酸性蛋白酶(Acid Protease,ACP)试剂盒使用说明

议500万细胞加入1mL试剂一），冰浴超声波破碎细胞（功率300w，超声3秒，间隔7秒，总时间3min）；然后8000g，4℃，离心10min，取上清置于冰上待测。二、测定操作：1.2.3.分光光度计预热30min，调节波长到680nm，蒸馏水调零。试剂二、试剂三和试剂四置于30℃水浴保温30min。对照管：取一支EP管，加入100μL粗酶液，200μL试剂二，混匀后置于30℃水浴保温10min；加入200μL试剂三，混匀后8000g，4℃离心10min；取200μL上清液，加入新的EP管，再加入1000μL试剂四，200μL试剂五，混匀后置于30℃水浴保温20min，于680nm测定光吸收，记为A对照管。4.测定管：取一支EP管，加入100μL粗酶液，200μL试剂三，混匀后置于30℃水浴保温10min；加入200μL试剂二，混匀后8000g，4℃离心10min；取200μL上清液，加入新的EP管，再加入1000μL试剂四，200μL试剂五，混匀后置于30℃水浴保温20min，于680nm测定光吸收，记为A测定管。（注意与空白管不同，先加试剂三，后加试剂二）5.空白管：取EP管，加入200μL蒸馏水，1000μL试剂四，200μL试剂五，混匀后置于30℃水浴保温20min，于680nm测定光吸收，记为A空白管。6.标准管：取EP管，加入200μL标准品，1000μL试剂四，200μL试剂五，混匀后置于30℃水浴保温20min，于680nm测定光吸收，记为A标准管。注意：空白管和标准管只需要测定一次。三、ACP活性计算公式：1.按照蛋白浓度计算ACP活性单位定义：30℃每毫克蛋白每分钟催化水解产生1nmol酪氨酸为1个酶活单位。http://www.solarbio.comACP活性（nmol/min/mgprot）=C标准品×（A测定管－A对照管）÷（A标准管－A空白管）×稀释倍数÷（Cpr×V1）÷T=625×（A测定管－A对照管）÷（A标准管－A空白管）÷CprC标准品：0.25μmol/mL标准酪氨酸溶液；稀释倍数：（100+200+200）÷200=2.5；Cpr：粗酶液蛋白质浓度（mg/mL），注意该粗酶液不能直接用于蛋白质含量测定，需要另外测定；建议称取同样质量的样品，加入1mL蒸馏水匀浆提取离心后，用本公司蛋白质含量测定试剂盒测定；V1：加入反应体系中粗酶液体积（mL），100μL=0.1mL；T：催化反应时间（min），10min。2.按照样本质量计算ACP活性单位定义：30℃每克样品每分钟催化水解产生1nmol酪氨酸为1个酶活单位。ACP活性（nmol/min/g）=C标准品×（A测定管－A对照管）÷（A标准管－A空白管）×稀释倍数÷（W×V1÷V2）÷T=625×（A测定管－A对照管）÷（A标准管－A空白管）÷WC标准品：0.25μmol/mL标准酪氨酸溶液；稀释倍数：（100+200+200）÷200=2.5；W：样品质量（g）；V1：加入反应体系中粗酶液体积（mL），100μL=0.1mL；V2：粗酶液总体积（mL），1mL；T：催化反应时间（min），10min。3.按照液体体积计算ACP活性单位定义：30℃每毫升样品每分钟催化水解产生1nmol酪氨酸为1个酶活单位。ACP活性（nmol/min/mL）=C标准品×（A测定管－A对照管）÷（A标准管－A空白管）×稀释倍数÷V1÷T=625×（A测定管－A对照管）÷（A标准管－A空白管）C标准品：0.25μmol/mL标准酪氨酸溶液；稀释倍数：（100+200+200）÷200=2.5；V1：加入反应体系中血清或培养液体积，100μL=0.1mL；T：催化反应时间，10min。4.按照细胞数量计算4

ACP活性单位定义：30℃每10个细胞每分钟催化水解产生1nmol酪氨酸为1个酶活单位。ACP活性（nmol/min/10cell）=C标准品×（A测定管－A对照管）÷（A标准管－A空白管）×稀释倍数÷（细胞数量×V1÷V2）÷T=625×（A测定管－A对照管）÷（A标准管－A空白管）÷细胞数量4

http://www.solarbio.comC标准品：0.25μmol/mL标准酪氨酸溶液；稀释倍数：（100+200+200）÷200=2.5；V1：加入反应体系中粗酶液体积，100μL=0.1mL；V2：粗酶液总体积，1mL；T：催化反应时间，10min。注意事项：1、临用前配制的试剂配置好后3天内使用完毕。