３０２ 肝胆外科杂志２０１１年８月第１９卷第４期Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆＨｅｐａｔｏｂｉｌｉａｒｙ Ｓｕｒｇｅｒｙ，Ｖｏｌ，１９，Ｎｏ．４，Ａｕｇ．２０１１ ５－氮杂－２ －脱氧胞苷对ＨｅｐＧ２中ＳＬＩＴ２甲基化和 细胞恶性表型影响的实验研究 戴欣 ，耿小平 ，李晓明 ，朱立新 ，赵红川 ，刘付宝 ，王国斌 ，赵义军 ，黄帆 【摘要】 目的评估５一氮杂一２ 一脱氧胞苷（５－ａｚａ一２ｄｃ）对人肝癌细胞系ＨｅｐＧ２中抑癌基因ＳＬＩＴ２甲基化状态和细胞增殖、 迁移、侵袭和凋亡的影响，探讨ＳＬＩＴ２基因在肝癌中的作用及５－ａｚａ一２ｄｃ的体外抑制肝癌的效应。方法殖、迁移、侵袭、凋亡的变化。结果实验分为对照组和加 药组，分别应用ＭＳＰ、ＭＴｒ、划痕实验、侵袭实验、Ａｎｎｅｘｉｎ Ｖ—ＦＩＴＣ／ＰＩ双染实验检测细胞中ＳＬＩＴ２基因的甲基化状态和细胞的增 ５－ａｚａ一２ｄｅ处理后，ＨｅｐＧ２细胞株中ＳＬＩＴ２基因甲基化程度得到一定程度逆转，并呈现出剂 量依赖性；划痕实验４８ ｈ后，对照组肝癌细胞明显向划痕的迁移，而药物处理组肝癌细胞迁移受到抑制；侵袭实验２４ ｈ 后，加药组细胞的侵袭能力较对照组降低（Ｐ＜０．０５）；Ａｎｎｅｘｉｎ Ｖ．ＦＩＴＣ／ＰＩ双染实验显示加药组细胞凋亡率显著增加（Ｐ＜０． ０１）。结论５－ａｚａ一２ｄｃ对ＨｅｐＧ２细胞有抑制细胞增殖、促进凋亡及抑制细胞迁移和侵袭能力等作用，其中对抑制细胞迁移和 侵袭的作用可能是通过逆转ＳＩＬＴ２基因甲基化、恢复其表达来实现的。 【关键词】癌，肝细胞；５一氮杂－２ 一脱氧胞苷；ＳＬＩＴ２基因；甲基化；侵袭；凋亡 【中图分类号】Ｒ ７３５．７ 【文献标识码】Ａ 【文章编号】１００６－４７６１（２０１１）０４－０３０２－０４ ＥＦＦＥＣＴＳ ＯＦ ５－ＡＺＡ－２ＤＣ ＯＮ ＳＬＩＴ２ ＧＥＮＥ ＭＥ Ｉ’ＨＹＬＡ’Ｉ’ｌ０ Ｓｒｌ’Ａ Ｉ’ＵＳ ＡＮＤ ＭＡＬＩＧＮＡＮＴ ＰＨＥＮＯＴＹＰＥ ＯＮ ＨＥＰＡ ＩｌＵ－ ＭＡ ＨＥＰＧ２ ＣＥＬＬＳ（ＤＡＩ Ｘｉｎ ，ＧＥＮＧ Ｘｉａｏ－ｐｉｎｇ ，ＬＩ Ｘｉａｏ—ｍｉｎｇ ，ｅｔ ａ１． Ｊ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｆＧｅｏｎｅｒａｌ ｓｕｒｇｅｒｙ，Ｔｈｅ Ｆｉｒｓｔ Ａｆｌｉｆｌｉａｔｅｄ Ｈｏｓｐｉｔａｌ，Ａｎｈｕｉ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｈｅｆｅｉ ２３００２２；２．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ａｎａｔｏｍｉｃａｌ ａｎｄ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ，Ｔｈｅ Ｃｈｉｎｅｓｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｈｏｎｇ ，Ｈｏｎｇ 凡ｇ ９９９０７７） 【Ａｂｓｔｒａｃｔ】Ｏｂｊａｃｔｉｖｅ Ｔｏ ｅｖａｌｕａｔｅ ５－ａｚａ－２ｄｃ ｓ ｅｆｆｅｃｔ ｏｎ ＳＬＩＴ２ ｇｅｎｅ ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ ｓｔａｔｕｓ ａｎｄ ｃｅｌｌ ｇｒｏｗｔｈ，ｍｉｇｒａｔｉｏｎ，ｉｎｖａｓｉｏｎ ａｎｄ ａｐｏｐｔｏｓｉｓ ｏｎ ｈｅｐａｔｏｍａ ｃｅｌｌ ｌｉｎｅ ＨｅｐＧ２，ｅｘｐｌｏｒｅ ｔｈｅ ｐｏｓｓｉｂｌｅ ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ＳＬＩＴ２ ｇｅｎｅ ｉｎ ｈｅｐａｔｏｃａｒｃｉｎｏｍａ ａｎｄ ｔｈｅ ｄｅｐｒｅｓｓｉｏｎ ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ５－ａｚａ－２ｄｃ ｏｎ ｈｅｐａｔｏｃａｒｃｉｎｏｍａ ｉｎ ｖｉｔｒｏ．Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｔｗｏ ｇｒｏｕｐｓ ｗｅｒｅ ｄｅｓｉｇｎｅｄ ｉｎ ｔｈｉｓ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ：ｃｏｎｔｒｏｌ ａｎｄ ｄｒｕｇ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｇｒｏｕｐ． Ｔｈｅ ｃｈａｎｇｅｓ ｏｆ ５－ａｚａ一２ｄｃ ｏｎ ＳＬＩＴ２ ｇｅｎｅ ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ ｓｔａｔｕｓ ａｎｄ ｔｈｅ ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ，ｍｉｒａｔｇｉｏｎ，ｉｎｖａｓｉｏｎ ａｎｄ ａｐｏｐｔｏｓｉｓ ｏｆ ＨｅｐＧ２ ｃｅｌｌｓ ｗａｓ ｄｅｔｅｃｔｅｄ ｂｙ ＭＳＰ，ＭｑＴ，ｗｏｕｎｄ ｈｅａｌｉｎｇ ａｓｓａｙ，ｃｅｌｌ ｍｉｒａｔｇｉｏｎ ａｓｓａｙ ａｎｄ Ａｎｎｅｘｉｎ Ｖ—ＦＩＴＣ／ＰＩ ａｓｓａｙ，ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ．Ｒｅｓｕｌｔｓ Ａｆｔｅｒ ｔｒｅａ－ ｔｅｄ ｗｉｔｈ ５－ａｚａ－２ｄｃ．ｔｈｅ ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ ｓｔａｔｕｓ ｏｆ ＳＬＩＴ２ ｇｅｎｅ ｈａｄ ｂｅｅｎ ｒｅｖｅｒｓｅｄ ｔｏ ｓｏｍｅ ｅｘｔｅｎｔ ａｎｄ ｓｈｏｗｅｄ ａ ｄｏｓｅ—ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ：Ａｆｔｅｒ ４８ ｈ ｉｎ ｗｏｕｎｄ ｈｅａｌｉｎｇ ａｓｓａｙ，ｔｈｅ ｃｏｎｔｒｏｌ ｇｒｏｕｐ ｏｆ ＨＣＣ ｃｅｌｌｓ ｍｏｖｅｄ ｔｏ ｔｈｅ ｃｅｎｔｅｒ ｏｆ ｔｈｅ ｓｃｒａｔｃｈ，ａｎｄ ｄｒｕｇ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｇｒｏｕｐ ｗａｓ ｉｎｈｉｂｉｔｅｄ；Ａｆｔｅｒ ２４ ｈ ｉｎ ｃｅｌｌ ｍｉｇｒａｔｉｏｎ ａｓｓａｙ，ｄｒｕｇ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｇｒｏｕｐ ｏｆ ＨＣＣ ｃｅｌｌｓ ｉｎｖａｓｉｖｅ ａｂｉｌｉｔｙ ｗａｓ ｉｎｈｉｂｉｔｅｄ ｃｏｍｐａｒｉｎｇ ｗｉｔｈ ｃｏｎｔｒｏｌ ｇｒｏｕｐ（Ｐ＜ ０．０５）；Ｉｎ Ａｎｎｅｘｉｎ Ｖ—ＦＩＴＣ／ＰＩ ａｓｓａｙ，ｔｈｅ ｃｅｌｌ ａｐｏｐｔｏｓｉｓ ｒａｔｅｓ ｏｆ ｔｈｅ ｄｒｕｇ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｇｒｏｕｐ ｓｈｏｗｅｄ ａ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ ｉｎｃｒｅａｓｅ ｃｏｍｐａｒｉｎｇ ｗｉｔｈ ｃｏｎｔｒｏｌ ｒｏｕｐ（Ｐ＜０．０１）．Ｃｏｎｃｌｇｕｓｉｏｎ ５－ａｚａ一２ｄｃ ｃａｎ ｉｎｈｉｂｉｔ ｔｈｅ ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ，ｐｒｏｍｏｔｅ ｔｈｅ ａｐｏｐｔｏｓｉｓ ａｎｄ ｉｎｈｉｂｉｔ ｔｈｅ ｍｉｒｇａｔｉｏｎ ａｎｄ ｉｎｖａｓｉｏｎ ｏｆ ＨｅｐＧ２ ｃｅｌｌｓ ｉｎ ｖｉｔｒｏ，ｍｏｒｅｏｖｅｒ，ｔｈｅ ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｏｆ ｃｅｌｌ ｍｉｇｒａｔｉｏｎ ａｎｄ ｉｎｖａｓｉｏｎ ｍａｙ ｂｅ ａｃｃｏｍｐｌｉｓｈｅｄ ｂｙ ｒｅｖｅｒｓｅｄ ｔｈｅ ｍｅｔｈｙｌａ— ｔｉｏｎ ａｎｄ ｒｅｓｔｏｒｅｄ ｔｈｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ＳＬＩＴ２ ｇｅｎｅ． 【ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ】ｃａｒｃｉｎｏｍａ，ｈｅｐａｔｏｃｅｌｌｕｌａｒ；５－ａｚａ－２＇－ｄｅｏｘｙｃｙｔｉｄｉｎｅ；ＳＬＩＴ２ ｇｅｎｅ；Ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ；ｉｎｖａｓｉｏｎ；ａｐｏｐｔｏｓｉｓ 肝细胞癌（ＨＣＣ）是我国最常见的恶性肿瘤之一，其发生 发展是一个多步骤、多阶段相互作用的级联结果，涉及到多 在肝癌发生中起重要作用 Ｊ。以５一氮杂－２ 一脱氧胞苷（５一 ａｚａ．２ｄｃ）为代表的ＤＮＡ甲基转移酶抑制剂能通过去甲基化 作用使异常甲基化失活的抑癌基因重新表达并恢复抑癌功 能。本研究拟检测ＤＮＡ甲基转移酶抑制剂５－ａｚａ一２ｄｅ对人 肝癌细胞株ＨｅｐＧ２中ＳＬＩＴ２甲基化状态的影响和对肝癌细 胞株体外增殖、迁移、侵袭和凋亡的变化，探讨ＳＬＩＴ２基因在 肝癌中的作用，并为临床探索肝癌药物治疗新途径提供理论 基础。 种基因的异常改变，其中抑癌基因的异常甲基化失活被视为 ＨＣＣ发生的原因之一 。神经迁移蛋白ＳＬＩＴ是ＳＬＩＴ－ＲＯＢＯ 信号通路的组成部分，是神经系统发育过程中神经元轴 突定向生长的关键基因，其亚型ＳＬＩＴ２在非神经组织中也有 表达 Ｊ。本课题组前期研究发现ＳＬＩＴ２在肝癌细胞系 ＨｅｐＧ２中呈完全甲基化状态，提示该基因异常高甲基化失活 【基金项目】安徽省卫生厅医学科研重点课题（编号２０１０Ａ００９） 【作者单位】１．安徽医科大学第一附属医院普外科，合肥２３００２２ ２．中文大学医学院病理解剖及细胞学系 １材料与方法 １．１ 实验试剂和仪器 ５－ａｚａ一２ｄｃ（ｓｉｇｍａ公司），ＤＮＡ提取试剂盒（Ｑｉａｇｅｎ公 司），ＤＮＡ修饰试剂盒（Ｇｅｐｉｇｅｎｔｅｋ公司），Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ小室 肝胆外科杂志２０１１年８月第１９卷第４期Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆＨｅｐａｔｏｂｉｌｉａｒｙ Ｓｕｒｇｅｒｙ，Ｖｏｌ，１９，Ｎｏ．４，Ａｕｇ．２０１１ ３０３ （Ｃｏｍｉｎｇ公司），Ｍｅｔｒｉｇｅｌ基质胶（ＢＤ公司），Ａｎｎｅｘｉｎ Ｖ－ＦＩＴＣ 细胞凋亡检测试剂盒（Ｂｅｙｏｔｍｉｅ公司），ＳＬＩＴ２基因甲基化及 镜下拍照。 １．６ Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ侵袭小室实验检测ＨｅｐＧ２细胞的体外侵袭 力 非甲基化引物（上海生工），Ｃ０２培养箱（Ｈｅｒａｓ １５０，Ｇｅｒｍａ— ｎｙ），倒置相差显微镜（０ ｌｙｍｐｕｓ公司），Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ ５４１７Ｒ台 式高速冷冻离心机（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ，Ｇｅｒｍａｎｙ），ＰＣＲ仪（Ｂｉｏｍｅｔｒａ Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ小室基底膜包被Ｍａｔｒｉｇｅｌ基质胶，３７￣Ｃ过夜。 实验组ＨｅｐＧ２细胞予１０ｔｘｍｏｌ／Ｌ的５－ａｚａ－２ｄｃ作用２４ｈ，分别 以１．０×１０５个／孔将实验组和对照组细胞接种于Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ 小室上室内，并加入含０．１％ＢＳＡ的无血清培养液至２００１Ａ， 下室内加入７５０１ｘＬ含１０％胎牛血清培养液，３７℃培养箱孵 Ｔｇｒａｎｄｉｅｎｔ，Ｇｅｒｍａｎｙ），凝胶成像系统（Ｔａｎｏｎ ＧＩＳ－２０１０，Ｃｈｉ— ｌｑａ），酶标仪（ＥＬＸ一８００，ＢｉｏＴｅｋ公司），流式细胞仪（Ｅｐｉｃｓ ＸＬ—ＭＣＬ，Ｃｏｕｈｅｒ公司）。 １．２细胞培养及传代 育２４ｈ，棉签擦净小室底部微孔滤膜上层的细胞，结晶紫染 色２０ｍｉｎ，１０×２０倍倒置显微镜下随机计数５个视野的细胞 人肝癌细胞株ＨｅｐＧ２由中文大学医学院病理解剖 及细胞学系惠赠，细胞在含１０％胎牛血清的完全型高糖 ＤＭＥＭ培养液中，于３７￣Ｃ、５％ＣＯ 的恒温培养箱内培养，４— ５ １３消化传代１次。实验细胞处于对数生长期，活细胞数达 ９５％一１００％。 １．３甲基化特异性ＰＣＲ检测ＳＬＩＴ２甲基化 按基因组ＤＮＡ提试剂盒的操作步骤提取５－ａｚａ－２ｄｃ处 理前及浓度５ ｉ￣ｍｏｌ／Ｌ、１０￣ｍｏｌ／Ｌ的５－ａｚａ．２ｄｃ处理７２ ｈ后 ＨｅｐＧ２细胞中的ＤＮＡ，按ＤＮＡ修饰试剂盒步骤修饰ＤＮＡ后 进行ＰＣＲ扩增，扩增条件为９５￣（２ １０ ｍｉｎ，９５￣Ｃ １ ｍｉｎ，６８￣Ｃ １ ｍｉｎ，７２￣Ｃ１ ｍｉｎ，共４５个循环，７２￣Ｃ１０ ｍｉｎ，４￣Ｃ停止。用等量 灭菌双蒸水代替模板ＤＮＡ作阴性对照，以提取的人正常肝 脏组织（肝移植供肝组织）ＤＮＡ为模板作阳性对照。ＳＬＩＴ２ 引物序列为：甲基化上游引物为：５ －ｃＧＧ 兀ＴＡＧＧｒＩ＇Ｉ’ＧｃＧ－ ＧＣＧＧＡＧＴＣＧＡＧＧＧＣ－３ ，甲基化下游引物为：５ 一 ＣＧＣＧＡＡＡＡＣＣＣＡＡＣＧＡＡＣＣＣＧＴＡＡＣＡＡＡＡＣＧＣＧ－－３，扩增产 物长度１６０ ｂｐ；非甲基化上游引物为：５ 一ＴＧＧＴＩＴＡＧＧＴＩ＇ＧＴ— ＧＧＴＧＧＡＧＴｒＧＡＧＧＧＴ一３，非甲基化下游引物为：５ ＣＡ— ＣＡＡＡＡＡＣＣＣＡＡＣＡＡＡＣＣＣＡＴＡＡＣＡＡＡＡＣＡＣＡ一３ ，扩增产物 长度１６０ ｂｐ。ＰＣＲ产物经３％琼脂糖凝胶电泳后在凝胶成 像系统下拍照分析。 １．４ Ｍ１Ｔｒ法检测ＨｅｐＧ２细胞的增殖率 取对数生长期的ＨｅｐＧ２细胞，以５×１０３个／孔接种于 ９６孔培养板，实验设空白对照组、细胞对照组、溶剂对照组 和实验组，每组设４个复孔。细胞贴壁后，实验组中加入不 同浓度５－ａｚａ－２ｄｃ，使其终浓度分别为１￣ｍｏｌ／Ｌ、２．５ｔｘｍｏｌ／Ｌ、 ５￣ｔｍｏｌ／Ｌ、７．５ＩｘｍｏｌｆＬ、１０１￣ｍｏｌｆＬ、１５￣ｍｏｌ／Ｌ、２０１￣ｍｏｌ／Ｌ，分别 培养２４ｈ、４８ｈ、７２ｈ，各孔加入５ｍｇ／ｍｌ Ｍ１Ｔｒ ２０１ｘＬ，继续培养 ４ｈ，在酶标仪６３０ｎｍ波长下检测各孔的吸光度值（Ａ６３０ 值）。各组实验重复３次，按下列公式计算细胞增殖抑制率： 增殖抑制率＝（细胞对照组Ａ６３０值一实验组Ａ６３０值）／对 照组Ａ６３０值×１００％。 １．５划痕损伤实验检测ＨｅｐＧ２细胞的体外迁移力 取对数生长期的ＨｅｐＧ２细胞，以１×１０５个／孔接种于６ 孔培养板培养，待细胞生长面积达９０％时，用２００１￣Ｌ头于 培养板底细胞生长面作划痕，形成宽度约为５００１ｘｍ的无细 胞划痕区，ＰＢＳ洗除游离细胞，无血清培养液继续培养，细胞 对照孔不加药物，实验孔加入５－ａｚａ－２ｄｃ使其终浓度为 １０１￣ｍｏｌ／Ｌ。按Ｏｈ、１２ｈ、２４ｈ时间间隔于１０×１０倍倒置显微 个数，实验重复４次，ＳＰＳＳ１７．０统计分析两组细胞个数间的 差异。 １．７ Ａｎｎｅｘｉｎ Ｖ．Ｆ１ＴＣ／ＰＩ双染法检测ＨｅｐＧ２细胞凋亡 实验组加入５－ａｚａ一２ｄｃ使其终浓度为ｌＯｔｚｍｏｌ／Ｌ作用７２ｈ 后，收集１—５×１０ 个５－ａｚａ一２ｄｅ细胞，加入５００ ｔｒｌ结合缓冲 液悬浮细胞，加入５１ｘｌ Ａｎｎｅｘｉｎ Ｖ—ＦＩＴＣ混匀后室温避光反应 １５ｍｉｎ，再加入５１ｘＬ ＰＩ混匀，１ ｈ内进行流式细胞仪检测，重 复４次。检测结果的判定：荧光染色中正常细胞Ａｎｎｅｘｉｎ Ｖ— ＦＩＴＣ（一）、ＰＩ（一）；早期凋亡细胞Ａｎｎｅｘｉｎ Ｖ—ＦＩＴＣ（＋）、ＰＩ （一）；晚期凋亡细胞Ａｎｎｅｘｉｎ Ｖ—ＦＩＴＣ（＋）、ＰＩ（＋）；死亡细 胞Ａｎｎｅｘｉｎ Ｖ—ＦＩＴＣ（一）、ＰＩ（＋）。 １．８统计学分析 所有数据采用ＳＰＳＳ１７．０进行统计学分析，组问均数比 较采用ｔ检验，样本问率比较采用ｘ 检验，结果中定量数据 用 ±ｓ表示，Ｐ＜０．０５为差异有显著性。 ２结果 ２．１ ５－ａｚａ－２ｄｃ对ＨｅｐＧ２细胞ＳＬＩＴ２甲基化状态的影响 ＭＳＰ检测结果如图１所示：５－ａｚａ一２ｄｅ处理组细胞呈完全 甲基化状态，经过５Ｉｘｍｏｌ／Ｌ、ｌＯ￣ｍｏｌ／Ｌ的５－ａｚａ一２ｄｃ作用，未 甲基化的条带明显增强。说明ＨｅｐＧ２细胞ＳＬＩＴ２基因启动 子存在异常甲基化，而在经过５－ａｚａ－２ｄｃ去甲基化处理后，该 基因甲基化得到了一定程度的逆转，并且去甲基化的程度与 用药的剂量呈正相关。 塑些翌墨 ！！ ！ 竺！！ 里丝翌璺 生翌璺 Ｍａｒｋ Ｍ Ｕ Ｍ Ｕ Ｍ Ｕ Ｍ Ｕ Ｍ Ｕ ２００ｂｐ １５０ｂｐ １００ｂｐ ５０ ｂｐ 图１ ５－ａｚａ－２ｄｃ对ＨｅｐＧ２细胞ＳＬＩＴ２甲基化状态的影响 Ｕ；非甲基化产物；Ｍ；甲基化产物 ２．２ ５－ａｚａ－２ｄｃ对ＨｅｐＧ２细胞增殖的影响 ＭＴＴ比色法的结果见表１，经方差分析同一时间的不同 ５－ａｚａ－２ｄｃ药物浓度组之间的细胞增殖抑制率差异有显著性 （尸＜０．０５）；同一５－ａｚａ－２ｄｃ药物浓度的不同作用时间组之 间的细胞增殖抑制率差异亦有显著性（Ｐ＜０．０５），说明在 一定范围内随着剂量的增高和作用时间的延长，对ＨｅｐＧ２ 细胞增殖的抑制作用均增强。但观察各项抑制率均未达到 ５Ｏ％ ３０４ 肝胆外科杂志２０１１年８月第１９卷第４期Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆＨｅｐａｔｏｂｉｌｉａｒｙ Ｓｕｒｇｅｒｙ，Ｖｏｌ，１９，Ｎｏ．４，Ａｕｇ．２０１１ ２．３ ５－ａｚａ一２ｄｃ对ＨｅｐＧ２细胞迁移的影响 划痕实验后连续观察了４８ ｈ，两组细胞均出现向划痕中 】 央迁移的趋势，但实验组细胞迁移的效率明显弱于对照组细 胞，如图２所示，说明５－ａｚａ一２ｄｃ处理后，ＨｅｐＧ２细胞的迁移能 ∥ ’ 。力受到一定程度抑制。 ０ｈ 一一 ４８ ｈ 一一 对照组 药物组 图２ ５－ａｚａ－２ｄｃ对ＨｅｐＧ２细胞迁移的影响（１０×１０倍） ２．４ ５－ａｚａ一２ｄｃ对ＨｅｐＧ２细胞侵袭的影响 肝癌细胞侵袭２４ｈ后，对照组和实验组ＨｅｐＧ２细胞均向 基底膜下侵袭。在１０×２０倍光镜下，可见聚碳酸酯膜上实 验组ＨｅｐＧ２细胞较对照组显著减少，如图３所示。ＨｅｐＧ２细 胞从５６．０个／２００倍视野降到３２．０／￣／２００倍视野，差异具有 统计学意义（Ｐ＜０．０５）。说明５－ａｚａ－２ｄｅ处理后，肝癌细胞的 侵袭、浸润能力受到明显的抑制。 一一 对照组 药物组 图３ ５－ａｚａ－２ｄｃ对ＨｅｐＧ２细胞侵袭的影响（１０×２０倍） ２．５ ５－ａｚａ一２ｄｃ对ＨｅｐＧ２细胞凋亡的影响 ｌＯｌ￣ｍｏｌ／Ｌ ５－ａｚａ一２ｄｃ处理肝癌细胞株ＨｅｐＧ２ ３天后，与 对照组细胞相比，药物处理组肝癌细胞的凋亡百分比显著增 加（图４），差异具有统计学意义（Ｐ＜０．０１）。 ３讨论 ＳＬＩＴ－ＲＯＢＯ是神经系统发育过程中导向轴突生长和神 瀚 对照组 药物组 图４ ５－ａｚａ－２ｄｃ对ＨｅｐＧ２细胞凋亡的影响 １：机械损伤细胞；２：晚期凋亡和坏死细胞；３：正常细胞；４：早期 凋亡细胞 经元迁移的关键信号，ＳＬＩＴ２是ＳＬＩＴ家族的一个亚型，定位 于染色体４ｐ１５．２，ＳＬＩＴ２在多种非神经组织中也有表达 Ｊ。 研究发现ＳＬＩＴ２在包括肝癌在内的多种人类肿瘤组织中呈 现高甲基化失活状态 ，Ｚｈｅｎｇ等 对９种肝癌细胞株研究 发现ＳＬＩＴ２基因启动子区均发生甲基化修饰，同时ＳＬＩＴ２基 因的表达程度随着细胞株转移潜能的增加呈下降趋势，推测 ＳＬＩＴ２的异常高甲基化可能参与了肝癌的发生过程，并且与 肝癌细胞的侵袭和转移能力存在因果关系。Ｐｒａｓａｄ 等在乳 腺癌中首先发现了ＳＬＩＴ２一ＲＯＢＯ１信号抑制肿瘤细胞侵袭和 转移的效应，提示ＳＬＩＴ２在抑制肿瘤活性方面扮演重要角 色，而肝癌中ＳＬＩＴ２的作用的研究尚未见报道。 ５－ａｚａ一２ｄｃ是一种脱甲基化试剂，主要通过抑制ＤＮＡ甲 基转移酶Ｉ（ＤＮＭＴ Ｉ）的甲基转移活性，实现去甲基化功 能 。目前，去甲基化治疗已成为一种新的抑制细胞增殖和 诱导细胞分化的肿瘤治疗方法，在恶性肿瘤治疗中具有良好 的应用前景。国外已有大量应用甲基转移酶抑制剂来治疗 急性髓系白血病、骨髓增生异常综合征和慢性粒细胞白病的 报道 ，并取得了较好疗效，已被美国ＦＤＡ批准用于骨髓增 生异常综合症的治疗。然而，５－ａｚａ一２ｄｃ等甲基转移酶抑制剂 在实体瘤中的作用机制尚不完全明了。因此研究药物逆转 肝癌ＳＬＩＴ２甲基化，恢复ＳＬＩＴ２表达活性，探索ＳＬＩＴ２抑癌效 应成为本研究的主要目的。 结果显示，经过５－ａｚａ一２ｄｃ处理后，ＳＬＩＴ２基因甲基化得 到了一定程度的逆转，并且去甲基化的程度与用药的剂量呈 现一定正相关关系。在划痕实验和侵袭实验中，经５－ａｚａ－２ｄｃ 处理后，ＨｅｐＧ２细胞的迁移和侵袭能力均明显受到抑制，提 示ＨｅｐＧ２细胞的恶性表型减低，其原因可能与ＳＬＩＴ２恢复表 达，通过ＳＬＩＴ２－ＲＯＢＯ１信号发挥抑制肿瘤细胞运动和迁移活 性有关。ＭＴＩ＂实验提示５－ａｚａ一２ｄｃ对ＨｅｐＧ２细胞的增殖抑制 效应具有一定的浓度依赖和时间依赖性，但各组抑制率均＜ ５０％。通过Ａｎｎｅｘｉｎ Ｖ—ＦＩＴＣ／ＰＩ双染法检测ＨｅｐＧ２细胞凋 亡，我们发现５－ａｚａ－２ｄｃ处理后细胞凋亡比例显著增加，但坏 肝胆外科杂志２０１１年８月第１９卷第４期Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆＨｅｐａｔｏｂｉｌｉａｒｙ Ｓｕｒｇｅｒｙ，Ｖｏｌ，１９，Ｎｏ．４，Ａｕｇ．２０１１ ６郑３０５ 死细胞数并未明显增加，因此，５－ａｚａ－２ｄｃ抑制细胞生长并非 丹，刘彬彬，刘银坤，等．人肝癌细胞系Ｓｌｉｔ／Ｒｏｂｏ启动子甲 完全通过５－ａｚａ一２ｄｃ的细胞毒性效应发生作用，而极可能通 过改变细胞周期、促进凋亡的途径来实现其抑制肿瘤细胞生 长的作用。 通过本实验，我们认为ＳＬＩＴ２基因在肝癌细胞中通过抑 制细胞侵袭和迁移发挥抑癌效应，同时５－ａｚａ一２ｄｅ治疗可以 引起肝癌细胞的增殖能力抑制，倍增时间延长，凋亡比例增 基化状态及基因表达的研究．中华肝脏病杂志，２００９，１７（３）：１９８ —２０２． ７ Ｐｒａｓａｄ Ａ，Ｆｅｍａｎｄｉｓ ＡＺ，Ｒａｏ Ｙ，ｅｔ １．Ｓｌａｉｔ ｐｒｏｔｅｉｎ—ｍｅｄｉａｔｅｄ ｉｎｈｉｂｉ— ｔｉｏｎ ｏｆ ＣＸＣＲ４・ｉｎｄｕｃｅｄ ｅｈｅｍｏｔａｅｔｉｅ ａｎｄ ｅｈｅｍｏｉｎｖａｓｉｖｅ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ｐａｔｈ－－ ｗａｙｓ ｉｎ ｂｒｅａｓｔ ｃａｎｃｅｒ ｃｅｌｌｓ．Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ，２００４，２７９（１Ｏ）：９１１５— ２４． 加。文献报道５－ａｚａ一２ｄｃ对正常的成纤维细胞或上皮细胞没 有明显影响” ，长期低剂量地使用５－ａｚａ－２ｄｃ已被报道可以 ８ Ｇｈｏｓｈａｌ Ｋ，Ｄａｔｔａ Ｊ，Ｍａｊｕｍｄｅｒ Ｓ，ｅｔ ａ１．５－Ａｚａ—ｄｅｏｘｙｃｙｔｉｄｉｎｅ ｉｎｄｕｃｅｓ ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ ｏｆ ＤＮＡ ｍｅｔｈｙｈｒａｎｓｆｅｒａｓｅ １ ｂｙ ａ ｐｒｏｔｅａｓｏｍａｌ ｐａｔｈｗａｙ ｔｈａｔ ｒｅｑｕｉｒｅｓ ｔｈｅ ＫＥＮ ｂｏｘ，ｂｒｏｍｏ－ａｄｊａｃｅｎｔ ｈｏｍｏｌｏｇｙ ｄｏ－ 有效地降低小鼠模型中结肠息肉的发生及化学物诱导的肺 癌的发生¨ 。因此，以ＳＬＩＴ２为靶点，对肝癌进行５＇ａｚａ． ｍａｉｎ，ａｎｄ ｎｕｃｌｅａｒ ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ ｓｉｇｎａ１．Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ，２００５，２５（１１）： ４７２７—４１． ２ｄｃ去甲基化治疗在肝癌的基础研究和临床治疗方面具有深 远的价值。 ９ Ｐｌｉｍａｃｋ ＥＲ，Ｋａｎｔａｒｊｉａｎ ＨＭ，Ｉｓｓａ ＪＰ．Ｄｅｃｉｔａｂｉｎｅ ａｎｄ ｉｔｓ ｒｏｌｅ ｉｎ ｔｈｅ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｏｆ ｂｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ ｍａｌｉｇｎａｎｃｉｅｓ．Ｌｅｕｋ Ｌｙｍｐｈｏｍａ，２００７，４８ 参考文献： １ Ｓｃｅｕｓｉ ＥＬ，Ｌｏｏｓｅ ＤＳ，Ｗｒａｙ ＣＪ．Ｃｌｉｎｉｃａｌ ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｏｆ ＤＮＡ ｍｅｔｈｙｌ— （８）：１４７２—８１． １０ Ｓｃｈｍｅｌｚ Ｋ，Ｓａｔｔｌｅｒ Ｎ，Ｗａｇｎｅｒ Ｍ，ｅｔ ａ１．Ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｔｉｏｎ ｉｎ ｈｅｐａｔｏｅｅｌｌｕｌａｒ ｃａｒｃｉｎｏｍａ．ＨＰＢ（Ｏｘｆｏｒｄ），２０１ １，１３（６）： ３６９—７６． ｂｙ ５－Ａｚａ－２＇－ｄｅｏｘｙｃｙｔｉｄｉｎｅ ｉｎ ａｃｕｔｅ ｍｙｅｌｏｉｄ ｌｅｕｋｅｍｉａ（ＡＭＬ）ａｎｄ ｍｙ— ｅｌｏｄｙｓｐｌａｓｔｉｃ ｓｙｎｄｒｏｍｅ（ＭＤＳ）ｂｕｔ ｎｏｔ ｅｐｉｔｈｅｌｉｌａ ｃｅｌｌｓ ｂｙ ＤＮＡ—ｍｅｔｈｙ— ｌａｔｉｏｎ—ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ａｎｄ—ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ．Ｌｅｕｋｅｍｉａ，２００５，１９ ２ Ｓｅｅｇｅｒ Ｍ，Ｔｅａｒ Ｇ，Ｆｅｒｒｅｓ－Ｍａｒｃｏ Ｄ，ｅｔ ａ１．Ｍｕｔａｔｉｏｎｓ ａｆｆｅｃｔｉｎｇ ｇｒｏｗｔｈ ｃｏｎｅ ｇｕｉｄａｎｃｅ ｉｎ Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ：ｇｅｎｅｓ ｎｅｃｅｓｓａｒｙ ｆｏｒ ｇｕｉｄａｎｃｅ ｔｏｗａｒｄ ｏｒ （１）：１０３—１１１． １ｌ Ｌａｉｒｄ ＰＷ，Ｊａｃｋｓｏｎ—Ｇｒｕｓｂｙ Ｌ，Ｆａｚｅｌｉ Ａ，ｅｔ ａ１．Ｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｉｎｔｅｓｔｉ— ａｗａｙ ｆｒｏｍ ｔｈｅ ｍｉｄｌｉｎｅ．Ｎｅｕｒｏｎ，１９９３，１０（３）：４０９—２６． ３李培坤，耿小平，朱立新，等．肝癌细胞系中ＳＬＩＴ２、ＤＡＰＫ、ＲＩＺ１、 ＣＨＦＲ、ＥＤＮＲＢ、３－ＯＳＴ－２基因甲基化状态．安徽医科大学学报， ２０１１，（０５）：４１２—４１５． ４ Ｋａｔｏｈ Ｙ，Ｋａｔｏｈ Ｍ．Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ ｇｅｎｏｍｉｃｓ ｏｎ ＳＬＩＴＩ，ＳＬＩＴ２，ａｎｄ ｎａｌ ｎｅｏｐｌａｓｉａ ｂｙ ＤＮＡ ｈｙｐｏｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ．Ｃｅｌｌ，１９９５，８１（２）：１９７— ２０５． １２ Ｌａｎｔｒｙ ＬＥ，Ｚｈａｎｇ Ｚ，Ｃｒｉｓｔ ＫＡ，ｅｔ ａ１．５－Ａｚａ－２＇－ｄｅｏｘｙｃｙｔｉｄｉｎｅ ｉｓ ｅｈｅ— ｍｏｐｒｅｖｅｎｔｉｖｅ ｉｎ ａ ４一（ｍｅｔｈｙｌ—ｎｉｔｒｏｓａｍｉｎｏ）一１－（３－ｐｙｒｉｄｙ１）－１－ｂｕｔａｎｏｎｅ— ｉｎｄｕｃｅｄ ｐｒｉｍａｒｙ ｍｏｕｓｅ ｌｕｎｇ ｔｕｍｏｒ ｍｏｄｅ１．Ｃａｒｃｉｎｏｇｅｎｅｓｉｓ，１９９９，２０ ＳＬＩＴ３ ｏｒｔｈｏｌｏｇｓ．Ｏｎｃｏｌ Ｒｅｐ，２００５，１４（５）：１３５１—１３５５． ５董桂银，钱叶本，耿小平，等．肝细胞癌中ＳＬＩＴ２基因甲基化状 态研究．肝胆外科杂志，２００６，（０１）：６２—６５． （２）：３４３—６． （本文编辑钱叶本） （上接第３０１页） ９ Ｋｉｍ ＪＨ，Ｌｅｅ ＳＣ，Ｒｏ Ｊ，ｅｔ ａ１．Ｊｎｋ ｓｉｎａｇｌｉｎｇ ｐａｔｈｗａｙ—ｍｅｄｉａｔｅｄ ｒｅｇｕ— ｌａｔｉｏｎ ｏｆ Ｓｔａｔ３ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｉｓ ｌｉｎｋｅｄ ｔｏ ｔｈｅ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ ｄｏｘｏｒｕｂｉｃｉｎ ２９０—３ｏｏ． １３ Ｔｙａ Ａ，Ｓｉｎｇｈ ＲＰ，Ｒａｍａｓａｍｙ Ｋ，ｅｔ ａ１．Ｇｒｏｗｔｈ ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ａｎｄ ｒｅ— ｒｅｓｓｉｇｏｎ ｏｆ ｌｕｎｇ ｔｕｍｏｒｓ ｂｙ ｓｉｌｉｂｉｎｉｎ：ｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ ｂｙ ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ－－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｅｙｔｏｋｉｎｅｓ ａｎｄ ｎｕｃｌｅａｒ ｆａｃｔｏｒ・・ｋａｐｐａＢ ａｎｄ ｓｉｎａｌｇ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｉｎ ｃａｎｃｅｒ ｃｅｌｌ ｌｉｎｅｓ．Ｂｉｏｅｈｅｍ Ｐｈａｒｍａｅｏｌ，２０１０，７９（３）：３７３ ８Ｏ． １０ Ｓｈａｒｅｅｆ ＭＭ，Ｂｒｏｗｎ Ｂ，Ｓｈａｊａｈａｎ Ｓ，ｅｔ ａ１．Ｌａｃｋ ｏｆ Ｐ－ｇｌｙｅｏｐｒｏｔｅｉｎ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｂｙ ｌｏｗ．ｄｏｓｅ ｆｒａｅｔｉｏｎａｔｅｄ ｒａｄｉａｔｉｏｎ ｒｅｓｕｌｔｓ ｆｒｏｍ ｌＯＳ８ ｏｆ ｎｕ． ｃｌｅａｒ ｆａｃｔｏｒ・ｋａｐｐａＢ ａｎｄ ＮＦ—Ｙ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｉｎ ｏｒａｌ ｃａｒｃｉｎｏｍａ ｃｅｌｌｓ．Ｍｏｌ ｔｒａｎｓｄｕｃｅｒｓ ａｎｄ ａｃｔｉｖａｔｏｒｓ ｏｆ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ３．Ｃａｎｃｅｒ Ｐｒｅｖ Ｒｅｓ（Ｐｈｉｌａ Ｐａ），２００９，２（１）：７４—８３． １４ Ｗａｎｇ Ｆ，Ｋａｕｒ Ｓ，Ｃａｖｉｎ ＬＧ，ｅｔ ａ１．Ｎｕｃｌｅａｒ—ｆａｃｔｏｒ—ｋａｐｐａＢ（ＮＦ—ｋａｐ・ ｐａＢ）ａｎｄ ｒａｄｉｃａｌ ｏｘｙｇｅｎ ｓｐｅｃｉｅｓ ｐｌａｙ ｃｏｎｔｒａｒｙ ｒｏｌｅｓ ｉｎ ｔｒｎｓａｆｏｒｍｉｎｇ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ—ｂｅｔａ１（ＴＧＦ・ｂｅｔａ１）一ｉｎｄｕｃｅｄ ａｐｏｐｔｏｓｉｓ ｉｎ ｈｅｐａｔｏｃｅｌｌｕｌａｒ ｃａｒｃｉｎｏｍａ（ＨＣＣ）ｃｅｌｌｓ．Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｒｅｓ Ｃｏｍｍｕｎ，２００８，３７７ （４）：１１０７—１２． １５ Ｃｈｏｕ ＴＣ．Ｄｒｕｇ ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ ｓｔｕｄｉｅｓ ａｎｄ ｔｈｅｉｒ ｓｙｎｅｒｇｙ ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ，２００８，６（１）：８９—９８． １ １ Ｂｉｌｙｅｕ ＪＤ，Ｐａｎｔａ ＧＲ，Ｃａｖｉｎ ＬＧ，ｅｔ ａ１．Ｃｉｒｃｕｍｖｅｎｔｉｏｎ ｏｆ ｎｕｃｌｅａｒ ｆａｃ— ｔｏｒ ｋａｐｐａＢ ｉｎｄｕｃｅｄ ｃｈｅｍｏｒｅｓｉｓｔａｎｅｅ ｂｙｃｙｔｏｐｌａｓｍｉｃ—ｔａｒｇｅｔｅｄ ａｕｔｈｒａｃｙ— ｃｌｉｎｅｓ．Ｍｏｌ Ｐｈａｒｍａｅｏｌ，２００４，５（４）：１０３８—４７． １２ Ｌａｍｐｉａｓｉ Ｎ，Ａｚｚｏｌｉｎａ Ａ，Ｄ￣Ａ＿ｌｅｓｓｎｄｒａｏ Ｎ，ｅｔ ａ１．Ａｎｔｉｔｕｍｏｒ ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｄｅｈｙｄｒｏｘｙｍｅｔｈｙｌｅｐｏｘｙｑｕｉｎｏｍｉｃｉｎ，ａ ｎｏｖｅｌ ｎｕｃｌｅａｒ ｆａｃｔｏｒ—ｋａｐｐａＢ ｉｎ— ｈｉｂｉｔｏｒ，ｉｎ ｈｕｍａｎ ｌｉｖｅｒ ｃａｎｃｅｒ ｃｅｌｌｓ ａｒｅ ｍｅｄｉａｔｅｄ ｔｈｒｏｕｇｈ ａ ｒｅａｃｔｉｖｅ ｕｓｉｎｇ ｔｈｅＣｈｏｕ－Ｔａｌａｌａｙ ｍｅｔｈｏｄ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ，２０１０，７０（２）：４４０—６． （本文编辑朱立新） ｏｘｙｇｅｎ ｓｐｅｃｉｅｓ—ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｍｅｃｈａｎｉｓｍ．Ｍｏｌ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ，２００９，７６（２）：
