议500万细胞加入1mL试剂一),冰浴超声波破碎细胞(功率300w,超声3秒,间隔7秒,总时间3min);然后8000g,4℃,离心10min,取上清置于冰上待测。二、测定操作:1.2.3.分光光度计预热30min,调节波长到680nm,蒸馏水调零。试剂二、试剂三和试剂四置于30℃水浴保温30min。对照管:取一支EP管,加入100μL粗酶液,200μL试剂二,混匀后置于30℃水浴保温10min;加入200μL试剂三,混匀后8000g,4℃离心10min;取200μL上清液,加入新的EP管,再加入1000μL试剂四,200μL试剂五,混匀后置于30℃水浴保温20min,于680nm测定光吸收,记为A对照管。4.测定管:取一支EP管,加入100μL粗酶液,200μL试剂三,混匀后置于30℃水浴保温10min;加入200μL试剂二,混匀后8000g,4℃离心10min;取200μL上清液,加入新的EP管,再加入1000μL试剂四,200μL试剂五,混匀后置于30℃水浴保温20min,于680nm测定光吸收,记为A测定管。(注意与空白管不同,先加试剂三,后加试剂二)5.空白管:取EP管,加入200μL蒸馏水,1000μL试剂四,200μL试剂五,混匀后置于30℃水浴保温20min,于680nm测定光吸收,记为A空白管。6.标准管:取EP管,加入200μL标准品,1000μL试剂四,200μL试剂五,混匀后置于30℃水浴保温20min,于680nm测定光吸收,记为A标准管。注意:空白管和标准管只需要测定一次。三、ACP活性计算公式:1.按照蛋白浓度计算ACP活性单位定义:30℃每毫克蛋白每分钟催化水解产生1nmol酪氨酸为1个酶活单位。http://www.solarbio.comACP活性(nmol/min/mgprot)=C标准品×(A测定管-A对照管)÷(A标准管-A空白管)×稀释倍数÷(Cpr×V1)÷T=625×(A测定管-A对照管)÷(A标准管-A空白管)÷CprC标准品:0.25μmol/mL标准酪氨酸溶液;稀释倍数:(100+200+200)÷200=2.5;Cpr:粗酶液蛋白质浓度(mg/mL),注意该粗酶液不能直接用于蛋白质含量测定,需要另外测定;建议称取同样质量的样品,加入1mL蒸馏水匀浆提取离心后,用本公司蛋白质含量测定试剂盒测定;V1:加入反应体系中粗酶液体积(mL),100μL=0.1mL;T:催化反应时间(min),10min。2.按照样本质量计算ACP活性单位定义:30℃每克样品每分钟催化水解产生1nmol酪氨酸为1个酶活单位。ACP活性(nmol/min/g)=C标准品×(A测定管-A对照管)÷(A标准管-A空白管)×稀释倍数÷(W×V1÷V2)÷T=625×(A测定管-A对照管)÷(A标准管-A空白管)÷WC标准品:0.25μmol/mL标准酪氨酸溶液;稀释倍数:(100+200+200)÷200=2.5;W:样品质量(g);V1:加入反应体系中粗酶液体积(mL),100μL=0.1mL;V2:粗酶液总体积(mL),1mL;T:催化反应时间(min),10min。3.按照液体体积计算ACP活性单位定义:30℃每毫升样品每分钟催化水解产生1nmol酪氨酸为1个酶活单位。ACP活性(nmol/min/mL)=C标准品×(A测定管-A对照管)÷(A标准管-A空白管)×稀释倍数÷V1÷T=625×(A测定管-A对照管)÷(A标准管-A空白管)C标准品:0.25μmol/mL标准酪氨酸溶液;稀释倍数:(100+200+200)÷200=2.5;V1:加入反应体系中血清或培养液体积,100μL=0.1mL;T:催化反应时间,10min。4.按照细胞数量计算4
ACP活性单位定义:30℃每10个细胞每分钟催化水解产生1nmol酪氨酸为1个酶活单位。ACP活性(nmol/min/10cell)=C标准品×(A测定管-A对照管)÷(A标准管-A空白管)×稀释倍数÷(细胞数量×V1÷V2)÷T=625×(A测定管-A对照管)÷(A标准管-A空白管)÷细胞数量4
http://www.solarbio.comC标准品:0.25μmol/mL标准酪氨酸溶液;稀释倍数:(100+200+200)÷200=2.5;V1:加入反应体系中粗酶液体积,100μL=0.1mL;V2:粗酶液总体积,1mL;T:催化反应时间,10min。注意事项:1、临用前配制的试剂配置好后3天内使用完毕。
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