异常免疫表型模式在急性髓系白血病微小残留检测中的应用

·213·

·论 著·

异常免疫表型模式在急性髓系白血病微小残留检测中的应用*

()四川大学华西医院实验医学科,四川成都610041

母 璨,叶远馨,应斌武△

目的 用多参数流式细胞术区分急性髓性白血病细胞与正常骨髓原始细胞免疫表型,建立急性髓 摘 要:

系白血病细胞异常免疫表型模式和流式细胞术检测急性白血病微小残留病的方法。方法 选择正常骨髓标本和急性髓性白血病患者骨髓标本,用流式细胞术分析髓系原始细胞免疫表型特征。并将标记抗原用于分析初发白血病细胞免疫表型,以寻找急性髓系白血病细胞异常免疫表型模式和确定用于微小残留病检测的抗体组合,更好地提示患者复发情况。并将流式细胞术结果、骨髓细胞形态学结果和PCR融合基因检测结果进行比较。结果 分析20例非恶性血液系统恶性疾病患者的骨髓标本中髓系原始细胞的免疫表型,CD117阳性髓系例非早幼粒细胞白血病的急性髓性白血病患者免疫表型特征,异常免疫表型有3占9其中跨系表14例,0.80%,原始细胞占2.均有特定免疫表型特征。检测351%±0.84%,CD34阳性髓系原始细胞占1.21%±0.83%,46(、/(,抗原表达强度变化或抗原缺失主要包括原始粒细胞不表达HL2.89%)CD14CD1171.16%)A-DR(、((,(。早幼粒细胞白血病患者3或C以及单核细胞不表达C4.62%)CD137.51%)D3312.14%)D145.20%)1例,有异常免疫表型的仅占1低于非早幼粒细胞白血病的急性髓性白血病。根据白血病异常免疫表型模6.7%,式,与P能很好地提示白血病进展。结论 急性髓性白血病细胞具有明显不同于正常来源原CR结果符合度高,始细胞的异常免疫表型特征,适合采用流式细胞术进行微小残留病检测,并能反映体内白血病细胞负荷和病情变化。

:/DOI10.3969.issn.1673-4130.2020.02.021j

()文章编号:1673-4130202002-0213-05

、、,/达抗原主要包括C跨阶段共表达的抗原包括CD7(31.21%)CD56(23.70%)CD19(13.87%)D34CD64

关键词:流式细胞术; 免疫表型; 急性髓性白血病; 微小残留病

文献标识码:A

中图法分类号:R733.71

Detectionofminimalresidualdiseaseinacutemeloidleukemiabberrantimmunohenoteyyapyp

△

MUCan,YEYuanxin,YINGBinwu*

ternofacutemeloidleukemiacellswasestablishedandtheflowctometrasusedtodetectminimalresid-yyyw

rimordialcellsweredistinuishedbultiarameterflowctometr.Theabnormalimmunohenotepat-pgympyypyp

:AbstractObective Theimmunohenotesofacutemeloidleukemiacellsandnormalbonemarrowpypyj

(Deartmentoaboratoredicine,WestChinaHositalopfLyMpfSichuanUniversithendu,Sichuan610041,China)yCgwereanalzedblowctometr.Inordertofindouttheabnormalimmunohenotepatternofacuteme-yyfyypypy

,loidleukemiacellsandtodeterminetheantibodombinationfordetectionofminimalresidualdiseaseweal-yc

ualdiseaseofacuteleukemia.Methods Theimmunohenoticcharacteristicsofmeloidprimordialcellspypy

teofmeloidprimordialcellsinbonemarrowof20patientswithnonhematoloicmalinancieswasana-ypygg

lzed.CD117positivemeloidcellsaccountedfor2.51%±0.84%,CD34positivemeloidcellsaccountedforyyy

sousedthemarkerantientoanalzetheimmunohenoteofrimarleukemiacells.Theresultsofflowc-gypyppyy

,tometrmorholofbonemarrowcellsandPCRfusiongenewerecomared.Results Theimmunoheno-ypgyopp

1.21%±0.83%,allofwhichhadsecificimmunohenoticcharacteristics.Aberrantimmunohenoteppyppyp

,)werefoundin314of346AML(90.80%)acutepromelocticleukemiaexcluded.Mainimmunohenotesyypyp

)。专项资金项目(2018CDPZH-13

*

);;基金项目:国家自然科学基金项目(中国科学技术部国家科技重大专项(四川大学攀枝花市科技合作816720952018ZX10715003-001)-△

:母璨,女,医师,主要从事分子生物学研究。 通信作者, 作者简介:E-mailbinwuin@126.com。yg

217.

]:本文引用格式:母璨,叶远馨,应斌武.异常免疫表型模式在急性髓系白血病微小残留检测中的应用[国际检验医学杂志,J.2020,41(2)213-

·214·

,,,国际检验医学杂志2020年1月第41卷第2期 IntJLabMedJanuar020Vol.41No.2y2

,oflineaecross-exressinncludedCD7(31.21%)CD56(23.70%)andCD19(13.87%).Cross-staeex-gpgig

/(,/(ressinntienincludedCD34CD642.89%)CD14CD1171.16%).Antienintensithaneordeficiencpgaggycgy

lowerthanthatofnonpromelocticleukemia.Accordinotheabnormalimmunohenoticpatternofleu-yygtpyp

,,kemiaitishihlonsistentwithPCRresultswhichcanwellindicatetheproressionofleukemia.Conclusiongycg

、,mainlincludedHLA-DR(4.62%)CD13(7.51%)CD33(12.14%)andCD14onmonocticleukemiayy(,,5.20%).In31casesofpromelocticleukemiaonl6.7%hadabnormalimmunohenotewhichwasyyy1pyp

Acutemeloidleukemiacellshaveabnormalimmunohenoticcharacteristicswhicharedifferentfromypyp

,thoseofnormalrimordialcells.Itissuitabletodetectminimalresidualdiseasebflowctometranditcanpyyy

reflecttheloadofleukemiacellsandthechaneofdiseaseconditioninvivo.g

:;;;Keordsflowctometr immunohenote acutemeloidleukemia minimalresidualdiseaseyypypyyw

急性髓系白血病是髓系造血干/祖细胞克隆性恶

性增殖的血液系统疾病,以髓系原始细胞和幼稚细胞的恶性增殖为主要特征。虽然其临床缓解率可达

0%以上[1

],但仅30%~40%的年轻患者和不及

困扰白血病0%的老年患者能达到长期无病生存

[2-4

]治愈的一个难点。而形态学方。复发仍是法评价疗效及预后存在不足,治疗后达到完全缓解的患者中很多人(会在不同时间间隔后复发。此时微小残留病

性M。RD)检测的出现为解决这一临床问题提供了可能得形态学完全MRD是指白血病患者经诱导化疗或骨髓移植获缓解后体内仍残存的形态学上不能检测到的少量白血病细胞。随着技术的进步,测方法呈现多样化,检测的灵敏度也不断M提R高D检[

5]

MRD检测有利于更早地预测白血病的复发,指导白。血病的临床治疗,根据体内白血病细胞多少以决定是继续化疗抑或停止治疗;有利于较早发现白血病细胞是否耐药,并依此指导临床选用更灵敏、更具杀伤力

的治疗措施[6

]体造血干细胞移植的净化效果;有助于评价骨髓移植后的缓解率及自[

7

]部分白血病通过PCR技术检测特定基因异常来

。检测检测具有一MRD[8]

定。意因此义。,P但CR技术对于急性白血病部分急性髓系白血病目M前RD性白血病患者均要筛选出特定基因异常其成本较高并且对每一位初诊的急

本身尚不能检测到基因异常[9

],。因此,建立流式细胞术检测急性白血病患者方法仍是必要的。

MRD的

本研究旨在采用流式细胞术对正常骨髓髓系原始细胞和急性髓系白血病细胞免疫表型进行分析,探讨急性髓系白血病细胞异常免疫表型模式和用于MRD检测的抗体组合,建立以多色流式细胞术检测急性髓系白血病MRD的方法,并探讨其对疾病复发监测的临床应用价值。

资料与方法.1 一般资料年为急性髓系白血病患者6月至2018 实验对象为四川大学华西医院年6月就诊的患者。其中初诊时确诊2017346例,

初诊时已进行全面免疫表型分析且临床已明确急性白血病亚型,在行诱导化疗后及巩固化疗长期随访监测过程中可抽取骨髓标本进行病患者20M例R。D检测的患者采用肝素钠抗凝真空采血管收集患者58例,

非恶性血液系统疾新鲜骨髓标本,按照荧光抗体试剂配套的操作说明书标记、处理、检测所需抗原。所有急性髓系白血病患者诊断、分类标准参照《类》(2016版)。完全缓解WHO造血和淋巴组织肿瘤分标准参照《血液病诊断及疗效标准》

。1.2 仪器与试剂自美国素、磷酸盐缓冲液BD公司。 荧光标记的单克隆抗体试剂均购除此之外还使用了(BD公司穿孔BDFACSCantoⅡP流式细胞仪BS

)、氯化铵溶血剂、低速离心机。本实验采用、BD流式分析软件。

Diva1.3 方法 本研究检测了20例非恶性血液系统疾

病患者骨髓标本中髓系原始细胞的免疫表型(相关抗

原标记包括CHD33、CD3CD2、CD5、CD7、CD13、CD15、CD19、收集LA-白血病细胞3D46R)例初诊急性髓系白血病患者骨髓标本,4以建立正常髓系原始细胞免疫表型模式、CD38、CD117、CD56、CD14、CD64、,分析。(异常免疫表型,包括:(2)跨阶段表达;(3过度表达及缺1失)抗表原达跨。系收表集达5;例髓系白MRD患者骨髓标本),

分析其残留情况。对于急性8血病患者,评估的抗体组合主要包括:CCDCD1435/,CDC3D37//CCDD3141/7C/DC4D51,9/CCDD5364//CCDD14157,/CCDD328//CD15

/CCDD1314

7//组合方D5/CD式45可,C以D6视4/初CD诊11时7/免CD疫14表/C型D3而4/定H。LA对-D于R/流CD式45细

。胞术(MRD检和复发情况尚在诱导化疗期的患者除外测结果阳性而细。

),胞观察其后期临床缓解形态学阴性的患者1.4 统计学处理以x±s表示,计数资料以率表示 统计软件采用,各类抗体表达之间的SPSS17.0,计量资料比较分析采用χ2

检验,以P<0.05表示有统计学意义。

2 结2.1 果

正常骨髓的髓系原始细胞免疫表型 在CD45

/8211,,,国际检验医学杂志2020年1月第41卷第2期 IntJLabMedJanuar020Vol.41No.2y2

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SSC散点图上,20例非恶性血液系统疾病患者骨髓标

本中原始细胞区细胞主要为CD117阳性髓系原始细胞,其在有核细胞中所占比例为2.这51%±0.84%,

++CD64为11.2%±6.80%,CD7为2.7%±3.50%,

++

CD19为0.11%±0.13%,CD5为0.08%±0.09%,

原跨系表达。

2.3 急性髓系白血病MRD检测 研究对象中58例

急性髓系白血病患者共进行了1与73次MRD检测,骨髓细胞形态学分析相比较,采用χ2检验对结果进比例>5%而流式细胞术为阴性的2次结果中,原始细胞免疫表型均无明显异常,临床亦无明显复发的证其中2次形态学结论为阴性;原始细胞比例<36次,

其中35%的有41次,0次形态学结论为阴性。据。流式细胞术阳性结果中原始细胞比例>5%的有

类CD117阳性原始细胞共表达抗原阳性率如下:

χ2=2行分析,4.735,P=0.00。细胞形态学原始细胞

++

HLA-DR为90.61%±8.77%,CD14为0.09%±0.11%。还有部分原始细胞区细胞为CD34阳性髓系

这类C0.83%,D34阳性原始细胞共表达抗原阳性率如

+++-下:CD13/CD33为72.6%±11.80%,CD13/CD33

原始细胞,其在有核细胞中所占比例为1.21%±

为.D6242+

.3为%0±1.163%.9±00%.,0C9D%56+,为HLA-1D.R3-1为%±10.1.108%%±

,

.0580%%,对于单核。

CD15+为1.4%±0.10%,CD38+

为97.2%±细胞,主要观察了D64的表达,单核细胞群中CD1C3D/CD+33、CD1+

4

/.D14+/CD64+

细胞分别占单核细胞的1399/.C0D83%3±

、

.322 %和急性髓系白血病细胞免疫分型97.75%±1.71%。

46例急性髓系白血病的白血病细胞免疫表型 本研究分析了[

急性早幼粒细胞白血病(的有314例(占APL志物中,跨系表9达0有.8。)除在本研究外],出现所异涉常及免的疫抗表型跨阶段表达有5%类),抗原表达强度变化或原缺标失有7类,3类。各类抗原异常表达在急性髓系白血病中出现的阳性率见表表1 急性髓系白血病抗原异常表达及其阳性率

1。

项目异常抗原表达

n阳性率(跨系表达

CD117+

/CD7

+

6CCDD1596+

+

//CCDD1314

+7

+

8321%)

4828CD5+/CD117

+613.3.2710+

+3

1.87抗原表达强度变化或缺失

CCDD213/+CD117-0.73CD13-

//CCDD333

3

+

26.86+

217.CD34-

C/DH34LA-/DCRD-D/RC-+

16CD3+

-

D117

264.06305.5CD64C4D/CD381429.617283.83C/45

+

/-+-单核细胞+)跨阶段表达

+1185.47CDCD334D144+

/(

/CCD64+

CD117+

/CDD115

4

+

1042.4

4.201.8.09146

在表D7+/CD1中,急性髓系白血病常见异常免疫表型为

以成熟淋巴细117+和胞为C参D3照4+,/原C始D5+

细6胞。分其散点图见图别出现在图1。和图1B的Q2象限中,

为异常原始细胞,两者均为抗1A

注:

红色表示髓系原始细胞;绿色表示成熟淋巴细胞。图1 急性髓系白血病常见异常免疫表型

CD7+/CD117+及CD34+/CD56

+

.4 临床观察流式细胞术检测性而细 在胞形1年观察期内,

MRD阳态学阴性的患者复发率为的患者复发率为9.23%(18/26

);流式细胞术及细胞形态学均为阴性术检测MRD阳性病例15.63。

%(5/32),明显低于流式细胞.5 分子生物学结果比较 在上述173次测中有73次进行了流式细胞术、,其中APPMRD检LC2R融合基因检测,且初诊时两者均为阳性2例,非APL例。有具体分析见表65例2种检测结果一致,占2。有8例两者结果不一致的情况89.04%(65/7351

,)其

,中+/-组合1例为APL,-/+组合中APL。

7例均为表2 急性髓系白血病流式细胞术M(nR)

D和 结果患者符合例数比较PCR

流式细胞术++PCR

--

17

2

51

3 讨 急性白血 论

病恶性克隆细胞抗原的表达具有很大的异质性。急性髓系白血病的流式细胞术诊断有赖于原始细胞比例的明显增加和克隆性白血病细胞的

异常免疫表型特征作为依据[

10]

常骨髓髓系原始细胞和白血病细。胞本实验对比上的多种分免析疫正表型,以提高对原始细胞的分辨率,并发现不同于正常

04C123CC2623C·216·

,,,国际检验医学杂志2020年1月第41卷第2期 IntJLabMedJanuar020Vol.41No.2y2

细胞的肿瘤性原始细胞群,即免疫表型模式分析。

随着相关文献的报道,人们对各类抗原分子的认///特异的免疫标志物,在急性髓系白血病-M0M1M2

[11]

M4中均可表达。CD34亦可作为髓系原始细胞标记,但其表达范围不及C主要见于早期髓D117广泛,系原始细胞,并需注意排除B祖细胞干扰,当患者出

[]12现耐药时CD34表达水平升高。CD13、CD33、CD38在早期髓系原始细胞即可出现。CD15、CD64

识也在不断更新。CD117是急性髓系白血病相对较

15]

,与P效的独立预后指标[CR结果符合度为

这显示流式细胞术检测结果亦具有较高的89.04%,

预后较差,被证明是儿童急MRD阳性者复发率较高,

性髓系白血病在诱导和巩固治疗期间复发的一个有

/灵敏度。但A绝大多数APL除外,PL有PML

且异常免疫表型出现率低于非RARα融合基因异常,故应以PAPL患者,CR作为其MRD检测的首选方

法。同一种抗原采用不同颜色荧光标记的检测效率可能存在差异,但因本实验室采用的抗体荧光颜色相对固定,在此没有进一步探讨。本文选取的研究对象为四川大学华西医院就诊患者,由于实验对象的局限主要表达于较成熟的粒细胞和单核细胞,在早幼粒细胞和原幼单核细胞亦可部分表达,但在原始粒细胞中少见表达。于成熟单核CD细14是较特异的单核细胞标志物,

表达胞,亦存在极少量幼稚单核细胞。

D117少量表达于幼稚单核细胞[11]

单核细胞。于极早期的髓系原始细胞CD7的表达范围较广,

正常情况下可表达,

不表达于成熟,其表达程度随细胞发育逐渐减弱。液肿瘤及实体肿瘤中均可表达CD56抗原是一种神经细胞黏附分子,

在血[

13]

见到表达对于本研究关注的CD2、CD5或C3D1类抗原表达异常中9的髓系原始细胞。正常骨髓中。

难以,白血病

性原始细胞跨系表达是较常见的一种异常免疫表型特征。急性髓系白血病常见的跨系表达是胞的抗原标志CD7和B淋巴细胞抗原标T淋巴细志D56亦是急性髓系白血病常见的抗原标志,

但CD其19作。为跨系表达的意义不及生的正常原始粒细胞亦可见CD7和CD5C6D1表达9,因为化疗后增。白血病细胞另一异常特征是出现原始细胞抗原和后期较成熟细胞抗原共表达。本研究中最常见的与原始细胞抗原共表达的抗原标志CD15是急性髓系白血病中。D14与原始细胞标志共表达的发生率均较低。CD除此64、之外,白血病细胞抗原表达强度也可表现出与其发育阶段不相符合的情况。均可发生表达强度变化C。D而13、CD33、CD38、HLA-DR原始细胞亦为部分表达,故在CDM1R3D、CD检测时可能难以

33因为在正常明确区分少量原C始D细13胞/C。D3对3表达异常的白血病细胞和混杂的正常于抗原表达强度变化的正确判断还有赖于标本处理过程的一致性和仪器状态、参数设置的稳定性。

白血病细胞异常表达的抗原不仅在初发的白血病细胞中可以检测到,而且在治疗后达到形态学完全缓解时,残存的白血病细胞多数仍保留其初发时的抗原异常表达[14

]MRD的临床实,用这性保。证本了研流究结式果细显胞示术,

检选测择白合血适的病

免疫表型模式进行分析,可为临床急性髓系白血病病例提供较准确的,M流式细胞术RD检测结果。流式细胞术方法与细胞形态学相比明显提高,且检测结果与患者临MR床D检测结果阳性率进展相一致,流式

性,需要进一步扩大样本量和研究区域来验证本文实验结果。

4 结急性髓系 论

白血病具有明显不同于正常来源原始细胞的异常免疫表型特征,适合于采用流式细胞术进行白血病MRD检测。当残留的白血病细胞>5%时,骨髓细胞形态学和流式细胞术结果吻合度高,流式细胞术可以作为前者的补充;但当残留的白血病细胞5%时,使用流式细胞术M<

状RD检测方法具有较高的灵敏度,在考虑患者的经济况情况下,流式细胞术是检测度高(MARPD的重要手段。并且和分子生物学结果吻合

L患者除外),能更准确地反映体内白血病细胞负荷和病情变化,提示患者复发风险,指导临床治疗方案调整。参考文献

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](下转第220页)

CCC·220·

,,,国际检验医学杂志2020年1月第41卷第2期 IntJLabMedJanuar020Vol.41No.2y2

]15

。本研究发现了1例I测[G型抗-M引起的HDN。g

该系统抗体主要Duffy血型系统共有6个抗原,

,是通过输血或妊娠免疫产生,多数为抗少数为-Fay型,患儿血型O型的抗-Fa引起的HDN。y

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床症状较轻。本研究发现了1例母亲(血型BG3P3)不同性别和血型的HD对于可N检出率有差异,疑的HD应尽早进行检测,可以提高检出率。N患者,释放试验是诊断A一旦阳性即BO-HDN的金指标,可确诊。因本实验室只对非ABO-HDN合并直抗阳性者才做不规则抗体筛查检测,故在实际中如存在不规则抗体而直抗未呈阳性者,可能对其他血型系统引起的HD实验室应配N漏检。在条件允许的情况下,备多种谱细胞或用更灵敏的方法来检测抗体,在检测血型时就进行不规则抗体筛查,这样可以避免抗体漏检造成HD便于早期治疗,促进新生N类型诊断错误,儿康复。4 结 论

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()收稿日期:2019-06-22 修回日期:2019-10-21

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