一种脱细胞生物羊膜及种以及京尼平交联脱细胞生物羊膜的制备方法

(12)发明专利申请

(10)申请公布号 CN 105194735 A (43)申请公布日 2015.12.30

(21)申请号 201510727418.7(22)申请日 2015.10.30

(71)申请人成都青山利康药业有限公司

地址610000 四川省成都市高新区高朋大道

14号(72)发明人徐世兰 刘凯 侯鹏

(74)专利代理机构成都高远知识产权代理事务

所(普通合伙) 51222

代理人李高峡 张娟(51)Int.Cl.

A61L 27/36(2006.01)A61L 27/50(2006.01)A61L 27/60(2006.01)A61L 31/00(2006.01)A61L 31/14(2006.01)

(54)发明名称

一种脱细胞生物羊膜及种以及京尼平交联脱细胞生物羊膜的制备方法(57)摘要

本发明公开一种京尼平交联脱细胞生物羊膜的制备方法：a、制备脱细胞生物羊膜；b、取步骤a制备的脱细胞生物羊膜，浸泡于浓度为0.2％-1％的京尼平溶液中，35-40℃恒温下作用0.5-72h，纯化水或去离子水清洗；c、病毒灭活，纯化水或去离子水清洗，真空冷冻干燥，即可。本发明还提供了前述方法制备的京尼平交联脱细胞生物羊膜。本发明方法可以制备得到抗酶解性能优良、力学性能优良的京尼平交联脱细胞生物羊膜，克服了天然羊膜存在细胞残留、机械性能不足以及降解周期较短的缺陷，临床应用前景良好。 C N 1 0 5 1 9 4 7 3 5 A权利要求书1页 说明书7页 附图2页

CN 105194735 A

权 利 要 求 书

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1.一种京尼平交联脱细胞生物羊膜的制备方法，其特征在于：包括如下步骤：

a、制备脱细胞生物羊膜：(1)取羊膜，用甲醇-氯仿混合溶液浸泡22-24h，所述混合溶液中甲醇与氯仿的体积比为1:1～1:3，纯化水或去离子水清洗；

(2)用0.5～1％(w/v)十二烷基硫酸钠溶液浸泡22～24h，纯化水或去离子水清洗；(3)用0.25～0.5％(w/v)胰蛋白酶溶液消化22～24h，纯化水或去离子水清洗；b、取步骤a制备的脱细胞生物羊膜，浸泡于浓度为0.2％～1％的京尼平溶液中，35～40℃恒温下作用0.5～72h，纯化水或去离子水清洗；

c、病毒灭活，纯化水或去离子水清洗，真空冷冻干燥，即可。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤(1)中，所述混合溶液中甲醇和氯仿的体积比为1:1；所述浸泡的时间为24h。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤(2)中，所述十二烷基硫酸钠溶液的浓度为0.5％(w/v)；所述浸泡的时间为24h。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤(3)中，所述胰蛋白酶溶液的浓度为0.25％(w/v)；所述消化时间为24h。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤(1)、(2)和(3)中，纯化水和去离子水清洗的次数为3次。

6.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：步骤b中，京尼平溶液的浓度为0.4％。

7.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：步骤b中，所述京尼平溶液是含有京尼平的枸橼酸－磷酸氢二钠缓冲液，其pH为4.0；或者含有京尼平的磷酸盐缓冲溶液，其为pH 7.4。

8.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：步骤b中，温度为40℃；作用时间为24h；纯化水和去离子水清洗的次数为3次。

9.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：步骤c中，病毒灭活采用过氧乙酸(0.18％)-乙醇(4.8％)混合溶液浸泡灭活，灭活时间为4～72h，优选为24h。

10.权利要求1～9任意一项所述方法制备的京尼平交联脱细胞生物羊膜。

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说 明 书

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一种脱细胞生物羊膜及种以及京尼平交联脱细胞生物羊膜

的制备方法

技术领域

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本发明涉及脱细胞生物羊膜和京尼平交联脱细胞生物羊膜的制备方法。

背景技术

羊膜是胎膜的最内层，属于生物膜中的一种，是一类天然细胞外基质类生物

衍生材料。羊膜由滋养细胞层分化而来，表面光滑，半透明，有韧性及弹性，厚度为0.02-0.50mm，主要由I、III型纤维胶原蛋白构成，含有少量的VI、V型胶原，其中含有多种生长因子，如成纤维细胞生长因子-2(fibroblast growth factor-2,FGF-2)、转移生长因子-β(transforming growth-β，TGF-β)、促进血管生成的血管内皮生长因子(VEGF)，还含有纤维连接蛋白(fibronectin,FN)等。羊膜不表达HLA-A、B、C及DR抗原或β2微球蛋白，透明且无血管、淋巴和神经组织，其抗原性远低于普通组织。大量研究表明，羊膜具有良好的细胞相容性和组织相容性，并具有部位特异的组织再生能力，为一新型的生物衍生材料。

[0003] 羊膜作为生物材料应用于基础及临床已经有多年的历史。早在20世纪初期就有用含羊膜的胎膜供体移植于烧伤和溃疡创面的报道，随后在颅脑外科、腹腔外科、妇产科及眼科均有其应用的报道。具体来说其主要用途有：①用于眼睛表面疾病如角膜修复、先天性青光眼、角膜溃疡等；②用于修补鼓膜损伤；③用于外科手术后预防粘连；④用于烧伤后表面覆盖等。

[0004] 然而，羊膜存在细胞残留、机械性能不足以及降解周期较短等缺陷，限制了其临床应用范围。根据临床报道，由于羊膜细胞的存在，在眼科，羊膜植片可能会发生植片排斥反应、植片脱落、移位溶解、感染等并发症，其安全性存在一定的风险。此外，羊膜较薄，抗拉强度不足，抗张力强度弱，降解时间较快等，不能用于需要承受一定力学负荷的组织缺损的修复，如各种类型的胸壁、腹壁缺损(外伤性缺损、先天性缺损、医源性缺损等)；管道器官部分缺损(尿道、膀胱、输尿管、食管、胆管、肠穿孔、血管等)；周围神经缺损；韧带缺损等。因此，有必要对羊膜进行脱细胞处理，以降低其免疫原性，同时，采用适当的方法对羊膜进行改性处理，既能改善去抗酶解性能，增强其机械性能，又能保持其生物活性，以满足更多的临床需求。

[0005] 现在对生物源材料常用的改性措施有化学法，物理法等。化学法改性常用戍二醛、碳化二亚胺、顺丁稀二酸酐等，其残留物均有一定组织毒性，为 尽可能减少其残留量，必然会增加生产成本，不是最好选择。物理法主要采用紫外光、射线、微波等，虽然无毒无害，但生产过程中难以控制其时间及强度，难以控制其改性质量。近几年新出现的化学交联剂京尼平(Genipin，CAS NO:6902-77-8)，是栀子苷经β-葡萄糖苷酶水解后的产物，是一种优良的天然生物交联剂，可对生物源材料如胶原、壳聚糖、玻璃酸钠、蛋白、明胶等进行改性处理，其毒性远低于戊二醛和其他常用化学交联剂。而能提高拉伸强度，增强其生物活性，有利于组织再生愈合，生物相容性改善。

[0002]

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说 明 书

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王岚等，“京尼平交联羊膜的制备及其体外性能研究”，第三军医大学学报2012年2月28日第34卷第4期报道了一种用京尼平交联羊膜的方法，该方法可以在一定程度上提高其抗酶解性能和力学性能，但是提高程度有限，其在第2周的降解率为34.93％，在第4周降解率就高达74.62％。发明内容

为了解决上述问题，本发明提供了一种京尼平交联脱细胞生物羊膜的制备方法。

[0008] 本发明京尼平交联脱细胞生物羊膜的制备方法，包括如下步骤：[0009] a、制备脱细胞生物羊膜：[0010] (1)取羊膜，用甲醇-氯仿混合溶液浸泡22～24h，所述混合溶液中甲醇与氯仿的体积比为1:1～1:3，纯化水或去离子水清洗；

[0011] (2)用0.5～1％(w/v)十二烷基硫酸钠溶液浸泡22～24h，纯化水或去离子水清洗；

[0012] (3)用0.25～0.5％(w/v)胰蛋白酶溶液消化22～24h，纯化水或去离子水清洗。[0013] b、取步骤a制备的脱细胞生物羊膜，浸泡于浓度为0.2％～1％的京尼平溶液中，35～40℃恒温下作用0.5～72h，纯化水或去离子水清洗；[0014] c、病毒灭活，纯化水或去离子水清洗，真空冷冻干燥，即可。[0015] 步骤(1)中，所述混合溶液中甲醇和氯仿的体积比为1:1；所述浸泡的时间为24h。[0016] 步骤(2)中，所述十二烷基硫酸钠溶液的浓度为0.5％(w/v)；所述浸泡的时间为24h。

[0017] 步骤(3)中，所述胰蛋白酶溶液的浓度为0.25％(w/v)；所述消化时间为24h。[0018] 步骤(1)、(2)和(3)中，纯化水和去离子水清洗的次数为3次。[0019] 步骤b中，京尼平溶液的浓度为0.4％。[0020] 步骤b中，所述京尼平溶液是含有京尼平的的枸橼酸－磷酸氢二钠缓冲液，其pH为4.0；或者含有京尼平的磷酸盐缓冲溶液，其为pH 7.4。[0021] 步骤b中，温度为40℃；作用时间为24h；纯化水和去离子水清洗的次数为3次。[0022] 步骤c中，病毒灭活采用过氧乙酸(0.18％)-乙醇(4.8％)混合溶液浸泡灭活，灭活时间为4～72h，优选24h。

[0023] 本发明还提供了前述方法制备的京尼平交联脱细胞生物羊膜。[0024] 本发明通过特定的脱细胞处理结合特定的交联方法，制备得到了抗酶解性能优良、力学性能优良的京尼平交联脱细胞生物羊膜，其在第15天时仍然未降解，在60天时尚未完全降解，克服了羊膜存在细胞残留、机械性能不足以及降解周期较短的缺陷，临床应用前景良好。

[0025] 以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实施例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。

[0007]

附图说明

[0026]

图1未交联的脱细胞生物羊膜(×10000)

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说 明 书

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图2京尼平交联脱细胞生物羊膜(×10000)[0028] 图3京尼平交联脱细胞生物羊膜(横切面，×400)[0029] 图4京尼平交联脱细胞生物羊膜(纵切面，×400)

[0030] 图5成纤维细胞接种于京尼平交联脱细胞生物羊膜培养1天后HE染色，细胞呈梭形(×100)

[0031] 图6京尼平交联前后脱细胞生物羊膜外观图片。

具体实施方式

[0032] 实施例1本发明京尼平交联脱细胞生物羊膜的制备[0033] 一、制备方法[0034] 1、脱细胞生物羊膜的制备[0035] 取健康产妇胎盘，从胎盘上剥取羊膜，0.9％生理盐水多次浸泡清洗，除去血液成分，纯化水或去离子水清洗3次，甲醇：氯仿(1：1)混合溶液浸泡脱脂24h，纯化水或去离子水清洗3次，0.5％十二烷基硫酸钠(SDS)浸泡去垢24h，纯化水或去离子水清洗3次，0.25％胰蛋白酶消化脱细胞24h，纯化水或去离子水清洗3次。[0036] 2、脱细胞生物羊膜的京尼平交联处理

[0037] 将脱细胞生物羊膜浸泡于京尼平浓度为0.4％，溶剂为pH4.0的枸橼酸－磷酸氢二钠缓冲溶液中，40℃恒温下作用24h，纯化水或去离子水清洗3次，过氧乙酸(0.18％)-乙醇(4.8％)混合溶液浸泡病毒灭活24h，纯化水或去离子水清洗3次，真空冷冻干燥，裁切包装，辐照灭菌。[0038] 二、检测成品检测[0039] 3.1电镜扫描

[0040] 将待观察的羊膜样品置于2.5％戊二醛磷酸缓冲液(pH7.2左右)中，于4℃冰箱中固定过夜。次日以0.15％的同一缓冲液冲洗，用40％、70％、90％和100％的乙醇分别依次脱水，每次15min，脱水后，用醋酸戊脂置换乙醇。采用常规的二氧化碳临界点干燥，干燥结束后，将样品放在真空镀膜机内，把金喷镀到样品表面后，取出样品在扫描电镜中进行观察。

[0041] 扫描结果显示，未交联的脱细胞生物羊膜保持了天然的胶原蛋白三维网状支架结构(图1)，京尼平交联后的脱细胞生物羊膜同样保持了天然的胶原蛋白三维网状支架结构，但纤维连接更为致密(图2)。[0042] 3.2细胞残留检测

[0043] 采用常规的HE组织学病理切片对京尼平交联脱细胞生物羊膜进行检测，结果显示，羊膜的横切面(图3)和纵切面均未见细胞残留(图4)。[0044] 3.3机械性能测定[0045] 拉伸强度、断裂伸长率、弹性模量的测定采用济南兰光机电技术有限公司生产的XLW(PC)智能电子拉力试验机，使用50N传感器,速度25mm/min，羊膜试样的尺寸为1cm×4cm。

[0046] [0047]

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表1机械性能测定结果

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说 明 书

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测定结果显示，京尼平交联羊膜组的拉伸强度为(1.6043±0.0579)MPa，断裂伸长率为(28.975±3.0903)％，弹性模量为(0.0053±0.0003)GPa，与未交联的脱细胞生物羊膜(0.8003±0.041)MPa,(16.181±2.6808)％，(0.0033±0.0002)GPa相比，三者均明显增加(p＜0.05)。

[0049] 3.4溶胀率测定

[0050] 溶胀率反映了材料吸水膨胀的性能，材料的网络交联程度越高，溶胀率越小。

[0048]

在室温下，将京尼平交联脱细胞生物羊膜(20mm×20mm)浸泡于50mL0.9％生理盐水溶液中充分复水，测定其溶胀率。溶胀率(％)＝(材料湿重-材料干重)/材料干重×100％。

[0052] 表2溶胀率测定结果

[0051] [0053]

结果显示，京尼平交联脱细胞生物羊膜溶胀率为90.92±1.5％，与未交联的羊膜

相比(77.91±1.6％)，溶胀率降低(P＜0.05)。[0055] 3.5交联度测定

[0056] 取京尼平交联脱细胞生物羊膜约10mg(约40mm×40mm)，在玻璃乳钵内加纯化水5ml充分匀浆，将匀浆物转移至25ml量瓶中，用纯化水10ml分多次洗涤乳钵，洗涤水均转移至量瓶中烧杯，加入0.2％茚三酮水溶液5ml，100℃沸水浴加热20min，冷却，加纯化水至刻度定容。离心，取上清液于570nm处测定吸光度。平行测定两个样品，按下列公式计算：[0057] 交联度＝(交联前吸光度一交联后吸光度)/交联前吸光度×100％[0058] 交联前的吸光度数据来自于同步处理，但不采用京尼平交联的同一张羊膜。[0059] 表3溶胀率测定结果

[0054] [0060]

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说 明 书

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经测定，该材料的交联度为88.78±0.83％，说明材料交联较为充分。[0062] 3.6抗酶解性能

[0063] 取京尼平交联脱细胞生物羊膜10mm×10mm大小一块，置于5ml玻璃安瓿瓶中，加入灭菌水解液5ml(0.05mg/ml胶原酶I,pH 7.4磷酸盐缓冲液)，并将安瓿瓶融封，置于35±2℃恒温箱中，定期观察(0、1、3、7、15、30、45、60天)，按下表记录羊膜降解情况。平行观察3个样品，以未交联脱细胞生物羊膜为对照。[0064] 表4降解评价表

[0061] [0065]

分级 0 1 2 3 4 5

[0066] [0067]

描述

溶液澄清，羊膜外观完好 溶液轻微浑浊，羊膜外观完好 羊膜明显变薄 羊膜明显不完整 仅可见少量残片 无明显可见残片，羊膜基本完全降解

表5体外降解评分记录

未交联脱细胞生物羊膜15d左右羊膜明显变薄(1～2分)，45d已完全降解(5

分)，京尼平交联脱细胞生物羊膜30d左右羊膜明显变薄(2分)，60d尚未完全降解(3分)，说明其抗酶解的能力优于未未交联的脱细胞生物羊膜。[0069] 3.7生长因子测定

[0068]

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说 明 书

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采用武汉博士德ELISA试剂盒对材料中的EGF(表皮生长因子)和HGF(肝细胞生长因子)两种生长因子进行检测，按试剂盒说明书进行取样操作，酶标仪的检测波长为450nm。

[0071] 检测结果显示，京尼平交联脱细胞生物羊膜和未交联脱细胞生物羊膜均含有一定量的生物活性因子，羊膜交联前后，生长因子略微下降，但无明显 的变化。交联组EGF和HGF的含量分别为0.023±0.008pg/cm2和0.129±0.002pg/cm2，未交联组EGF和HGF的含量分别为0.024±0.013pg/cm2和0.139±0.021pg/cm2。[0072] 表6生长因子测定结果

[0073]

3.8细胞相容性

[0075] 3.8.1体外复合细胞培养

[0076] 将京尼平交联脱细胞生物羊膜用培养液预湿，植入人成纤维细胞，种植密度为10万，DMEM/HamsF12培养液，pH7.2,5％CO2饱和湿度培养，每2天换液1次，倒置相差显微镜下观察细胞的黏附、生长情况。

[0077] 人成纤维细胞复合于材料4小时后，倒置相差显微镜下观察可见细胞紧密贴附于材料表面，仅少数细胞流落到培养瓶底贴壁生长。加入培养液继续培养10小时后观察，成纤维细胞已经伸展，有多个突起。24小时后细胞大多呈梭形。培养3天后，贴附于材料的细胞数量增加。培养7天后细胞两侧突起伸长。继续培养，细胞数量和形态无明显变化。成纤维细胞能在材料上正常生长、增殖(图5)。[0078] 3.8.2浸提液细胞毒性实验

[0079] 将无菌的京尼平交联脱细胞生物羊膜用细胞培养液(DMEM培养液中含10％小牛血清)按表面积(两面)6cm2/ml的比例在37℃无菌条件下浸提48h作为浸提液。将鼠成纤维细胞制备成每50000/ml的细胞悬液，接种于96孔培养板中，每孔100μl细胞悬液和100μl材料浸提液，阴性对照组以100μl细胞培养液代替材料浸提液，每组5个平行样，置于37℃、5％CO2培养箱中培养5d，分别于1、3、5d取出一个96孔板行MTT活性检测(在490nm波长检查光密度值)，按下列公式计算细胞相对生长率(RGR)。细胞相对增殖率(RGR)＝(实验组OD值-空白对照组OD值)/(阴性对照组OD值-空白对照组OD值)×100％。再按国标“GB/T16886.5-2003”的标准评定材料细胞毒性等级。

[0080] MTT实验证实京尼平交联脱细胞生物羊膜浸提液培养成纤维细胞1、3和5天后，细胞相对增殖率均大于90％，第1天RGR为95.67±1.00％，1级，第3天为101.35±2.04％，

[0074]

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说 明 书

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0级，第5天为102.19±0.98％，0级，材料无细胞毒性。[0081] 表7浸提液细胞毒性实验

[0082]

3.8膜材的颜色和透明度

[0084] 结果如图6所示，本发明方法制备得到的羊膜京尼平交联脱细胞生物羊膜外观呈无色或乳白色半透明薄膜。

[0085] 实施例2本发明京尼平交联脱细胞生物羊膜的制备[0086] 1、脱细胞生物羊膜的制备[0087] 取健康产妇胎盘，从胎盘上剥取羊膜，0.9％生理盐水多次浸泡清洗，除去血液成分，纯化水或去离子水清洗3次，甲醇：氯仿(1：1)混合溶液浸泡脱脂22h，纯化水或去离子水清洗3次，0.5％十二烷基硫酸钠(SDS)浸泡去垢22h，纯化水或去离子水清洗3次，0.25％胰蛋白酶消化脱细胞22h，纯化水或去离子水清洗3次。[0088] 2、脱细胞生物羊膜的京尼平交联处理

[0089] 将脱细胞生物羊膜浸泡于京尼平浓度为0.2％，溶剂为pH 7.4的磷酸盐缓冲溶液中，40℃恒温下作用8h，纯化水或去离子水清洗3次，过氧乙酸(0.18％)-乙醇(4.8％)混合溶液浸泡病毒灭活72h，纯化水或去离子水清洗3次，真空冷冻干燥，裁切包装，环氧乙烷灭菌。

[0090] 综上，本发明通过特定的脱细胞处理结合特定的交联方法，制备得到了抗酶解性能优良、力学性能优良的京尼平交联脱细胞生物羊膜，其在第15天时仍然未降解，在60天时尚未完全降解，克服了羊膜存在细胞残留、机械性能不足以及降解周期较短的缺陷，临床应用前景良好。

[0083]

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说 明 书 附 图

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图2

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图5

图4

图6

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