第４３卷第４期 ２０１６年１２月 茶叶通讯 ＪｏｕｒｎａｌｏｆＴｅａ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎ Ｖｏ１．４３，Ｎｏ．４ Ｄｅｃｅｍｂｅｒ，２０１６ 茶树叶绿素测定方法的比较研究 向芬，李维，刘红艳，周凌云，丁玎，曾振 （湖南省农业科学院茶叶研究所，湖南长沙４１０１２５） 摘要：为了探讨适合茶树大量样本叶绿素含量测定的方法，本试验综合植物叶绿素的测定方法，以丙酮研磨法为对照， 使用浸提法设置６种提取液（９５％乙醇、８０％丙酮、丙酮：乙醇＿２：１、丙酮：乙醇＝１：２、丙酮：乙醇＝１：１、丙酮： 乙醇：水＝４．５：４．５：１）进行浸提效果试验，并对提取液进行光稳定试验。结果表明：以丙酮：乙醇＝ｌ：２的提取效果好， 光稳定性也较好；丙酮：乙醇＝２：１、丙酮：乙醇＝１：ｌ的次之；单一溶剂以９５％乙醇浸提效果较好。表明测定茶树大 量样本的叶绿素宜选用丙酮：乙醇为１：２的混合液法，该方法操作简便、稳定性好；考虑环保因素，则以９５％乙醇溶 剂浸提法较好。 关键词：茶树；叶绿素；提取；测定方法 中图分类号：￥５７１．１ 文献标识码：Ａ 文章编号：１００９－５２５Ｘ（２０１６）０４－３７－４０ Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎｏｎ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｏｆ Ｃｈｌｏｒｏｐｈｙｌｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｉｎ Ｃａｍｅｌｌｉａ ｓｉｎｅｎｓｉｓ ＸＩＡＮＧ Ｆｅｎ，ＬＩ Ｗｅｉ，ＬＩＵ Ｈｏｎｇ—ｙａｎ，ＺＨＯＵ Ｌｉｎｇ—ｙｕｎ，ＤＩＮＧ Ｄｉｎｇ，ＺＥＮＧ Ｚｈｅｎ （ＴｅａＲｅｓｅａｒｃｈＩｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆＨｕｎａｎＡｃａｄｅｍｙｏｆＡｃａｄｅｍｙｏｆＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｃｈａｎｇｓｈａ４１０１２５，Ｃｈｍａ） Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｉｎ ｏｒｄｅｒ ｔｏ ｆｉｎｄ ｔｈｅ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ ｃｈｌｏｒｏｐｈｙｌｌ ｉｎ ｈｅ ｔｌｅａｖｅｓ ｏｆ Ｃａｍｅｌｌｉａ ｓｉｎｅｎｓｉｓ，ｗｅ ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｄ ｔｈｅ ｍｅｔｈｏｄ ｏｆ ｃｈｌｏｒｏｐｈｙｌｌ ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｉｎ ｏｔｈｅｒｓ ｃｒｏｐ，ｕｓｉｎｇ ａｃｅｔｏｎｅ ｇｒｉｎｄｉｎｇ ｍｅｔｈｏｄ ａｓ ｔｈｅ ｃｏｎｔｒｏｌ，ｔｈｅ ｌｅａｃｈｉｎｇ ｍｅｔｈｏｄ ＷａＳ ｓｅｔ ｕｐ ６ ｔｒｅａｔｍｅｎｔｓ ａｓ ９５％ｅｔｈａｎｏｌ，８０％ａｃｅｔｏｎｅ，ａｃｅｔｏｎｅ：ｅｔｈａｎｏｌ＝２：１，ａｃｅｔｏｎｅ：ｅｔｈａｎｏｌ １：２，ａｃｅｔｏｎｅ：ｅｔｈａｎｏｌ １：１， ａｃｅｔｏｎｅ：ｅｔｈａｎｏｌ：ｗａｔｅｒ－－４．５：４．５：１．ａｎｄ ｗｅ ｔｅｓｔｅｄ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｅｆｆｅｃｔ ａｎｄ ｌｉｇｈｔ ｓｔａｂｉｌｉｔｙ ｉｎ ｔｈｅ ｌｅａｖｅｓ ｏｆ Ｃａｍｅｌｌｉａ ｓｉｎｅｎｓ ． Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅ ｌｅａｃｈｉｎｇ ｍｅｔｈｏｄ ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ ｔｈｅ ｍｉｘｔｕｒｅ ｌｉｑｕｉｄ ｏｆ ｈｅ ａｃｅｔｏｎｅ ａｔｎｄ ｅｔｈａｎｏｌ ｗｉｔｈ ｔｈｅ ｖｏｌｕｍｅ ｒａｔｅ ｏｆ １：２ ｃｏｕｌｄ ｇｅｔ ｔｈｅ ｂｅｓｔ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｅｆｆｅｃｔ ａｎｄ ｌｉｇｈｔ ｓｔａｂｉｌｉｙ ｔｏｎ ｈｅ ｃｈｌｔｏｒｏｐｈｙｌｌ ｉｎ Ｃａｍｅｌｌｉａ ｓｉｎｅｎｓｉｓ，ｔｈｅｎ ｗａｓ ａｃｅｔｏｎｅ： ｅｔｈａｎｏｌ＝２：ｌ ａｎｄ ａｃｅｔｏｎｅ：ｅｔｈａｎｏｌ＝１：１，ｔｈｅ ｓｉｎｇｌｅ ９５％ｅｔｈａｎｏｌ ａｌｓｏ ｇｏｔ ａ ｇｏｏｄ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｅｆｆｅｃｔ．Ｉｎ ｓｕｍｍａｒｙ，ｔｈｅ ｍｅｔｈｏｄ ｏｆ ａｃｅｔｏｎｅ：ｅｔｈａｎｏｌ＝１：２ ｉｓ ｓｕｉａｂｌｔｅ ｆｏｒ ａ ｌａｒｇｅ ｎｕｍｂｅｒ ｏｆ ｓａｍｐｌｅｓ ｏｆ ｈｅ ｃｈｌｏｒｏｐｈｙｌｔｌ ｃｏｎｔｅｎｔ ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｉｎ ｔｅａ ｐｌｎｔ．ｔａｈｅ ｍｅｔｈｏｄ ｉｓ ｅａｓｙ ｔｏ ｏｐｅｒａｔｅ ｎｄ ａｈｉｇｈ ｓａｂｉｔｌｉｙ，ｃｏｎｓｔｉｄｅｒｉｎｇ ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ ｆａｃｔｏｒｓ，９５％ｅｔｈａｎｏｌ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｍｅｔｈｏｄ ｉｓ ｂｅｔｔｅｒ． Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ：Ｃａｍｅｌｌｉａ ｓｉｎｅｎｓｉｓ，Ｃｈｌｏｒｏｐｈｙｌｌ，Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ，Ｄｅｔｅｒｍｉａｔｉｏｎ ｎｍｅｔｈｏｄ 叶绿素是绿色植物进行光合作用的基础物 质，是植物叶片的主要光合色素，其含量的多 少与光合能效的高低有着重要关系，是研究茶 树氮素营养等生理变化的重要指标［１，２１０目前， 测定叶绿素含量主要有分光光度计法和ＳＰＡＤ 叶绿素测定仪法。由于ＳＰＡＤ叶绿素仪测定的 是相对含量，在日常试验中以分光光度计法测 定叶绿素的绝对含量应用最广泛。 植物叶绿素的测定因所用的溶剂不同又有 多种测定方法，国际上广泛采用Ａｒｎｏｎ法【３】。 但该方法由于要先加入石英砂研磨，研磨后又 需过滤、除渣，工作量大，步骤多，不适宜田 收藕日期：２０１６．１１．２８ 修订日期：２０１６．１２．２１ 基金项目：湖南省自然科学基金（２０１６ＪＪ４０５２） 作者简介：向芬（１９８３．），女，湖南邵阳人，助理研究员，主要从事茶树栽培学与生理生化方面的研究。 ３８ 茶叶通讯 １．２测定方法 １．２．１浸提效果试验 第４３卷 间大量样品的提取和测定［４］。张宪政提出了丙酮 乙醇混合液法浸提叶绿素，验证了利用混合液 进行叶绿素浸提的可行性［５ｌ。何丽斯等嘲研究 发现以丙酮：无水乙醇：蒸馏水：４．５：４．５：１的 所选叶片为茶树倒三叶，低温保存。准确 称取０．５ ｇ试材于试管中，剪取叶片成２ⅡｌＩＩｌ×１ 混合液浸提杜鹃叶绿素效果较好。徐芬芬ｐ 等 研究认为，丙酮与乙醇体积比１：１的混合液浸 提小白菜叶绿素效果最好；而麻明友［８】、任红 等［９ 研究结果显示，丙酮与乙醇体积比２：１的 混合液分别浸提猕猴桃、菜心叶绿素效果较好。 前人对植物叶绿素的测定方法因植物种 ｃｍ碎条，在室温下立即用丙酮研磨法和直接浸 提法提取叶绿素，每个处理３次重复。浸提在 黑暗中进行，每管加入浸提液１０ ｍＬ，并定时摇 动，待叶片变白，约１４ ｈ后定容至２５ ｍＬ，测 定吸光度。研磨法参照任红等的方法 。室温 下以相应试剂为参比，分别在６４５ ｎｎａ和６６３ ｎｌｎ 处测定吸光度，由ｍｒｎｏｎ公式计算叶绿素ａ与 叶绿素ｂ的含量。 １．２．２光稳定性试验 类不同结果各异。而茶树叶绿素含量的测定， 徐华等［１川通过研究证明丙酮：无水乙醇：蒸馏水 ：４．５：４．５：１混合液法提取叶绿素效果又快又好； 随后肖润林等 ”、唐茜等 引用徐华等的方法 测定茶树叶绿素含量，唐晓波等［１ 采用丙酮分 光光度法测定不同季节茶叶中叶绿素含量，赵 样品测定后室温曝光放置５ ｈ，测定提取液 中叶绿素的含量。 １．３数据处理 先明等对几种混合液的浸提方法进行了比较， 发现丙酮：乙醇：水＝３：６：１的效果较好，较 叶绿素ａ含量（ｍｇ／ｇ）：Ｃａ＝（１２．７Ａ６６３ 一 ２．６９Ａ６４５ａｍ）×Ｖ／（１０００Ｗ） 丙酮研磨法及其它几种丙酮、乙醇混合液的提 取方法有极显著的差异。本试验在前人研究的 基础上，以丙酮研磨法作为对照，综合植物上 常使用的叶绿素测定方法，对研磨法和浸提法 进行了比较，为田间大批量样本叶绿素含量的 叶绿素ｂ含量（ａｒｇ／ｇ）：Ｃｂ＝（２２．７Ａ６４ 一 ４．６８ ６３ａｍ）×Ｖ／（１０００Ｗ） 叶绿素总含量（ｍｇ／ｇ）：Ｃａ＋ｂ＝Ｃａ＋Ｃｂ 式中：Ａ６６３ｍｎ、Ａ６４５ｍｎ分另Ｕ为６６３ ｈｉｌｌ、６４５ ｎｌＴｌ波长下的吸光度，Ｖ为提取液的体积，ｗ为 叶片的鲜重。 测定提供依据。 １材料与方法 １．１试验材料 利用Ｅｘｃｅｌ ２００３软件对所得数据进行处理， 利用ＤＰＳ１４．５软件进行数据统计与分析。 供试茶树为湖南本地品种碧香早，丙酮、９５％ 乙醇等试剂均为分析纯，试验用水为去离子水。 １．２试验设计 ２结果与分析 ２．１不同浸提液对茶树叶绿素提取效果的影响 由表２可见，不同浸提液的提取效果存在 差异，与对照比，处理Ｃ、Ｄ、Ｅ提取方法的效 采取直接浸提法，设６种处理，以丙酮研 磨法为对照（表１）。 表ｌ不同测定方法设置 １ｅ １ Ｄｉｆｅｒｅｎｔ ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉＯｉｌ ｍｅｔｈｏｄｓ 果较好，其中处理Ｄ较对照好，但效果与对照 差异不显著；其次为Ａ提取方法，Ｂ、Ｆ提取效 果较对照差，差异极显著。 ２．２不同浸提液对茶叶叶绿素光稳定性的影响 由表３可知．采用不同．提取溶 Ｉ提取的茶……， 提取方法 Ａ Ｂ ９５％乙醇浸提 ８０％丙酮浔＝撂……一 Ｃ Ｄ Ｅ Ｆ 丙酮：９５％乙醇＝２：１浸提 丙酮：９５％乙醇＝１：２浸提 丙酮：９５％乙醇＝ｌ：ｌ浸提 乙醇：丙酮：水：＝４．５：４．５：１浸提 丙酮研磨 叶叶绿素，在室温下放置５ ｈ后，叶绿素含量以 Ｄ提取方法的效果较对照好，Ｃ、Ｅ提取方法次 之，Ｂ、Ｆ提取效果较对照差；同时发现，各种 ＣＫ 提取方法均以叶绿素ａ降解较叶绿素ｂ快，Ｃ、Ｄ、 第４期 向芬等：茶树叶绿素测定方法的比较研究 ３９ 表３不同浸提液提取叶绿素含量变化 Ｔａｂｌｅ ３ Ｃｈａｎｇｅｓ ｏｆｃｈｌｏｒｏｐｈｙｌｌ ｃｏｎｔｅｎｔ ｗｉｔｈ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｅｘｔｒａｃｔｓ ａｆｔｅｒ ｅｘｐｏｓｕｒｅ ｔｏ ５ｈ Ｅ提取方法的叶绿素ａ降解较对照慢。 胞破坏少，形成的降解产物较研磨法少，因此 其提取效果及稳定性都较研磨法好。茶叶茶多 酚氧化形成的产物可溶于丙酮和水，干扰比色 ３讨论 选择稳定、高效的叶绿素提取方法有利于 测定，丙酮：乙醇为１：２的混合浸提液由于不 加水，且丙酮比例低，干扰较小，所以其提取 得到准确、可靠的数据。通常进行叶绿素测定 需要进行不同处理以及实验重复的取样，样本 量大，采用研磨法较费时间，且茶叶中的多酚 效果较其它几种丙酮、乙醇及丙酮、乙醇、水 的混合液好。单一溶剂以９５％乙醇浸提效果 较好。 物质在细胞破碎、叶绿体破坏后形成许多的降 解产物，易造成提取液不稳定，长时间放置影 综上所述，茶树大量样本的叶绿素含量检 测宜选用丙酮：乙醇为ｌ：２的混合液进行提取。 由于丙酮为有毒有机溶剂，考虑环保的因素则 响更大，因此大量样本的叶绿素测定采用浸提 法较方便，有研究者还发现影响叶绿素提取效 率的关键是叶绿素ａ的稳定性［４］。前人对植物叶 绿素测定因植物种类不同结果各异，但均发现 丙酮、乙醇混合溶剂浸提效果较好。本试验亦 以９５％的乙醇单一溶剂的浸提效果较好。此外， 光是影响茶树叶绿素稳定性的重要因素，所以 在茶树叶绿素浸提、测定及保存时，要尽量选 择避光处理。 发现丙酮、乙醇混合溶剂提取茶叶叶绿素效果 以及光稳定性均较好，其中以丙酮：乙醇为１：２ 的效果较研磨法好，丙酮：乙醇为２：１、丙酮： 乙醇为１：ｌ的次之，三者与研磨法差异不显著， 这可能是由于丙酮：乙醇为１：２混合液中的叶 参考文献 ［１】薛香，吴玉娥．小麦叶片叶绿素含量测定及其与ＳＰＡＤ值 的关系【Ｊ】．湖北农业科学，２０１０，４９（１１）：２７０１—２７０２，２７５１． ［２】程，董合林，刘爱忠，等．棉花上部叶片叶绿素ＳＰＡＤ 值动态变化研究［Ｊ】．中国农学通报，２０１２，２８（３）：１２１．１２６． 绿素ａ含量降解较对照慢，光稳定好，且由于 不需要进行研磨，只需把叶片剪成小条，对细 茶叶通讯 第４３卷 ［３】王爱玉，张春庆，吴承来，等．玉米叶绿素含量快速测定方 法研究［Ｊ］．玉米科学，２００８，１６（２）：９７・１００． 【４】李得孝，郭月霞，吴海燕，等．玉米叶绿素含量测定方法研 究【Ｊ】．中国农学通报＂２００５，２１（６）：１５３－１５５． 【５】 张宪政．植物叶绿素含量测定——丙酮乙醇混合液法明． 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