１ ‘ 中国抗生素杂志２０１Ｏ年９月第３５卷第９期 Ｓ１ 文章编号：１００１．８６８９（２０１０）０９—００Ｓ１—０５ 肺炎支原体的耐药情况及其对阿奇霉素耐药机制的研究 潘明安张天托 朱家馨黄静刘慧 （中山大学附属第三医院呼吸内科，广州５１０６３０） 摘要：目的了解我院社区呼吸道感染肺炎支原体（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ，Ｍｐ）感染状况及耐药机制。方法收集２００７年８ 月￣ｊ２００８年３月我院社区获得性呼吸道感染病人的咽拭子、痰标本，分离培养Ｍｐ，检测对红霉素、阿奇霉素、环丙沙星、洛美 沙星、氯霉素的药物敏感性，筛选阿奇霉素的耐药株，检测阿奇霉素耐药株的作用靶位２３Ｓ ｒＲＮＡ Ｖ区基因、２３Ｓ ｒＲＮＡ ＩＩ区基 因、ｔｐ／Ｄ基因及 ， 因的耐药基因变异位点。结果入选者共４９３例，Ｍｐ培养阳性者４株。其中耐红霉素和阿奇霉素２株，耐环 丙沙星和洛美沙星３株，４株临床株对氯霉素均敏感。耐阿奇霉素株在２３Ｓ ｒＲＮＡ的Ｖ区基因的２０６３位发生Ａ￣ｒｊＧ点突变。结论我 院存在对大环内酯类和喹诺酮类抗生素耐药的Ｍｐ菌株，并且有多重耐药的现象。Ｍｐ对阿奇霉素耐药的机制可能与２３Ｓ ｒＲＮＡ Ｖ 区基因的点突变相关，与２３Ｓ ｒＲＮＡ ＩＩ区基因、ｒｐ／Ｄ基因、 ，堪因是否相关尚不能肯定。 关键词：肺炎支原体；阿奇霉素；耐药 中图分类号：Ｒ３７８ 文献标识码：Ａ Ｔｈｅ ｓｔｕｄｙ ｏｆ ｄｒｕｇ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ａｎｄ ｍｅｃｈａｎｉｓｍ ｏｆ ａｚｉｔｈｒｏｍｙｃｉｎ ｆｏｒ Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ Ｐａｎ Ｍｉｎｇ·ａｎ，Ｚｈａｎｇ Ｔｉａｎ·ｔｕｏ，Ｚｈｕ Ｊｉａ—ｘｉｎ，Ｈｕａｎｇ Ｊｉｎｇ ａｎｄ Ｌｉｕ Ｈｕｉ （Ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆｔｈｅ ＴｈｉｒｄＡｆｉｌｆｉａｔｅｄ Ｈｏｓｐｉｔａｌ ｏｆＳｕｎ Ｙａｔ－ｓｅｎ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｇｕａｎｇｚｈｏｕ ５１０６３０） Ａｂｓｔｒａｃｔ ０ｈｊｅｃｔｉｖｅｓ Ｔｈｉｓ ｓｔｕｄｙ ｗａｓ ｔｏ ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅ ｔｈｅ ｄｒｕｇ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｓｉｕａｔｉｔｏｎ ｏｆ Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｐｎｅｕｍｏｎ （Ｍｐ）１ｎｆｅｃｔｅｄ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ ｃｏｍｍｕｎｉｔｙ—ａｃｑｕｉｒｅｄ ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ ｔｒａｃｔ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ｉｎ ｏｕｒ ｈｏｓｐｉｔａｌ ａｎｄ ｔｈｅ ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ ｏｆ ｄｒｕｇ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ．Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｗｅ ｃｏｌｌｅｃｔｅｄ ｔｈｅ ｔｈｒｏａｔ ｓｗａｂｓ ａｎｄ ｓｐｕｔｕｍ ｓａｍｐｌｅｓ ｆｒｏｍ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ ｃｏｍｍｕｎｉｔｙ．ａｃｑｕｉｒｅｄ ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ ｔｒａｃｔ １ｎｆｅｃｔｉｏｎ ｉｎ ｏｕｒ ｈｏｓｐｉｔａｌ ｆｒｏｍ Ａｕｇｕｓｔ，２００７ ｔｏ Ｍａｒｃｈ２００８．Ｔｈｅｎ ｗｅ ｉｓｏｌａｔｅｄ ａｎｄ ｃｕｌｔｕｒｅｄ Ｍｐ ｔｏ ｔｅｓｔ ，ｔｈｅｉｒ ｄｒｕｇ ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｉｅｓ ｔｏ ｅｒｙｔｈｒｏｍｙｃｉｎ，ａｚｉｔｈｒｏｍｙｃｉｎ，ｃｉｐｒｏｆｌｏｘａｃｉｎ，ｌｏｍｅｆｌｏｘａｃｉｎ ａｎｄ ｃｈｌｏｒａｍｐｈｅｎｉｃｏ１Ｗｅ ｓｃｒｅｅｎｅｄ ．ｓｔｒａｉｎｓ ｒｅｓｉｓｔａｎｔ ｔｏ ａｚｉｔｈｒｏｍｙｃｉｎ ａｎｄ ｔｅｓｔｅｄ ｔｈｅ ｍｕｔａｔｅｄ ｓｉｔｅｓ ｏｆ ｄｒｕｇ．ｒｅｓｉｓｔａｎｔ ｇｅｎｅｓ ｉｎ ｔｈｅｉｒ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｓｉｔｅｓ：ｇｅｎｅ ｏｆ Ｖ ｒｅｇｉｏｎ ｏｆ ２３Ｓ ｒＲＮＡ，ｇｅｎｅ ｏｆ ＩＩ ｒｅｇｉｏｎ ｏｆ ２３Ｓ ｒＲＮＡｒｐ／Ｄ ｇｅｎｅ ａｎｄ ｒｐｌＶ ｇｅｎｅ．Ｒｅｓｕｌｔｓ ４９３ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｅｒｅ ｓｅｌｅｃｔｅｄ ，ａｎｄ ｔｈｅｒｅ ｗｅｒｅ ４ ｐｏｓｉｔｉｖｅ Ｍｐ ｓｔｒａｉｎｓ．Ａｍｏｎｇ ｔｈｅｍ２ ｓｒａｉｔｎｓ ｗｅｒｅ ｒｅｓｉｓｔａｎｔ ｔｏ ｅｒｙｔｈｒｏｍｙｃｉｎ ａｎｄ ａｚｉｔｈｒｏｍｙｃｉｎ，３ ｓｔｒａｉｎｓ ，ｗｅｒｅ ｒｅｓｉｓｔａｎｔ ｔｏ ｃｉｐｒｏｆｌｏｘａｃｉｎ ａｎｄ ｌｏｍｅｆｌｏｘａｃｉｎ，ａｎｄ ａｌ１ ｔｈｅ ｓｔｒａｉｎｓ ｗｅｒｅ ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ ｔｏ ｃｈｌｏｒａｍｐｈｅｎｉｃｏ１Ｓｔｒａｉｎｓ ｒｅｓｉｓｔａｎｔ ．ｔｏ ａｚｉｔｈｒｏｍｙｃｉｎ ｈａｄ ｐｏｉｎｔ ｍｕｔａｔｉｏｎ ｆｒｏｍ Ａ ｔｏ Ｇ ａｔ ｔｈｅ ｓｉｔｅ ２０６３ ｉｎ ｇｅｎｅ ｏｆ Ｖ ｒｅｇｉｏｎ ｏｆ ２３ Ｓ ｒＲＮＡＣｏｎｃｌｕｓｉｏｎ Ｔｈｅｒｅ ｗｅｒｅ Ｍｐ ｓｔｒａｉｎｓ ｒｅｓｉｓｔａｎｔ ｔｏ ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ ｏｆ ｍａｃｒｏｌｉｄｅｓ ａｎｄ ｑｕｉｎｏｌｏｎｅｓ ｉｎ ｏｕｒ ｈｏｓｐｉｔａｌ ａｎｄ ｔｈｅｙ ｈａｄ ｔｈｅ ｐｈｅｎｏｍｅｎｏｎ ．ｏｆ ｍｕｌｔｉｄｒｕｇ ｒｅｓｉｓｔａｎｔ．Ｔｈｅ ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ ｏｆ ｄｒｕｇ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｃａｕｓｅｄ ｂｙ Ｍｐ ｔｏ ａｚｉｔｈｒｏｍｙｃｉｎ ｗｅｒｅ ｃｏｎｓｉｄｅｒｅｄ ｐｏｓｓｉｂｉｌｖ ｃｏｎｃｅｒｎｅｄ ｗｉｔｈ ｐｏｉｎｔ ｍｕｔａｔｉｏｎ ｉｎ ｇｅｎｅ ｏｆ Ｖ ｒｅｇｉｏｎ ｏｆ ２３ Ｓ ｒＲＮＡ．Ｗｈｅｔｈｅｒ ｔｈｅｙ ｈａｄ ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐ ｗｉｔｈ ｇｅｎｅ ｏｆ ＩＩ ｒｅｇｉｏｎ ｏｆ ２３ Ｓ ｒＲＮＡ， ｇｅｎｅ ａｎｄ ｒｐｌＶ ｇｅｎｅ ｗａｓ ｓｔｉｌ１ ｕｎｃｅｒｔａｉｎ． Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａ；Ａｚｉｔｈｒｏｍｙｃｉｎ；Ｄｒｕｇ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ 收稿臼期：２００９—０８—２５ 作者简介：潘明安，男，生于ｌ９７９年，硕士，住院医师，Ｅ—ｍａｉｌ：ｐａｎｍｉｎｇａｎ＠１６３ｃｏｎｌ。 通讯作者，Ｅ—ｍａｉｌ：ｚｈｔｉｔｕｌｉ＠１６３．ｃｏｍ ．Ｓ２ 肺炎支原体的耐药情况及其对阿奇霉素耐药机制的研究潘明安等 肺炎支原体（Ｍｐ）是儿童和青少年社区获得性呼 吸道感染的常见病原体之一，由于分离培养困难， Ｍｐ感染的诊断多依赖血清学检查，因此药物敏感性 研究报道较少。近年来随着抗生素的广泛使用，Ｍｐ 对大环内酯类抗生素出现耐药现象ｆｌ＿ 。为了解Ｍｐ ， 因，根据国外文献报道［５］，设计引物： ２３Ｓ ｒＲＮＡ Ｖ区基因编码区１７５８ｎｔ￣ｌＪ２６８４ｎｔ 之间的部分，引物序列是：２３ＳＤＶＦ：５’一ＧＣＡＧ ＴＧＡＡＧＡＡＣＧＡＧＧＧＧ一３’，２３ＳＤＶＲ：５＇－ＧＴＣＣＴＣＧ ＣＴＴＣＧＧＴＣＣＴＣＴＣＧ一３’，产物为９２７ｂｐ。 对常用药物的耐药情况及对阿奇霉素的耐药机制， 我们对临床标本分离培养Ｍｐ，进行体外药敏试验， 并对阿奇霉素作用靶位２３Ｓ ｒＲＮＡ基因及ｒｐ／Ｄ基因、 ｒｐｌ 因进行检测。 １材料和方法 １．１ Ｍｐ的分离培养 收集２００７年８月至２００８年３月我院呼吸科和儿科 的住院、门诊的社区获得性呼吸道感染病人的咽拭 子、痰标本，床边接种到肺炎支原体液体培养基（广 州市怡林园生物工程有限公司生产），置于３７￣Ｃ、５％ ＣＯ 环境培养５ｄ，培养基由红变黄，并且液体澄清， 可作为Ｍｐ生长特征。 １．２临床分离株的鉴定 使用ＰＣＲ扩增的方法，取对应于Ｍｐ表面蛋白 Ｐ１基因编码区１７８ｎｔ￣ｌＪ３３１ｎｔ之间的部分，引物序 列是：上游引物：５’一ＣＡＡＴＧＣＣＡＴＣＡＡＣＣＣＧＣＧ ＣＴＴＡＡＣＣ一３’，下游引物：５’一ＣＧＴＧＧＴＴＴＧＴＴＧ ＡＣＴＧＣＣＡＣＴＧＣＣＧ一３’。反应混合物为引物、 ｄＮＴＰｓ、１０ｘ缓冲液、Ｔａｑ ＤＮＡ聚合酶及ＤＮＡ模板 液，总反应体积５０ｐＬ。热循环参数为：９３℃预变性 １０ｍｉｎ，９３℃１ｍｉｎ，５５℃ｌｍｉｎ，７２￣Ｃ ｌｍｉｎ，共３６个 循环，最后一个周期７２￣Ｃ延长１０ｍｉｎ。产物采用琼脂 糖凝胶电泳成像，扩增产物大小为１５４ｂｐ。 １＿３药物敏感试验 选用药物为红霉素、阿奇霉素、环丙沙星、洛 美沙星、氯霉素，用液体培养基稀释药物，各管中加 入等量Ｍｐ菌液（浓度１ ０ｓ ＣＣＵ／ｍＬ），使用微量肉汤稀 释法测定ＭＩＣ值。参考ＣＬＳＩ２００６年第ｌ６版革兰阳性细 菌的耐药标准，结合国内外肺炎支原体耐药研究的相 关文献【３． 】，判断Ｍｐ的敏感度如下：红霉素≥８ｇｇ／ｍＬ 为耐药，≤０．５￣ｇ／ｍＬ为敏感；阿奇霉素≥８ｇｇ／ｍＬ 为耐药，≤２ｇｇ／ｍＬ为敏感；环丙沙星≥４ｇｇ／ｍＬ 为耐药，≤１ｇｇ／ｍＬ为敏感；洛美沙星≥８ｇｇ／ｍＬ 为耐药，≤２ｇｇ／ｍＬ为敏感；氯霉素≥３２ｇｇ／ｍＬ 为耐药，￣＜８ｇｇ／ｍＬ为敏感。 １．４ 阿奇霉素作用靶位的基因分析 从美国国立生物信息中心ｆＮＣＢＩ）检索Ｍｐ ２３Ｓ ｒＲＮＡ ＩＩ区基因、２３Ｓ ｒＲＮＡ Ｖ区基因、 ｆＤ基因、 ２３Ｓ ｒＲＮＡ ＩＩ区基因编码区４９１ｎｔ到１ ３０６ｎｔ 之间的部分，引物序列是：２３ＳＤＩＩＦ：５’．ＡＧＴＡ ＣＣＧＴＧＡＧＧＧＡＡＡＧＧＴＧ一３’，２３ＳＤＩＩＲ： ５’． ＴＣＣＣＡＡＧＣＧＴＴＡＣＴＣＡＴＧＣＣ一３’，产物为８１６ｂｐ。 ｒｐ／Ｄ基因编码区１２３ Ｉｎｔ到１９５２ｎｔ之间的部分， 引物序歹Ｕ是：Ｌ４Ｆ：５’．ＡＡＡＡＧＣＡＧＣＡＣＣＡＧ ＴＴＧＴＡＧ．３’，Ｌ４Ｒ：５’一ＧＧＴＴＡＧＡＡＣＴＧＧＴＴＴＴ ＡＧＣＡ．３’，产物为７２２ｂｐ。 ｒｐｌＶ￣因编码区３６４０ｎｔ到４２６６ｎｔ之间的部分， 引物序列是：Ｌ２２Ｆ：５’一ＧＴＡＣＡＴＡＡＣＧＧＣＡＡＧＡ ＣＣＴＴ．３’，Ｌ２２Ｒ： ５’一ＧＣＡＡＧＣＣＧＴＴＧＧＡＧＴＴＴＡＣＴ ．３’，产物为６２７ｂｐ。 反应混合物为引物、ｄＮＴＰｓ、１０￣Ｂｕｆｆｅｒ、Ｔａｑ ＤＮＡ聚合酶及ＤＮＡ模板液，总反应体积５０ｇＬ。热 循环参数为：９４℃预变性２ｍｉｎ，９４℃４５ｓ，５５℃ ｌｍｉｎ，７２℃８０ｓ，共３６个循环，最后一个周期７２℃ 延长５ｍｉｎ。终产物经纯化、测序，与已经登陆ＮＣＢＩ 的Ｍ１２９标准株相应基因作对比。 ２结果 ２．１ Ｍｐ的分离培养结果 收集入选病人的咽拭子或者痰标本４９３例，经培 养为Ｍｐ阳性的有４株。临床分离株及Ｍｐ标准株ＰＣＲ 扩增均出现１５４ ｂｐ目的条带。 ２．２药敏试验结果 标准株对红霉素、阿奇霉素、环丙沙星、洛 美沙星、氯霉素５种药物均敏感，４株临床分离株 中，耐红霉素２株，它们都对红霉素高水平耐药 ｆＭＩＣ＞＝３２ｇｇ／ｍＬ１，耐阿奇霉素２株，耐环丙沙星和 洛美沙星的有３株，４株临床株对氯霉素都敏感。其 中对两种药物耐药的有１株，对４种药物耐药有２株， 存在多重耐药情况，药敏结果见表１。 ２＿３阿奇霉素作用靶位变异位点分析 标准株和４株临床分离株的ｒｐｌ 基因、ｒｐｌＤ基 因、２３Ｓ ｒＲＮＡ Ｖ区基因和２３Ｓ ｒＲＮＡ ＩＩ区基因经ＰＣＲ 扩增后均出现目的条带。 与标准株Ｍ１２９株相比，对阿奇霉素耐药的分离 株２的２３Ｓ ｒＲＮＡ的ｖ区基因的２０６３位发生Ａ到Ｇ的点 突变，ｒｐｌＤ基因出现１６２位ＣＮＡ、４３０位Ａ￣［ＪＧ的点 ７ 中国抗生素杂志２０１０年９月第３５卷第９期 Ｓ３ 表１ Ｍｐ的ＦＨ标准株、临床株的ＭＩＣ值（ｒｔｇ／ｍＬ） Ｔａｂ．１ Ｔｈｅ ＭＩＣ ｏｆＦＨ ｓｔｒａｉｎ，ｃｌｉｎｉｃａｌ ｓｔｒａｉｎｓ ｆｏｒ Ｍｐ（￣ｇ／ｍＬ） 人的发热时间增加，治疗时间延长，造成临床治疗 效果下降［７１。针对Ｍｐ对大环内酯类抗生素的耐药机 制做了一些研究，目前国内外的报道认为与结合位 点的基因突变密切相关『８＿ ］。大环内酯类抗生素作用 区域在基因２３Ｓ ｒＲＮＡ ＩＩ区和Ｖ区，可与Ｖ区的核苷 酸作用，从而抑制细菌蛋白质的合成，其中阿奇霉 素１５元环的结合位点在２０５８、２０５９，２０６２及２６１ １（大 ｓ：敏感Ｒ：耐药Ｉ：中介 肠埃希菌编码１等。而ＩＩ区７５２的位点也可以与大环 内酯类抗生素疏松结合。核糖体蛋白Ｌ４、Ｌ２２是核 突变，ｒｐｌ 因出现２７９位Ｔ￣Ｉ］Ｃ、５０８位ＴＮＣ的点突 糖体大亚基早期组装过程中的蛋白质，Ｌ４的突变使 变。对阿奇霉素耐药的分离株３的ｒｐｌ 因出现５０８ 肽合成通道变窄，致大环内酯类抗生素结合部位远 位Ｔ到Ｃ的点突变，２３Ｓ ｒＲＮＡ的Ｖ区基因、ｒｐ／Ｄ基因 离该通道而失效，产生耐药。而Ｌ２２的突变是使入口 未出现点突变。对阿奇霉素敏感的分离株１和４的２３Ｓ 变大，药物的流出增加。Ｃａｎｕ Ａ￣ＤＧｒｅｇｏｒｙ Ｓ．Ｔ等认 ｒＲＮＡ Ｖ区基因、ｒｐ／Ｄ基因、ｒｐｌ 因均未出现点突 为，ｒｐｌＤ基因（核糖体蛋白Ｌ４）和 ， 因（核糖体蛋 变。ＦＨ标准株与分离株２的 ，Ｄ基因均出现Ｉ６２位Ｃ 白Ｌ２２）点突变与大环内酯类抗生素耐药相关［１０】。因 到Ａ、４３０位Ａ到Ｇ的点突变，ｒｐｌ瞎因也都出现２７９ 此，２３Ｓ ｒＲＮＡ的ＩＩ区和Ｖ区、ｒｐ／Ｄ基因（核糖体蛋白 位Ｔ￣ｚＪＣ、５０８位Ｔ到Ｃ的点突变，但２３Ｓ ｒＲＮＡ的Ｖ区 Ｌ４）、ｒｐｌ 因（核糖体蛋￣Ｌ２２）点突变也可能与大环 基因无点突变。所有菌株的２３Ｓ ｒＲＮＡ ＩＩ区均未出现 内酯类抗生素耐药相关『５］。现国内外的研究主要集中 点突变，见表２。 在Ｍｐ对红霉素的耐药研究，而对临床治疗普遍使用 ３讨论 的阿奇霉素耐药情况和机制以及喹诺酮类抗生素耐 支原体对影响蛋白质合成的抗生素如大环内酯 药现状的研究国内外报道较少，本实验旨在进一步 类、喹诺酮类等敏感。近年来随着抗生素的广泛使 加强和完善该方面的研究，为临床诊断和治疗提供 用，耐药现象有明显增加的趋势［ 。耐药Ｍｐ感染病 依据。 表２各株Ｍｐ的４个基因扩增区ＰＣＲ产物测序结果 Ｔａｂ．２ Ｔｈｅ ＰＣＲ ｐｒｏｄｕｃｔｓ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｒｅｓｕｌｔｓ ｏｆ ４ ｇｅｎｅ ａｍｐｌｉｆｉｅｄ ｒｅｇｉｏｎｓ ｆｏｒ Ｍｐ 一：表示相对Ｍ１２９株无变异位点。 本组临床分离的Ｍｐ中，分离株３对红霉素、阿 的Ｍｐ株对氯霉素仍可敏感，但由于在体内氯霉素对 奇霉素均为高水平耐药，且存在多重耐药情况。４ 支原体有较小的抑制作用，并且氯霉素本身的副作 株临床分离株对氯霉素均为敏感。由于氯霉素也是 用较大，因此不作为治疗Ｍｐ感染的一线药物，但在 通过抑制细菌蛋白质的合成发挥抗菌作用，氯霉素 治疗耐药Ｍｐ感染仍可以作为一种选择。 与大环内酯类抗生素的结合位点均位于２３Ｓ ｒＲＮＡ Ｖ 本实验研究表明耐阿奇霉素的Ｍｐ菌株耐药形成 区，但二者的具体结合位点有所不同…】。因此大环 的分子基础为２３Ｓ ｒＲＮＡ结构域Ｖ区２０６３位由Ａ到Ｇ的 内酯类靶位２３Ｓ ｒＲＮＡ Ｖ区产生点突变引起的耐药对 点突变。Ｍａｔｓｕｏｋａ等报道在日本分离的Ｍｐ阿奇霉素 氯霉素的结合无影响，故在理论上大环内酯类耐药 耐药株中，１０株的耐药机制为２０６３位Ａ到Ｇ点突变， 、、 肺炎支原体的耐药情况及其对阿奇霉素耐药机制的研究潘明安等 另有３株分别与２０６３位ＡＮＣ点突变、２０６４位Ａ￣ＪｊＧ点 突变、２６１７位Ｃ到Ｇ的点突变有关［５】。Ｍｏｒｏｚｕｍｉ等报 制需要做更广泛的研究，为了让抗生素更好地发挥疗 效，应该积极寻找措施以减低耐药率，如耐药监测、 制定合理的用药措施和指导原则非常重要。 道从临床分离的９株阿奇霉素耐药株耐药机制为２０６３ 位Ａ到Ｇ的点突变，２株为２０６４位Ａ到Ｇ的点突变ｌ１２】。 ２０６３位是阿奇霉素、红霉素等大环内酯类抗生素的 靶位点，点突变导致大环内酯类抗生素与核糖体亲 和力的下降而耐药。Ｌｉｕ等报道，４４株对阿奇霉素和 红霉素共同耐药的Ｍｐ耐药机制与２０６３位Ａ到Ｇ的点 突变相关，Ｘｉｎ等报道［８’“］，４６株大环内酯类抗生素 耐药的Ｍｐ耐药机制与２０６３、２０６４位点突变有关。病 原体的ｒＲＮＡ基因是比较保守的基因，文献报道大 肠杆菌、幽门螺旋杆菌、肺炎链球菌２３Ｓ ｒＲＮＡ Ｖ区 ２０６３位的点突变在产生了对大环内酯类抗生素的高 度耐药【 】，由此推测基因２３Ｓ ｒＲＮＡ Ｖ区２０６３位由Ａ到 Ｇ的点突变可能是引起Ｍｐ对阿奇霉素和红霉素共同 耐药的分子基础之一，对红霉素耐药的Ｍｐ也可能对 阿奇霉素交叉耐药。除２０６３位之外，２０６４、２０６７位 也是红霉素和阿奇霉素共同的作用靶位，红霉素耐 药株变异的位点，￣Ｈ２０６３位Ａ到Ｃ、２０６４Ａ￣ＩＪＧ的点 突变［５－６，１２１，也是阿奇霉素耐药的分子机制。 阿奇霉素耐药株（临床株２、３）、ＦＨ标准株、 临床株１、临床株４的２３Ｓ ｒＲＮＡ的ＩＩ区基因均无点突 变。文献报道目前为止也未发现耐药Ｍｐ的２３Ｓ ｒＲＮＡ 的ＩＩ区点突变，因此２３Ｓ ｒＲＮＡ ＩＩ区基因点突变与耐药 机制无明确相关性。 对ｒｐ／Ｄ基因、ｒｐｌ堪因的研究发现，敏感株（临 床株ｌ和４）相对于Ｍ１２９标准株无点突变。临床株２相 对于Ｍ１２９株出现了点突变，其中ｒｐ／Ｄ基因的１６２位、 ｒｐｌ 因的２７９位点突变与氨基酸变异无关。ｒｐ／Ｄ基 因的４３０位Ａ—Ｇ可导致氨基酸１３４位由蛋氨酸变为颉氨 酸，ｒｐｌＶ￣因５０８位由Ｔ变为Ｃ可导致氨基酸１７０位由 丝氨酸变为脯氨酸。这与ＦＨ标准株完全相同，有文 献报道认为该变化与Ｐ１基因分型有关【 。临床株３的 ｒｐｌ 因虽然出现５０８位Ｔ￣ｒＪＣ的点突变可导致氨基酸 １７０位由丝氨酸变为脯氨酸，但该突变在ＦＨ标准株也 出现，无法确定是与Ｐ１基因分型相关还是与耐药有 关，并且上述突变并未引起ＦＨ标准株耐药的现象， Ｎ￣ｇｒｐｔＤ基因、ｒｐｌ 因点突变尚不能确定与阿奇霉 素耐药机制是否相关。 本研究表明Ｍｐ对临床应用广泛的阿奇霉素和喹 诺酮类抗生素有耐药现象，其耐药严重性应引起我们 的足够重视。由于Ｍｐ分离生长困难，因此对其耐药机 参考文献 ［１］Ｍｏｒｏｚｕｍｉ Ｍ，１ｗａｔａ Ｓ，Ｈａｓｅｇａｗａ Ｋ，ｅｔ ａ１．Ｉｎｃｒｅａｓｅｄ ｍａｃｒｏｌｉｄｅ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｏｆ Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ ｉｎ ｐｅｄｉａｔｒｉｃ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ ｃｏｍｍｕｎｉｔｙ—ａｃｑｕｉｒｅｄ ｐｎｅｕｍｏｎｉａ［Ｊ］． Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ Ａｇｅｎｔｓ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ，２００８，５２（１）：３４８—３５０． ［２］Ｐｅｒｅｙｒｅ Ｓ，Ｃｈａｒｒｏｎ Ａ，Ｒｅｎａｕｄｉｎ Ｈ，ｅｔ ａ１．Ｆｉｒｓｔ ｒｅｐｏｒｔ ｏｆ ｍａｃｒｏｌｉｄｅ—ｒｅｓｉｓｔａｎｔ ｓｔｒａｉｎｓ ａｎｄ ｄｅｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｎｏｖｅｌ ｎｕｃｌｅｏｌｉｄｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｖａｒｉａｔｉｏｎ ｉｎ ｔｈｅ Ｐ １ ａｄｈｅｓｉｎ ｇｅｎｅ ｉｎ Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ ｃｌｉｎｉｃａｌ ｓｔｒａｉｎｓ ｉｓｏｌａｔｅｄ ｉｎ Ｆｒａｎｃｅ ｏｖｅｒ １２ ｙｅａｒｓ［Ｊ］．Ｊ Ｃｌｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ，２００７，４５（１ １）：３５３４—３５３９． ［３］ 韩旭，辛德莉，李靖，等．氯霉素、利福平对肺炎支原体的 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Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ ｉｓｏｌａｔｅｓ ａｎｄ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｎ ｍａｃｒｏｌｉｄｅ－ｒｅｓｉｓｔａｎｔ ｓｔｒａｉｎｓ ｆｒｏｍ Ｓｈａｎｇｈａｉ Ｃｈｉｎａ［Ｊ］． Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ Ａｇｅｎｔｓ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ，２００９，５３（５）：２ １ ６０－２ １ ６２． ［１０］Ｃａｎｕ Ａ，Ｍａｌｂｒｕｎｙ Ｂ，Ｃｏｑｕｅｍｏｎｔ Ｍ，ｅｔ ａ１．Ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ ｒｉｂｏｓｏｍａｌ ｍｕｔａｔｉｏｎｓ ｃｏｎｆｅｒｒｉｎｇ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｔｏ ｍａｃｒｏｌｉｄｅｓ， ｃｌｉｎｄａｍｙｃｉｎ，ｓｔｒｅｐｔｏｇｒａｍｉｎ，ａｎｄ ｔｅｌｉｔｈｒｏｍｙｃｉｎ ｉｎ －｝ 中国抗生素杂志２０１０年９月第３５卷第９期 ．Ｓ５ （上接６７０页） ３结论 以上研究结果表明，价格低廉的Ｆ４２果葡糖浆在 经过简单的处理去除部分葡萄糖后对环孢菌素Ａ发酵 产生了明显的影响，发酵效价明显高于未处理的果 ２５ ２０ １５ ｌＯ 葡糖浆，发酵后期也不出现稀化现象，而且与果糖 相比，发酵效价相当于８％的果糖，但是菌丝浓度却 较低，这对于生产实践是有意义的，因为雪白白僵 菌发酵环孢菌素Ａ过程中菌丝浓度太高不仅会影响溶 发酵时间／ｄ 程５ Ｏ 氧而且会增加能耗，所以综合考虑，价格低廉的Ｆ４２ 果葡糖浆在经过简单的处理后用于替代果糖是一种 可以降低环孢菌素Ａ生产成本的途径。 参考文献 【１１ 程元荣．微生物来源的免疫抑制剂［Ｊ１．中国抗生素杂志， １９９６，２１（增刊）：２４—２６． ［２］ 赵德修．有关氨基酸对环孢菌素Ａ形成的影响［Ｊ］．中国抗 生素杂志，１９９７，２２（１）：１６—１８． ［３］ 闫敬．环孢菌素Ａ发酵中玉米浆的选择［Ｊ］．河北化工， １：１１％去除结晶葡萄糖的果葡糖浆；２：８％果糖 图３果葡糖浆及果糖对菌丝浓度的影响 Ｆｉｇ．３ Ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ｆｒｕｃｔｏｓｅ—ｇｌｕｃｏｓｅ ｓｙｒｕｐ ａｎｄ ｆｒｕｃｔｏｓｅ ｏｎ ｔｈｅ ｍｙｃｅｌｉｕｍ ｄｅｎｓｉｔｙ ｇ ２００７．２：４７—４８． 【４】 Ａｒｇｙｒｉｏｓ Ｍａｒｇａｒｉｔｉｓ，廖福荣．雪状白僵菌生物合成环孢菌 疑 避 素Ａ的果糖基础培养基的研究［Ｊ］．国外医药抗生素分册， １９９０，（１１）６：４１９． 『５１ 王德友．～种抗果葡糖浆结晶的方法：ＣＮ １９７４７９０［Ｐ］． 发酵时问，ｄ １：１ １％去除结晶葡萄糖的果葡糖浆：２：８％果糖 ２０ １ ０．０６．０９． 图４果葡糖浆及果糖对发酵单位的影响 Ｆｉｇ．４ Ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ｆｒｕｃｔｏｓｅ－ｇｌｕｃｏｓｅ ｓｙｒｕｐ ａｎｄ ｆｒｕｃｔｏｓｅ ｏｎ ｔｈｅ ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ ｐｏｔｅｎｃｙ ｏｆ ｃｙｃｌｏｓｐｏｒｉｎ Ａ ｆ６１ 中国国家标准化管理委员会．中华人民共和国国家标准 ［Ｓ］．（２００７年版）．北京：中国标准出版社，２００７：果葡糖浆ＧＢ／ Ｔ２０８８２．２００７：】～】６．
