运用分子生物检测法提高柑橘黄龙病检测效率

W 橘黄龙病属于全球范围内一种破坏性较强的病害，做 好早期诊断工作，寻求更加准确、便捷、高效的检测

术，让PCR实现了从定性到定量的飞跃。借助于定量PCR技 术进行检测，发现带菌柑橘木虱的病原含量较多，其次是 溶解曲线来进行特异性检测，具有简单迅速、灵敏度高的 优势。技术，对于防范此病具有非常重要的意义。对于柑橘黄龙 长春花，最后是柑橘。这一检测技术无需电泳，直接利用

为黄龙病的症状较为复杂，同时很可能和其他病症混淆， 因此仅能作为初步诊断法；而选择显微镜观察法对于样本 的选取存在一定，可能存在漏检的情况；血清鉴别技 术因为单克隆抗体专一性较强，无法适用于不同地区的黄

三、 巢式PCR巢式PCR检测技术是在传统PCR技术的基础上逐渐演变

龙病菌变异菌株，也容易存在漏检的问题，必须综合选择 不同的单抗组合；DNA杂交判别法依靠核酸检测更加便捷 灵敏，但检测成本相对较高，不适合大规模推广，因此近

而来的，包括两轮PCR反应，首轮PCR反应的扩增引物和传

统PCR相同，次轮PCR反应利用巢式引物在首轮PCR产物内部 进行短片段扩增。若首轮PCR产物是由于错配而岀现的非特 异性扩增，在次轮PCR反应中往往难以被扩增，同时若由于

年来，分子生物学检测法已在柑橘黄龙病检测中应用得较 为成熟。病原含量不高，在首轮PCR反应时扩增不明显，借助于次轮

下面介绍几种常见的柑橘黄龙病分子检测方法。PCR扩增必然会扩大含量，进而达到检出水平。所以，巢式 PCR检测技术不但能够提升扩增特异性，还能够有效提高检

测灵敏度。一、核酸探针检测这一检测技术是按照病原序列制备标记探针，和被检测

样品单链DNA在某种特定环境条件下按碱基互补原成双链，

四、 环介导恒温技术环介导恒温技术（LAMP）区别于传统PCR扩增DNA目

借助于标记探针放射自显影或者尼龙膜显影来找出病原。上 世纪九十年代之后，国外研究人员分别对亚洲与非洲的黄龙

病病原设计了32P标记的In-2.6以及As-1.7探针，在针对亚洲与 非洲黄龙病菌DNA分子杂交实验中了解到，两者对于全部黄

的片段法，此技术依托于病原物已知序列中的6个特异性保 守区域（3'端的F3c, F2c, Flc区与5，端的Bl, B2, B3 区）设计两对引物，在恒温环境下产生扩增反应，基因扩 增与产物的检测能够实现同步进行。反应完成后，按照扩 增产物中形成的白色沉淀物焦磷酸镁，亦或是反应体系中

龙病亚洲株系检测结果表现为阳性，但In-2.6对非洲种特异性 差，在不严格洗脱下依旧能够检测到略微较弱的杂交信号。 同时选择两种探针对南非黄龙病进行检测，结果表明ln-2.6的

添加SYBR Green 1之后，在紫外灯以及日光下依靠肉眼观察 扩增产物颜色能够进行判断，无需电泳。现阶段，这一技 术已经普遍应用到植物病毒、细菌以及真菌性病害的检验 检疫实验中，同时表现出非常好的发展前景。但该技术也

结果都属于阴性，而As-1.7的结果都属于阳性，由此证明这一

检测方法特异性较高。分子杂交技术应用在病害检测工作中是完全可行的，然

而在实验时探针制备工作与杂交反应条件相对复杂，同时需 要大量病原菌DNA,探针同位素标记会危害人体健康.也影 响到该检测技术的大面积推广，目前已经很少应用。有一些问题，如引入设计要求相对较高、预期扩增靶序列 片段长度不能大于3OObp、特异性引物筛选相对复杂，同时 此反应扩增仅仅有扩增和未扩增两种情况，如果出现非特 异性扩增，则难以对结果进行区分，因此还有待在未来的

二、荧光定量PCR传统的PCR技术无法对柑橘黄龙病病原菌实现非常准 确的定量，同时可能因为交叉污染而导致产生假阳性的情

工作中不断研究完善。（项目课题：柑橘黄龙病快速检测 体系研发与应用（合同编号：2017-2-10316 ）;健康产业

的质量安全创新技术服务项目（2017年度南宁市高层次创新 创业人才项目））厲况，为处理好定量的问题，慢慢形成了实时荧光定量PCR技