胰岛素_胰高血糖素对体外单层培养的肝细胞胰岛素样生长因子_mRNA丰度的影响

󰀁中国兽医学报󰀁2009年6月󰀁第29卷󰀁第6期󰀁ChinJVetSci󰀁Jun.2009󰀁Vol.29󰀁No.6󰀁

胰岛素、胰高血糖素对体外单层培养的肝细胞胰岛素样生长因子󰀁󰀂mRNA丰度的影响󰀁󰀁

1122*11

󰀂四川农业大学动物医学院,四川雅安625014;邓俊良,王󰀁娅,徐󰀁闯,王󰀁哲,左之才,崔恒敏󰀁(1

2󰀂吉林大学畜牧兽医学院,长春130062)

摘要:以持家基因󰀁肌动蛋白(󰀁󰀁actin)作为内参照,通过竞争PCR法检测不同浓度的胰岛素和胰高血糖素对犊牛肝细胞中胰岛素样生长因子󰀁󰀂mRNA丰度的影响。结果表明,胰岛素和胰高血糖素都能直接胰岛素样生长因子󰀁󰀂mRNA的表达,胰岛素促进胰岛素样生长因子󰀁󰀂mRNA的表达,而胰高血糖素抑制胰岛素样生长因子󰀁󰀂mRNA的表达,存在量变关系。

关键词:胰岛素;胰高血糖素;胰岛素样生长因子󰀁󰀂;奶牛;肝细胞

中图分类号:S856.5󰀁󰀁󰀁文献标识码:A󰀁󰀁󰀁文章编号:1005󰀁45(2009)06󰀁0788󰀁05

Regulationoftheexpressionofthehumaninsulin󰀁likegrowthfactor󰀁Igeneincul󰀁

turedbovinehepatocytesbyinsulinandglucagon

DENGJun󰀁liang1,WANGYa1,XUChuang2,WANGZhe2*,ZUOZhi󰀁cai1,CUIHeng󰀁min1󰀁(1󰀂CollegeofVeterinaryMedicine,SichuanAgriculturalUniversity,Ya an,Sichuan625014,China;2.CollegeofAnimalScienceandVeterinaryMedicine,JilinUniversity,Changchun130062,China)

󰀁󰀁Abstract:Theeffectofinsulin󰀁likegrowthfactor󰀁Ibyinsulinandglucagonwasstudiedinprimarycalfhepato󰀁cyteculturesbydetectiontheexpressionlevelof󰀁󰀁actinmRNAthroughcompetitionpolymerasechainreaction.TheresultindicatedthatthedirectregulationofIGF󰀁󰀂mRNAlevelofinhepatocytewaseffectedbyinsulinandgluca󰀁gons,theIGF󰀁󰀂mRNAlevelofinhepatocytewasupregulationbyinsulin,Glucagonistheoppositeresult.󰀁󰀁Keywords:insulin;glucagon;insulin󰀁likegrowthfactor󰀁I;dairycattle;hepatocyte*Correspondingauthor,E󰀁mail:wangzhe500518@sohu.com

󰀁󰀁胰岛素样生长因子󰀁󰀂(IGF󰀁󰀂)主要是由肝细胞合成和释放的一种细胞因子,它能促进细胞增殖和机体生长,还能与胰岛素受体结合起到降糖作用[1]。试验表明,IGF󰀁󰀂可以通过调节糖异生关键酶的基因表达水平来调节血糖水平。胰岛素(INS)和胰高血糖素(GN)分别是由胰腺󰀁和󰀂细胞分泌的影响动物机体血糖浓度的关键因子。有相关试验表明胰岛素和胰高血糖素能通过影响糖异生的关键酶󰀁磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶(PEPCK)的表达而调节机体血糖浓度[3󰀁4]。近年来研究较多的是胰岛素、胰高血糖素对鼠和人体内IGF󰀁󰀂的影

󰀁󰀁收稿日期:2007󰀁08󰀁29

󰀁󰀁基金项目:国家自然科学基金资助项目(3023062)󰀁󰀁作者简介:邓俊良(1966󰀁),男,教授,博士。󰀁󰀁*通讯作者,E󰀁mail:wangzhe500518@sohu.com[2]

响

[5󰀁7]

,而未见其在牛体内外对IGF󰀁󰀂影响的报道。

本试验通过在体外培养的犊牛肝细胞中添加胰岛

素、胰高血糖素,用分子生物学方法监测IGF󰀁󰀂表达水平,证实胰岛素、胰高血糖素对IGF󰀁󰀂的表达是否有直接影响,从而为揭示以糖代谢紊乱为病理学基础的奶牛酮病、脂肪肝的发病机制奠定分子生物学基础和理论依据,为其治疗方法提供新的途径。

1󰀁材料与方法

1.1󰀁材料

1.1.1󰀁主要试剂󰀁RPMIMedium10,购自Gib󰀁co公司;D󰀁Hanks、犊牛血清(FCS)自制;焦磷酸二乙酯(DEPC)、Tris均购自Sigma公司;氨苄青霉素、胶原酶!型、多聚赖氨酸购自北京鼎国公司;蛋白胨、酵母提取物,购自Oxoid公司;低融点琼脂

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7

糖,购自BRL公司;乙醇、异丙醇、异戊醇、CaCl2、氯仿、冰醋酸、NaOH、HCl、NaCl、琼脂粉、溴化乙啶为国产分析纯。

1.1.2󰀁工具酶及试剂盒󰀁胶原酶!型,购自北京鼎国公司;反转录酶(AMV)、OligordT、EX󰀁Taq酶、性内切酶EcoR󰀂、Hind∀、dNTP(2󰀂5、10mmol)、T4连接酶。RNA提取试剂盒,购自Roche公司;质粒、DNA回收试剂盒,购自杭州维特洁生物技术公司;6孔培养板,购自美国COSTER公司;RNAcaculater,购自PharmaciaBiotech公司;分子量标准DL󰀁2000购自TaKaRa公司;感受态细胞由吉林大学农学部生物技术系提供。

1.1.3󰀁载体及宿主菌󰀁pMD󰀁18T载体购自TaKa󰀁Ra公司;DH5a宿主菌为吉林大学农学部动物营养代谢病研究室自制。

1.2󰀁引物设计依据󰀁在GenBank中查得牛IGF󰀁󰀂及󰀁󰀁actin基因序列,用DNASIS软件设计上游引物为:5#󰀁GCAAAAATGACCCTGGAGTTG󰀁3#;下游引物为:5#󰀁AACCACTTAGACAAGCCTGCTG󰀁3#;目的片段为200bp;󰀁󰀁actin上游引物为:5#󰀁TCAT󰀁CACCATCGGCAATGAG󰀁3#,下游引物为:5#󰀁CATCGTACTCCTGCTTGCTGA󰀁3#,目的片段为351bp。

1.3󰀁单层肝细胞培养󰀁参照Donkin等[8]的相关报道,在无菌条件下取出肝后叶组织,分离动脉和结缔组织,用机械法及胶原酶消化法(终浓度为0󰀂125%)分离得活力较强、纯度较高的肝细胞,然后加入等量的含10%~15%犊牛血清的RPMIMedi󰀁um10培养液终止胶原酶的活性。通过100目尼龙网过滤悬液,再用无血清RPMIMedium10培养液洗涤肝细胞悬液以完全祛除胶原酶!(洗涤转数为1000r/min,10min);充分分散肝细胞,计数,按每孔1∃10个细胞接种于6孔培养板,于37%、5%CO2培养箱中孵育,在倒置显微镜下观察细胞,待细胞12h完全贴壁后,进行试验。1.4󰀁IGF󰀁󰀂cDNA的克隆与鉴定

1.4.1󰀁RNA的提取󰀁按RNA试剂盒说明操作。1.4.2󰀁cDNA的合成及目的片段的扩增󰀁&IGF󰀁󰀂基因RNA反转录反应体系如下:总RNA1 g,Oli󰀁godT50pmol,5∃RTBuffer4 L,dNTPMixture20mmol/L,RnaseInhibitor20U,AMV10U,加无菌DEPC处理水至20 l;逆转录反应条件为70%变性5min,0%退火5min,42%逆转录90min,90%Buffer4 L,dNTPMixture20mmol/L,RnaseInhibitor20U,AMV10U,加无菌DEPC处6

理水至20 L。∋IGF󰀁󰀂基因的PCR反应条件为95%预变性3min;95%变性45s,59%退火45s,72%延伸1min,30个循环;最后延伸10min。PCR反应体系为Ex󰀁Taq2.5U,10∃PCRBuffer(Mg)2.5 L,dNTPMixture10mmol/Leach,上游引物10 mol/L,下游引物10 mol/L,cDNA1 L,加无菌水至25 L。

1.4.3󰀁IGF󰀁󰀂基因琼脂糖凝胶电泳、PCR产物的回收及IGF󰀁󰀂cDNA的克隆、鉴定󰀁取5 L的PCR扩增产物在1%的琼脂糖凝胶电泳,用DGL󰀁2000做标准分子量,在紫外灯下观察电泳结果并进行拍照。IGF󰀁󰀂cDNA的回收按杭州维特洁技术公司PCR产物回收试剂盒说明进行操作。IGF󰀁󰀂的cDNA克隆,将回收的PCR产物与应用PMD󰀁18载体连接、转化、阳性克隆的筛选,具体方法按常规方法操作。质粒作PCR鉴定和双酶切鉴定。PCR条件、体系与1.4.2相同。双酶切鉴定体系为:EcoR󰀂1 L(15units),Hind∀1 L(15units),DNA(1 g,补足水到20 L。酶切条件:37%作用2.5h。1.5󰀁内源性竞争模板(󰀁󰀁actin)的cDNA克隆及鉴定

1.5.1󰀁总RNA的提取󰀁与1.4.1相同。1.5.2󰀁cDNA的合成及目的片段的扩增󰀁󰀁󰀁actin基因RNA反转录反应体系条件与1.4.2相同。󰀁󰀁actin基因的PCR反应条件为PCR反应条件为:95%预变性3min;95%变性50s,57%退火50s,72%延伸1min,30个循环;最后延伸10min。PCR反应体系为:Taq2.5U,10∃PCRBuffer(Mg2+)2󰀂5 L,dNTPMixture10mmol/Leach,上游引物10 mol/L,下游引物10 mol/L,cDNA1 L,加无菌H2O至25 L。

1.5.3󰀁󰀁󰀁actin基因琼脂糖凝胶电泳、PCR产物的回收及󰀁󰀁actinDNA的克隆、鉴定󰀁󰀁󰀁actinDNA的电泳、PCR产物回收、克隆与1.4.3相同。质粒PCR条件、体系与1.5.2相同。双酶切鉴定体系及条件与1.4.3相同。

1.6󰀁不同浓度的胰岛素、胰高血糖素对体外培养肝细胞IGF󰀁󰀂的影响󰀁取接种于6孔培养板的12h的贴壁良好的肝细胞,加入胰岛素终浓度分别为:0、1、10、100、1000 mol/L及胰高血糖素分别为0、1、10、100、500ng/L的无血清的RPMIMedium10培养液,每个浓度3个重复。待培养8h后倒掉培养液,分别用RNA提取试剂盒提取总RNA。用RNAcaculater测定浓度及纯度,调节总RNA浓度为大体一致,再以1.4.2式作反转录,以此cDNA2+

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为模板分别做PEPCK扩增条件优化。确定IGF󰀁󰀂基因最佳循环数为30,温度为59%;󰀁󰀁actin基因最佳循环数为28,温度为57%。

分别以相同浓度的cDNA在优化的条件下扩增󰀁󰀁actin、IGF󰀁󰀂,取相同体积的PCR产物,电泳,拍照,用凝胶分析软件分析后计算灰度比值,再进行统计学分析,分析结果以大写字母表示差异极显著。

2󰀁结果

2.1󰀁IGF󰀁󰀂的克隆及鉴定󰀁RT󰀁PCR成功扩增出1条200bp的片段(图1),与预期设计相符。双酶切结果得到259bp片段也与预期符合(图2)。

图3󰀁󰀁󰀁actin基因RT󰀁PCR扩增结果󰀁M.MarkerDL2000;

1.RT󰀁PCRAmplificationofmRNAof󰀁󰀁actingene

图1󰀁IGF󰀁󰀂基因mRNA的RT󰀁PCR扩增结果󰀁M.Marker

DL2000;1.RT󰀁PCRAmplificationofmRNAofIGF󰀁󰀂gene

图4󰀁质粒的扩增及󰀁󰀁actin基因的双酶切图󰀁M.Marker

DL2000;1.PCRAmplificationofIGF󰀁󰀂plasmid;2.Enzyme󰀁cut󰀁󰀁actinplasmid

图2󰀁质粒双酶切结果󰀁M.MarkerDL2000;1.PCRAmpli󰀁

ficationofIGF󰀁󰀂plasmid;2.Enzyme󰀁cut󰀁󰀁actinplas󰀁mid

图5󰀁胰岛素处理的肝细胞IGF󰀁󰀂基因PCR电泳结果󰀁

M.MarkerDL2000;0~4.0、1、10、100、1000 mol/L

2.2󰀁内源性竞争模板(󰀁󰀁actin)的克隆及鉴定󰀁从

反转录产物中成功扩增出1条351bp的片段(图3),双酶切结果为阳性(图4)。

2.3󰀁胰岛素及胰高血糖素处理的肝细胞的IGF󰀁󰀂、󰀁󰀁actin基因的RT󰀁PCR󰀁见图5、6。

由图5、6的扫描结果得不同浓度INS处理组间IGF󰀁󰀂mRNA带与󰀁󰀁actin带强度乘面积的比例(表1)。󰀁󰀁表1󰀁不同浓度INS处理组间IGF󰀁󰀂mRNA带与

󰀁󰀁actin带强度乘面积的比例

组别处理组1处理组2处理组3对照组INS( mol)L-1)

00.5710.6760.3470.530A10.8170.9870.70.83B101.4031.4581.3241.395C1001.7191.91.6781.7953D10002.22.3762.2562.2953E󰀁中国兽医学报󰀁2009年6月󰀁第29卷󰀁第6期󰀁ChinJVetSci󰀁Jun.2009󰀁Vol.29󰀁No.6󰀁

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图6󰀁胰岛素处理的肝细胞󰀁󰀁actin基因PCR电泳结果

M.MarkerDL2000;0~4.0、1、10、100、1000 mol/L

图8󰀁高血糖素处理的肝细胞󰀁󰀁actin基因PCR电泳结果󰀁

M.MarkerDL2000;0~4:0、1、10、100、500ng/L󰀁󰀁表2󰀁不同浓度GN处理组间IGF󰀁󰀂mRNA带与

󰀁󰀁actin带强度乘面积的比例

组别处理组1

处理组2处理组3对照组

GN/(ng)L-1)

00.5710.6760.3470.531A

10.4390.4560.4450.447A

100.2310.2370.2450.238B

1000.2160.2180.2100.215B

5000.2090.2030.2060.206B

󰀁󰀁由表1可见,随着外源性添加胰岛素浓度的升高,犊牛单层培养的肝细胞中IGF󰀁󰀂mRNA的表达成明显的上升趋势,而且试验组均高于对照组,同时各组之间存在浓度依耐性。各浓度之间的差异极显著(P<0.01)。当胰岛素的浓度高达1000 mol/L时,IGF󰀁󰀂mRNA的表达仍然未被抑制。结果显示胰岛素极显著上调了IGF󰀁󰀂mRNA的表达。2.4󰀁胰高血糖素处理的肝细胞的IGF󰀁󰀂、󰀁󰀁actin基因的RT󰀁PCR󰀁由图7、8的扫描结果得不同浓度GN处理组间IGF󰀁󰀂mRNA带与󰀁󰀁actin带强度乘面积的比例(表2)。

由表2可见,随胰高血糖素浓度的增加,单层培养的犊牛肝细胞中的IGF󰀁󰀂mRNA的表达成下降趋势,高血糖的质量浓度在1~10ng/L,IGF󰀁󰀂mRNA表达下降最明显。质量浓度在10~500ng/L时,IGF󰀁󰀂mRNA表达下降幅度降低。各添加胰高血糖素组均低于试验组的IGF󰀁󰀂mRNA表达量,且试验组中除低质量浓度(1ng/L)外的胰高血糖素添加组与对照组之间差异极显著。各试验组之间,高质量浓度组(10、100、500ng/L)无差异(P>0.05)结果表明,胰高血糖素组抑制了IGF󰀁󰀂mRNA的表达。

3󰀁讨论

胰岛素和胰岛素样生长因子都是降低血糖的因子,而胰高血糖素是与之作用相反的因子。三者在机体内的浓度比例与机体的机能状态相关。当机体的血糖升高到一定的水平时,为调节血糖至正常生理水平,胰岛素分泌增加;同时由肝脏释放的IGF󰀁󰀂也相对增加。相反,胰腺A细胞活性更强,胰高血糖素分泌增加[9󰀁10]。

本试验中胰岛素的添加使得IGF󰀁󰀂的表达量上升,可能因为:在动物机体内,INS水平升高时,其降糖作用效率过高,可能使得血糖突然下降到较低水平。为适应机体的反应,胰高血糖素浓度升高,血糖水平回升,此时可能因为在上调时占主导位置,使得血糖相对过高。所以与胰岛素作用相类似IGF󰀁󰀂为补偿胰岛素带来的继发效应而相对上调。但IGF󰀁󰀂与胰岛素相比,其作用过程中作用效率更

弱,缓冲作用较强,所以在量变过成中为维持一定的血糖水平而表现明显的上升趋势。Shingu等

[11]

对

已经产9胎次的奶牛注射INS,在产前21d到产后28d进行血液中和肝脏中IGF󰀁󰀂的表达情况监测,

图7󰀁胰高血糖素处理的肝细胞IGF󰀁󰀂基因PCR电泳结果

󰀁M.MarkerDL2000;0~4.0、1、10、100、500ng/L

结果表明INS的注射明显上调血液中的IGF󰀁󰀂水

平和肝脏中的mRNA。同时INS上调IGF󰀁󰀂的水平与能量水平和生理期依耐性无相关性。Breier792等

[12]

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报道当INS作用于模拟体内环境培养的肝细

胞后,血糖水平下降,IGF󰀁󰀂mRNA水平上升。因

为胰岛素与IGF󰀁󰀂都能与胰岛素受体结合起到降糖效应[13],二者之间可能存在竞争机制,即当胰岛素的作用效果占主导位置时,游离的IGF󰀁󰀂增加。

添加胰高血糖素导致的IGF󰀁󰀂表达量下降,可能因为:高血糖和外源性添加胰高血糖素能抑制生长激素(GH)的表达

[14]

。而GH和IGF󰀁󰀂在机体

内的比例是平衡的,当GH的表达量下降时,肝脏产生和释放IGF󰀁的量减少。同时当胰高血糖素出现时,GH对肝细胞的促生长作用受到影响,肝细胞产生IGF󰀁󰀂的能力将下降。另外在胰高血糖素出现时,胰腺B细胞分泌的INS的表达被诱导,此时可能INS相对不足,需与IGF󰀁󰀂共同作用影响血糖水平,使得机体维持正常的血糖水平

[15󰀁16]

。但是

INS的下调血糖浓度是有时间期限的,在试验初期的胰高血糖素浓度相对较低时,血糖浓度没有过度升高,对INS的上调作用还不明显,因此此时的IGF󰀁󰀂表达的抑制不是太显著;但是当在中间浓度时,可能上调血糖浓度达最高峰,因此对INS的调节最为明显,作为降糖补偿效应的IGF󰀁󰀂此时浓度的下降率最大;随高血糖浓度增加,相应的降糖效应与低浓度时类似,从而曲线又表现为下降率降低。总之胰高血糖素对IGF󰀁󰀂的影响是通过对INS和GH的影响来达到效果。参考文献:

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