膜片钳系统简介

膜片钳系统简介

一、膜片钳系统简介：

膜片钳系统包括：放大器和数模转换器系统、显微成像系统、灌流系统、屏蔽减震系统，其中核心系统是放大器和数模转换系统。放大器和数模转换系统现在国际上常用的有两家公司生产：德国heka和美国axcon，其中双通道分别为heka的EPC10和AXCON的700B。heka公司是发明膜片钳的公司，放大器和数模转换器整合在一个模块中，信噪比高，技术先进，但价格较贵，操作系统复杂；AXCON公司放大器和数模转换器是分开的两个模块，信噪比稍差，但性价比高，操作系统入手容易，可以完成绝大多数细胞脑片的电生理记录，因此市场占有率较高。

AXCON的700B机器分为放大器（Muliclamp 700B）和数模转换器（Digidata 1440A）两个模块。其中放大器的具体参数为：电脑化双通道电阻反馈高速电流钳放大器，自动的电容，电阻补偿。软件控制放大器的增益、滤波、全细胞电容补偿、记录模式等。噪音： 带宽1kHz时的开路噪声15毫微微安陪以下，5kHz时的开路噪声60毫微微安陪以下，10kHz时的开路噪声最大130毫微微安陪。带宽最大可达100kHz。电容补偿100PF（β=1）或1000pF（β=0.1）。数模转换器的具体参数为：16位自适应数据采集系统, 16个模拟信号输入通道和2个模拟信号输出通道，16个数字信号输入通道和2个数字信号输出通道，4个外部设备信号输入通道，1个起始触发和1个记录触发。输入信号范围+/-10V，噪声小于+/-1mV，最大采样率500kHz。

二、膜片钳技术发展史：

1976年德国马普生物物理化学研究所Neher和Sakmann首次在青蛙肌细胞上用双电极钳制膜电位的同时，记录到ACh激活的单通道离子电流，从而产生了膜片钳技术。

1980年Sigworth等在记录电极内施加5-50 cmH2O的负压吸引，得到10-100GΩ的高阻封接（Giga-seal），大大降低了记录时的噪声实现了单根电极既钳制膜片电位又记录单通道电流的突破。

1981年Hamill和Neher等对该技术进行了改进，引进了膜片游离技术和全细胞记录技术，从而使该技术更趋完善，具有1pA的电流灵敏度、1μm的空间分辨率和10μs的时间分辨率。

1983年10月，《Single-Channel Recording》一书问世，奠定了膜片钳技术的里程碑。Sakmann 和Neher也因其杰出的工作和突出贡献，荣获1991年诺贝尔医学和生理学奖。

三、膜片钳技术原理：

1、概念介绍：

在介绍膜片技术之前，先简单的介绍一下什么使电流钳和电压钳技术。简单的说，向细胞内注射恒定或变化的电流刺激，记录由此引起的膜电位的变化，这就是电流钳技术。它可以模拟细胞真实的自然情况，如神经冲动的传递过程中，神经递质的释放可引起神经元膜电位的去极化或超极化。在具体实验中，可通过给予细胞一系列电流脉冲刺激，诱发细胞产生电紧张点位、动作电位等；电压钳技术是通过向细胞内注射一定的电流，抵消离子通道开放时所产生的离子流，从而将细胞膜电位固定在某一数值。由于注射电流的大小和离子流的大小相同、方向相反，因此它可以反应离子流的大小和反向。电压钳技术是一个负反馈系统，在双电极电压钳记录中，一根电极用于监测细胞膜电位，另外一根电极用于注射电流，当所

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医学Rs是由电极和细胞之间的通路所构成的串联电阻，会引起全细胞电压钳记录的点钳制问题，这可通过Rs Comp回路来消除。电极入液之后会产生所谓的“快电容”Cp，即内外液相对于电极壁形成的杂散电容，在形成GΩ封接后变得更明显。而当吸破细胞膜形成全细胞模式后，还能观测到“慢电容”Cm，即对于细胞膜的充放电而产生的电容电流。可以通过电容补偿回路来消除这些电容尖峰的影响。由于阻容藕合电路中电阻和电容值的不同，快慢电容的幅度和时间常数都不同。对于有突起的细胞如脑片中的神经元，还存在空间钳制问题，这就难以从电路上消除它的不利影响。

全细胞膜片钳模式下有电压钳记录和电流钳记录两种。电压钳记录的原理与电压钳技术相似，但有所不同：首先，全细胞电压钳记录只使用单根电极，但在电学效果上同时实现了电压钳制和电流记录。其次，电压钳记录的电极不插进细胞，对细胞造成的损伤较小，因而能用于小细胞如神经元的研究。电流钳记录则是通过钳制电极电流来测量膜电位。电流钳在本质上也是电压钳位，它将差分放大器的输出电流与指令电流相比较，然后将这个差动输出施加到放大器前级的倒相端，通过高速反馈使得同相端的电压与其相等，无论电极电流是否为零，都能从输出电压得到膜电位的准确数值。

根据细胞膜的电路模型，全细胞模式还可用于监测膜电容的变化。当通过电极给细胞膜

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监测的膜电位偏离钳制电位时，通过向细胞内注射电流可纠正这一偏差，从而维持细胞膜电位不变。在单电极电压钳记录中，监测电压与注射电流都采用同一电极（现都用单电极记录）。

膜片钳技术和电压钳、电流钳技术在命名上并不一致，后者是从电学概念的角度命名的，而“膜片钳”主要是从机械物理的角度命名的。从字面上理解，膜片钳技术钳制的“膜片”是指采用检点经过处理的微电极与细胞膜发生紧密接触，使尖端下的这片细胞膜在电学上与其他细胞膜分离，这大大降低了背景噪音，使单通道微弱的电流得以分辨出来。此外，膜片钳技术之所以能够记录到非常微弱的单通道离子电流，除了因为电极与细胞膜之间形成的紧密接触外，还得靠特殊设计的低噪声膜片钳放大器。采用电压钳技术将这片细胞膜的电位钳制在某一数值，可记录到单通道电流。从这点上看，膜片钳技术是特殊的电压钳技术，可记录到流经单通道的电流。后来，随着膜片钳技术的发展，它已经不仅仅局限于“膜片”的概念，出现了全细胞记录等其他模式，而且也不仅仅采用电压钳技术，还常用电流钳技术。在理解膜片钳的概念时候不能将膜片钳技术与电流钳、电压钳技术完全分隔开，实际上在使用膜片钳技术时不可避免的要使用电压钳或电流钳技术，膜片钳放大器也就是电流钳/电压钳放大器。

2、原理介绍

膜片钳技术的基本原理是通过负反馈使得膜电位与指令电压相等，在电压钳制的条件下记录膜电流。上面是电阻反馈式膜片钳放大器的电路示意图。A1为一极高输入阻抗、极低噪声的场效应管运算放大器，由于A1极高的开环增益使得两个输入端的电压几乎完全相等，从而实现电压钳制。Rf为一数值可切换的反馈电阻，分别对应于不同的电流记录范围，其中高值反馈电阻具有极高的电阻和极低的杂散电容，是决定放大器单通道记录性能的基本元件。A2为一差分放大器，它的输出即为电极电流和反馈电阻的乘积。由放大器A1和A2构成的回路称为电流—电压转换器，是膜片钳放大器前级（headstage）的核心。

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一个高频正弦波时，由于膜电容的存在，膜电阻的反应会有一个明显的相位滞后，这个时间延迟由膜电容、膜电阻和电极电阻三者决定。当后面两个因素固定时，膜电容的变化就会引起膜电阻反应与输入之间的相位差的变化。对于各种分泌细胞：胰岛细胞、肾上腺分泌细胞或神经分泌细胞，细胞的分泌伴随着膜表面积也就是膜电容的变化，可以通过监测相位差的变化来观测细胞的分泌过程。

单通道记录的关键在于降低背景噪声。电阻反馈式放大器存在两个问题：一是反馈电阻本身的热噪声；另一个是反馈电阻本身的杂散电容。对于前者，当采用大电阻值反馈电阻时，就能将热噪声降低到可以接受的范围。但反馈电阻的杂散电容与电阻形成一个低通滤波器，按照现在的工业标准（50G，0.1pF），这个滤波器会使采集到的单通道信号严重失真。对于这个问题，可以采用一个高频提升器（high frequency boost），信号经过这样的处理就会引入高频噪声，因此必须经过低通模拟滤波。

1976年在封接电阻只有10—20MΩ的情况下，记录了蛙去神经支配的肌纤维膜乙酰胆碱受体的单通道电流，由于背景噪声的影响，单通道电流矩形脉冲的形状很不明显。若要记录单个离子通道的微弱电流，就必须将噪声降低到极小，但按照‘Johnson’公式，由带电粒子的热运动所引起的电流噪声为：Irms = (4kTfc/R)1/2，因此就必须极大地提高电阻。因为放大器输入阻抗、膜片电阻和反馈电阻都很高，所以必须极大地提高封接电阻。

后来发现当略施负压之后封接电阻很快上升到了GΩ的范围，背景噪声急剧下降，使得高分辨率的单通道记录变为可能。随后Hamill和Horn等人将小块膜片从细胞膜上分离下来而不影响封接，这样就形成了单通道记录的三种模式：细胞贴附式、内面向外式、外面向外式，连同全细胞模式于是便有了膜片钳的四种经典记录模式。Hamill等人在1981年发表的奠基性论文标志着膜片钳技术的成熟，随后在全世界各个生理学、神经生物学和生物物理学实验室得到了广泛的应用，极大地推动了离子通道和相关学科的研究。

3、细胞膜的电学模型

用膜片钳技术记录细胞的电流或电压变化首先要将可兴奋的细胞膜想象成一个电学模型：细胞膜由脂类双分子层和和蛋白质构成。脂质层的电导很低，由于双分子层的结构特点，形成了细胞的膜电容，通道蛋白的开闭状况主要决定了膜电导的数值。在细胞膜的电学模型中，膜电容和膜电导构成了一个并联回路。在细胞膜的电兴奋过程中，脂质层膜电容的反应是被动的，其电流电压曲线是线性的；而由通道蛋白介导的膜电导构成了膜反应的主动成分，它的电流电压关系是非线性的。当改变跨膜电位时，膜电容和膜电导分别引发被动和主动电流：Im=Ii＋CdV/dt，其中Im是流过膜的总电流，Ii是通道电流，CdV/dt是由膜电容介导的电容电流。为了考察通道电流就必须消除电容电流的影响，此时可以令dV/dt＝0，即将膜电位钳制在一固定数值，使其不随时间变化，这就是电压钳技术的实质所在。

四、膜片钳技术的记录方式（如下图）：

1、细胞贴附记录 2、全细胞记录 3、outside-out记录 4、inside-out记录

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五、膜片钳技术的应用

1、应用学科

膜片钳技术发展至今，已经成为现代细胞电生理的常规方法，它不仅可以作为基础生物医学研究的工具，而且直接或间接为临床医学研究服务，目前膜片钳技术广泛应用于神经（脑）科学、心血管科学、药理学、细胞生物学、病理生理学、中医药学、植物细胞生理学、运动生理等多学科领域研究。随着全自动膜片钳技术（Automatic patch clamp technology）的出现，膜片钳技术因其具有的自动化、高通量特性，在药物研发、药物筛选中显示了强劲的生命力。

2、应用的标本种类

使用的标本种类繁多。从最早的肌细胞（心肌、平滑肌、骨骼肌）、神经元和内分泌细胞发展到血细胞、肝细胞、耳窝毛细胞、胃壁细胞、上皮细胞、内皮细胞、免疫细胞、精母细胞等多种细胞；从急性分散细胞和培养细胞（包括细胞株）发展到组织片（如脑片、脊髓片）乃至整体动物；从蜗牛、青蛙、蝾螈、爪蟾卵母细胞发展到鸡细胞、大鼠细胞、人细胞等等；从动物细胞发展到细菌、真菌以及植物细胞。此外，膜片钳技术还广泛地应用到平面双分子层（Planar bilayer）、脂质体（Liposome）等人工标本上。

3、研究对象

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研究对象已经不局限于离子通道。从对离子通道（配体门控性、电压门控性、第二信使介导的离子通道、机械敏感性离子通道以及缝隙连接通道等等）的研究发展到对离子泵、交换体以及可兴奋细胞的胞吞、胞吐机制的研究等。

4、应用举例：

(1). 膜片钳技术在通道研究中的重要作用

应用膜片钳技术可以直接观察和分辨单离子通道电流及其开闭时程、区分离子通道的离子选择性、同时可发现新的离子通道及亚型，并能在记录单细胞电流和全细胞电流的基础上进一步计算出细胞膜上的通道数和开放概率，还可以用以研究某些胞内或胞外物质对离子通道开闭及通道电流的影响等。同时用于研究细胞信号的跨膜转导和细胞分泌机制。结合分子

克隆和定点突变技术，膜片钳技术可用于离子通道分子结构与生物学功能关系的研究。 利用膜片钳技术还可以用于药物在其靶受体上作用位点的分析。如神经元烟碱受体为配体门控性离子通道，膜片钳全细胞记录技术通过记录烟碱诱发电流，可直观地反映出神经元烟碱受体活动的全过程，包括受体与其激动剂和拮抗剂的亲和力，离子通道开放、关闭的动力学特征及受体的失敏等活动。使用膜片钳全细胞记录技术观察拮抗剂对烟碱受体激动剂量效曲线的影响，来确定其作用的动力学特征。然后根据分析拮抗剂对受体失敏的影响，拮抗剂的作用是否有电压依赖性、使用依赖性等特点，可从功能上区分拮抗剂在烟碱受体上的不同作用位点，即判断拮抗剂是作用在受体的激动剂识别位点，离子通道抑或是其它的变构位点上。

(2).与药物作用有关的心肌离子通道

心肌细胞通过各种离子通道对膜电位和动作电位稳态的维持而保持正常的功能。近年来，国外学者在人类心肌细胞离子通道特性的研究中取得了许多进展，使得心肌药理学实验由动物细胞模型向人心肌细胞成为可能。

(3).对离子通道生理与病理情况下作用机制的研究

通过对各种生理或病理情况下细胞膜某种离子通道特性的研究，了解该离子的生理意义及其在疾病过程中的作用机制。如对钙离子在脑缺血神经细胞损害中作用机制的研究表明，缺血性脑损害过程中，Ca2+ 介导现象起非常重要的作用，缺血缺氧使Ca2+通道开放，过多的Ca2+进入细胞内就出现Ca2+超载，导致神经元及细胞膜损害，膜转运功能障碍，严重的可使神经元坏死

(4).对单细胞形态与功能关系的研究

将膜片钳技术与单细胞逆转录多聚酶链是反应技术结合，在全细胞膜片钳记录下，将单细胞内容物或整个细胞（包括细胞膜）吸入电极中，将细胞内存在的各种mRNA全部快速逆转录成cDNA，再经常规PCR扩增及待检的特异mRNA的检测，借此可对形态相似而电活动不同的结果做出分子水平的解释或为单细胞逆转录多聚酶链式反应提供标本，为同一结构中形态非常相似但功能不同的事实提供分子水平的解释。目前国际上掌握此技术的实验室较少，我国北京大学神经科学研究所于1994年在国内率先开展。

(5).对药物作用机制的研究 在通道电流记录中，可分别于不同时间、不同部位（膜内或膜外）施加各种浓度的药物，研究它们对通道功能的可能影响，了解那些选择性作用于通道的药物影响人和动物生理功能的分子机理。这是目前膜片钳技术应用最广泛的领域，既有对西药药物机制的探讨，也广泛用在重要药理的研究上。如开丽等报道细胞贴附式膜片钳单通道记录法观测到人参二醇组皂苷可抑制正常和“缺血”诱导的大鼠大脑皮层神经元L-型钙通道的开放，从而减少钙内流，对缺血细胞可能有保护作用。陈龙等报道采用细胞贴附式单通道记录法发现乌头碱对培养的Wistar大鼠心室肌细胞L-型钙通道有阻滞作用。

(6). 在心血管药理研究中的应用

随着膜片钳技术在心血管方面的广泛应用，对血管疾病和药物作用的认识不仅得到了不

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教研室断更新，而且在其病因学与药理学方面还形成了许多新的观点。正如诺贝尔基金会在颁奖时所说：“Neher和Sadmann的贡献有利于了解不同疾病机理，为研制新的更为特效的药物开辟了道路”。

(7). 创新药物研究与高通量筛选

目前在离子通道高通量筛选中主要是进行样品量大、筛选速度占优势、信息量要求不太高的初级筛选。最近几年，分别形成了以膜片钳和荧光探针为基础的两大主流技术市场。将电生理研究信息量大、灵敏度高等特点与自动化、微量化技术相结合，产生了自动化膜片钳等一些新技术。