结合Zn2。SPM-1酶由于缺乏这样的作用，所以不能结合第二个锌离子。因此，Murphy等认为SPM-1可能会通过S84D的突变进化成更有效

的酶。

除了已有的金属β-内酰胺酶能够进化成更加高效的酶以外，其它没有这种活性或有其他活性的蛋白也可能进化获得金属β-内酰胺酶活性[14]。如Park等通过合理组合和定向进化的方法，对醛酮变位酶II的骨架进行修饰改造，使其具有了MBL活性[15]。醛酮变位酶II在结构上和MBLs相似，但不水解β-内酰胺抗生素中的酰胺键，而是水解S-D-乳糖谷胱甘肽中的硫酯键。通过插入，删除以及替换一些活性位点环，获得MBL活性，接着进行定向进化使其对头孢菌素中的头孢噻肟有较好的活性。然而，设计出来的这种酶对头孢噻肟的催化效率仍很低，相比之下，IMP-1对头孢噻肟的催化效率比之高出4个数量级[16-17]。然而，从蛋白质工程的角度看，这些结果还是令人称赞的。但是它们和抗生素的耐药性的出现与进化的关系，目前还不是很清楚。

我们不仅需要考虑已有MBLs可能会进化成更高效的酶，还需要考虑这么一个可能，原本MBLs活性可能是由相关的酶中产生的。Park等的研究告诉人们这些可能会在不久的将来发生。另一方面，有些酶虽然现在还没有MBL活性特点，但是它们比醛酮变位酶II更容易获得MBL活性，只需进行简单的插入，删除就可以了。但是由于缺少相关生化和结构方面的数据，预测它们可能的进化方向仍然充满着巨大的挑战。 5 展望

金属酶由于其独特的作用机制，使其几乎能水解现有的各类β-内酰胺抗生素，而整合子介导的金属酶的存在，提示今后几年内，金属酶可能快速传播，同时碳青霉烯的使用量增加，将会给金属酶提供选择压力，使沉默金属酶基因激活而表达，如在2010出现的超级细菌NDM-1。目前全球已经有好多研究人员加入了“抗击超级细菌”的战斗中，从各个方面着手研究金属酶。在研究的过程中，也取得了一些进步。除了传统的方法外，还使用了计算机进行模拟作用机制，进化预测。

我们需要不断改进我们的研究方法，研发出理想的抗生素(不会诱导金属酶产生的)。锌离子虽然可以作为靶标，但也会抑制人体中重要的锌离子酶，所以我们需要寻找更好的靶标。为了尽快阻止MBLs的出现和传播，必须集中各个学科的专家比如基因学，微生物学，生物化学，分子建模，生物信息，以及临床研究，只有这样，只有这样才能打赢这场“抗击超级细菌”战斗。 参 考 文 献

[1]Ambler RP.The structure of ß-lactamases[J].Phil Trans Roy Soc ser B, 1980, 2:321

[2]Stoczko M, Frère JM, Rossolini GM, et al.Postgenomic scan of metallo-beta-lactamase homologues in rhizobacteria:identi fi cation and characterization of BJP-1, a subclass B3 ortholog from

Bradyrhizobacterium japonicum[J].Antimicrob Agents Chemother, 2006, 50:1973

[3]Kumarasamy KK, Toleman MA, Walsh TR, et al.Emergence of a new antibiotic resistance mechanism in India, Pakistan,and the UK: a molecular, biological, and epidemiological study[J].Lancet Infect Dis, 2010, 10(9):597 [4]Garau G, Garcia-Saez I, Bebrone C, et al.Update of the standard numbering scheme for class B beta-lactamases[J].Antimicrob Agents Chemother, 2004, 48:2347

[5]Felici A, Amicosante G, Oratore A, et al.An overview of the kinetic parameters of class B beta-lactamases[J].Biochem J,1993, 291:151

[6]Bellais S, Girlich D, Karim A, et al.EBR-1a novel Ambler subclass B1 beta-lactamase from Empedobacter brevis[J].Antimicrob Agents Chemother, 2005, 46:3233

[7]陈姣，郑珩, 沈秉正.IMP型金属β-内酰胺酶及其抑制剂研究进展[J].今日药学，2010, 20（9）：01

[8]Bounaga S, Laws AP, Galleni M, et al.The mechanism of catalysis and the inhibition of the Bacillus cereus zincdependent beta-lactamase[J].Biochem J, 1998, 331:703

[9]Wang Z, Fast W, Benkovic SJ.On the mechanism of the metallo-beta-lactamase from Bacteroides fragilis[J].Biochemistry , 1999, 38:10013 [10]Neuwald AF, Liu JS, Lipman DJ, et al.Extracting protein alignment models from the sequence database[J].Nucleic Acids Res, 1997, 25:1665 [11]Daiyasu H, Osaka K, Ishino Y, et al.Expansion of the zinc metallo-hydrolase family of the beta-lactamase fold[J].FEBS Lett , 2001, 503:1 [12]Fast W, Wang Z, Benkovic SJ.Familial mutations and zinc stoichiometry determine the rate-limiting step in nitroce fi n hydrolysis by metallo-beta-lactamase from Bacteroides fragilis[J].Biochemistry，2001, 40:10 [13]M urphy TA, Catto LE, Halford SE, et al.Crystal structure of Pseudomonas aeruginosa SPM-1 provides insights into variable zinc affinity of metallo-beta-lactamases[J].J Mol Biol, 2006, 357 : 0

[14]Röthlisberger D, Khersonsky O, Wollacott AM, et al.Kemp elimination catalysts by computational enzyme design[J].Nature, 2008, 453 :190 [15]Park HS, Nam SH, Lee JK, et al.Design and evolution of new catalytic activity with an existing protein scaffold[J].Science, 2006, 311 : 535 [16]Oelschlaeger P, Mayo SL, Pleiss J.Impact of remote mutations on metallo-β-lactamase substrate specificity:Implications for the evolution of antibiotic resistancev[J].Protein Sci, 2005, 14:765

[17]Materon IC, Beharry Z, Huang W, et al.Analysis of the context dependent sequence requirements of active site residues in the metallo-beta-lactamase IMP-1[J].J Mol Biol,2004 , 344: 653