ARDS大鼠肺泡 Ⅱ型上皮细胞的分离纯化及

ARDS大鼠肺泡Ⅱ型上皮细胞的分离纯化及

电镜下特征

刘　琳△　李涛平

3

南方医科大学南方医院呼吸科(广州510515)

　　【摘要】　目的　观察急性呼吸窘迫综合征(ARDS)大鼠肺泡Ⅱ型上皮细胞超微结构的改变。方法　建立大鼠油酸性ARDS模型,对其肺泡Ⅱ型上皮细胞进行分离、纯化,电镜鉴定并观察其超微结构的变化。结果　电镜下

ARDS大鼠Ⅱ型上皮细胞胞浆内板层小体排空明显而致空泡化,细胞分离后IgG免疫黏附方法纯化可使纯度提高15%。结论　先分离纯化细胞再进行电镜观察更易观察到Ⅱ型细胞的形态学改变,从板层小体的变化最为突出可

观察到肺泡Ⅱ型上皮细胞在ARDS中的重要作用。

【关键词】　急性呼吸窘迫综合征　肺泡Ⅱ型上皮细胞　细胞分离　电镜

IsolationpurificationandultrastructuralcharateristicsofalveolartypeⅡcellsofARDSrats　LiuLin,LiTaoping.NanfangHospital,NanfangMedicalUniversity,Guangzhou510515

【Abstract】　Objective　TostudytheultrastructuralchangesofalveolartypeⅡcellsofratswithexperimentalARDSafter

isolationandpurification.Methods　AlveolartypeⅡcellswereisolatedandpuritfied,andthechangesincellularultrastructurewerestudiedbyelectronmicroscopeinratoleicacidARDSmodels.Results　ThelamellarbodiesofalveolartypeⅡcellsofARDSratssignificantlydecreasedandbecamevacuolated.AdherencetoIgGcoateddishesafterisolationincreasedcellpurityby15%.Conclusion　ItiseasiertostudythemorphologyicalchangesofalveolartypeⅡcellsafterisolationandpurification.TheprominentchangesinlamellarbodiessuggestthattypeⅡcellsplayanimportantroleinARDS.

【Keywords】　ARDS　AlveolartypeⅡcells　Cellisolation　Electronmicroscope

　　急性呼吸窘迫综合征(ARDS)是临床常见危重病,

其死亡率达35%～58%[1,2]。由油酸复制ARDS实验动物模型的方法已被许多学者公认。我们对实验动物进行肺泡Ⅱ型上皮细胞(简称Ⅱ型细胞)的分离纯化并电镜观察ARDS大鼠Ⅱ型细胞的超微结构改变,为了解Ⅱ型细胞在ARDS发病中的作用提供一些基础资料。

1　材料与方法

1.1　动物模型的建立　健康雄性SD大鼠共14只,由

入三角烧瓶,37℃130次/min水浴晃动5min,200目滤

网过滤,400r/min离心10min,弃上清,用DMEM重悬细胞,细胞计数并调节细胞浓度至(2～3)×106个/ml。

1.3　Ⅱ型细胞纯化　将细胞悬液加入已用IgG包被

的培养皿中培养(见文献[3]),37℃5%CO2培养箱中孵育1h,移出未黏附的细胞,130r/min离心8min,弃上清,用含10%新生小牛血清的DMEM重悬细胞。

1.4　鞣酸染色鉴定　按Mason等[4]方法稍加改进,细

南方医院实验动物中心提供,随机分为油酸组及对照

组,油酸组8只、对照组6只。腹腔内注射10%水合氯醛(0135ml/100g),肝素400u/kg,气管插管,剖腹,分离出腹主动脉、下腔静脉,经下腔静脉注射油酸(014ml/kg),对照组注射等量生理盐水,在腹主动脉抽血气并放血活杀。1.2　Ⅱ型细胞分离　经肺动脉用溶液Ⅱ(溶液Ⅰ、Ⅱ配法见文献[3])灌洗肺,气管通气8次,经气管插管用溶液Ⅰ灌洗肺8次,再用溶液Ⅱ灌洗2次,用01125%胰蛋白酶15ml注入肺,快速取出肺,37℃水浴20min,除去大气道,在含有4mlDNase的小烧杯中剪碎肺,5ml小牛血清灭活胰蛋白酶,补足溶液Ⅱ20ml倒

胞悬液涂片,干燥后2%戊二醛固定15min,PBS冲洗2

次,1%四氧锇酸染色115h,1%鞣酸染色过夜,PBS漂洗,双蒸水冲洗,自然干燥,封片,光镜检查。

1.5　电镜鉴定及超微结构观察　取细胞悬液10000r/min离心10min,弃上清,电镜用固定液(本校电镜室

提供)固定过夜,PBS漂洗,丙酮脱水,1%四氧锇酸后固定,环氧树脂包埋,超薄切片,枸橼酸铅染色,透射电镜下观察[5]。

2　结果

2.1　细胞染色及电镜观察结果　光学显微镜下可见

细胞胞浆内含有较多的黑色颗粒围绕细胞核分布(图

1)。电镜下可见Ⅱ型细胞形状较规则,细胞表面有很

多长短不一、粗细不等的微绒毛,胞核明显,胞浆内含

　3国家自然科学基金资助项目(编号:39971789)

　△现作者单位:中国人民解放军第309医院(解放军总医院309临床部)全军结核中心结一科(北京100091)

有数量不等、大小不一的特征性板层小体,且可看到其不同的成熟阶段;油酸组可见Ⅱ型细胞相对不规则,细胞变性,甚至崩解,细胞表面微绒毛减少,胞浆内板层

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・762・Jun.2005,Vol.26,No.6GuangdongMedicalJournal　

小体排空明显增多而致空泡化并可见脱落的板层小体

(图2)。

2.2　细胞活力和纯度　用鞣酸染色及电镜观察进行

细胞纯度判断,油酸组未用IgG免疫黏附纯化前,纯度达(7215±511)%,纯化后可提高至(8812±415)%;台盼兰染色细胞活力为(8914±313)%。

3　讨论

肺泡Ⅱ型细胞占肺泡上皮数量的60%,以细胞中嗜锇性板层体颗粒为其特征,该细胞具有多种重要的生理功能:它可合成和分泌肺泡表面活性物质和多种炎性介质,具有参与生物活性物质代谢、免疫调节、水和电解质转运等功能,可增生演变为Ⅰ型细胞修复损伤的细胞壁。由于肺组织细胞的组成复杂、功能各异,既往对肺泡Ⅱ型上皮细胞的研究便受到很多难以控制的整体因素和体液环境的影响,以致于很难得出确切的结论。体外细胞分离纯化并单纯对这些细胞进行研究则可以排除这些影响,为科学评价Ⅱ型细胞在多种生物机制中的作用提供理论依据。

本实验采取胰蛋白酶消化分离肺泡Ⅱ型细胞,胰蛋白酶是从肺泡基底膜处将Ⅱ型细胞分离。胰蛋白酶消化浓度为01125%,时间20min,在37℃下进行,浓度过高、时间过长会造成细胞损伤,尤其在ARDS大鼠的Ⅱ型细胞更易受损,而且会增加非Ⅱ型细胞的比例,浓度和时间不够又会减少分离的细胞产量。在分离细胞的过程中我们发现,经肺动脉和经气道的充分灌洗非常重要,右心室穿刺肺动脉灌洗后肺动静脉及毛细血管内的血细胞被冲走,分离后的Ⅱ型细胞悬液中极少有红细胞、白细胞,经气管插管灌洗肺泡更加重要,可冲洗走肺泡内绝大多数的巨噬细胞,对Ⅱ型细胞的纯度有重要意义。

细胞分离后纯化至关重要,我们采用免疫黏附选择法对分离的细胞悬液进行纯化,它可使细胞纯度提

高15%左右,若Ⅱ型细胞纯度达不到实验要求,操作中可考虑适当延长黏附时间,甚至重复黏附纯化2次,但黏附时间过长又会使较多的Ⅱ型细胞亦黏附上去,影响Ⅱ型细胞的产量。大多数的非Ⅱ型细胞如淋巴细胞、肺泡巨噬细胞和中性粒细胞等表面含有免疫球蛋白IgG的Fc段受体,能与IgG的Fc段结合,而Ⅱ型细胞表面则缺乏Fc受体,根据这一原理,将培养皿事先用IgG覆被,这样加入单细胞悬液,其中的非Ⅱ型细胞的Fc受体与IgG结合,绝大多数杂细胞被黏附清除,也可见少量Ⅱ型细胞贴壁,不黏附的细胞中大多数为Ⅱ型细胞。用200目不锈钢滤网可滤去Ⅰ型上皮细胞。分离纯化的肺泡Ⅱ型上皮细胞在光学显微镜下呈圆或椭圆形,直径10～20μm,胞浆内含较多包含体,细胞核内可见核仁。

即往我们看到的ARDS肺Ⅱ型细胞超微结构观察的报道,均是取肺组织直接进行电镜观察[6]。本实验则是先对ARDS大鼠进行Ⅱ型细胞的分离、纯化,再进行电镜观察,集中观察高纯度Ⅱ型细胞的变化,观察的更加直接全面,不受肺间质水肿、内皮细胞肿胀、肺毛细血管充血等的挤压及影响,避免了肺组织中Ⅱ型细胞位于肺泡表面的低洼处及拐角处而不易观察到Ⅱ型细胞超微结构改变的弊病,更适用于主要针对Ⅱ型细胞的实验观察。从电镜结果中观察到ARDS大鼠Ⅱ型细胞的改变以板层小体的变化最为突出,板层体排空明显增多而致空泡化,从而支持ARDS发病机制与肺泡表面活性物质有重要关联。

参考文献

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2　ZilberbergMD,EpsteinSK.AcutelunginjuryinthemedicalICU:comor2bidconditions,ageetiology,andhospitaloutcome.AmJRespirCritCareMed,1998,157:1159

3　DobbsLG,GonzalezR,WilliamsMC.Animprovedmethodforisolating

typeⅡcellsinhighyieldandpurity.AmRevRespirDis,1986,134(1):141

4　MasonRJ,WalkerSR,ShieldsBA,etal.Identificationofratalveolar

typeⅡepithelialcellswithatannicacidandpolychromestain.AmRevRespirDis,1985,131(5):786

5　崔社怀,郭先健,钱桂生.鼠肺泡Ⅱ型上皮细胞的分离、鉴定和培

养.第三军医大学学报,1997,19(6):548

6　欧阳瑶,赵鸣武,廖松林.实验性油酸型呼吸窘迫综合征肺形态

学的观察.贵州医药,1998,22(4):245

(收稿日期:2004-11-23　编辑:祝　华)

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