四棱豆属7个栽培种ITS序列亲缘关系分析

第４５卷第１期　２Ｏ１１年３月　华中帅范大学学报（自然科学版）　Ｊ０ＵＲＮＡＬ　０Ｆ　ＨＵＡＺＨ０ＮＧ　Ｎ（）ＲＭＡＩ　ＵＮＩＶＥＲＳＩＴＹ（Ｎａｔ．Ｓｃｉ．）　Ｖｏ１．４５　Ｎｏ．１　Ｍａｒ．２０１１　文章编号：１０００—１１　９０（２０１１）０１　０１０８　０５　四棱豆属７个栽培种ＩＴＳ序列亲缘关系分析　蒋向辉　。　，佘朝文　～，许　栋　，陈东明　（１．怀化学院生命科学系，湖南怀化４１８００８；　２．怀化学院民族药用植物资源研究与利用湖南省重点实验室，湖南怀化４１　８００８；　３．怀化学院湘西药用植物与民族植物学湖南省高校重点实验室，湖南怀化４１８００８）　摘　要：对四棱豆属栽培品种ｎｒＤＮＡ　ＩＴＳ序列进行克隆测序，并进行序列比较与品种间亲缘关系　分析．结果表明：（１）供试品种问ＩＴＳ序列的变异小，ＧＣ含量低，为５１．４　～５１．６　．（２）供试四　棱豆品种问遗传变异范同在０．００００ｔ０．０００９，表明四棱属内ｎｒＤＮＡ　ＩＴＳ区存在一定的遗传变异，　但变异较低，表明供试材料间亲缘关系较近．（３）在３种不同的分子聚类树中，Ｋ００２ｌ总位于不同　的分支中，表明Ｋ００２１与其他栽培品种属不同品系．ｚ８和Ｍ８、ｓ３和Ｍ７在３种树中都同时聚为一　类，表明彼此间亲缘关系很近．以红花莱豆为外类群进行聚类分析发现四棱豆属与其他豆科植物　属间的亲缘关系较远．　关键词：四棱豆属；ＩＴＳ序列；亲缘关系分析　中图分类号：￥３３４．２　文献标识码：Ａ　四棱豆（ＰＳＯｐｈｏｃａｒｐｕｓ￡ｅ￡ｒ＆ｇ０ｎ０ｚ０６“ｓ　Ｄ．Ｃ．）　家争相开发利用的植物资源．目前国内对四棱豆　的研究主要集中在营养成分及其含量等方面［２］．　在分子水平上鉴定四棱豆属栽培品种亲缘关系　又名翼豆、四角豆、翅豆、热带大豆等，是豆科蝶形　花亚科四棱豆属一年生或多年生缠绕性藤本植物．　它原产于热带，主要分布在印度尼西亚、菲律宾、马　来西亚等国家和地区及在我国大部分地区，如云　南、广西、广东、海南、湖南、湖北、河南等省份．四　棱豆中有２个品系：一是印尼品系，二是巴布亚　新几内亚品系．印尼品系：属多年生，小叶卯圆　形、三角形、披针形等，茎叶绿色，花紫、白或紫蓝　色，较晚熟，也有早熟类型，在低纬度地区，全年　播种均能开花．中国南方栽培的多属此类．巴布　亚新几内亚品系：一年生，早熟，播种至开花需５７　～的研究还不够深入　］，本实验基于ＩＴＳ序列对　四棱豆属７个栽培品种进行聚类分析，将在分子　水平上鉴定四棱豆属几种栽培品种的亲缘关系，　一方面为四棱豆属栽培品种的准确分类提供依　据；另一方面，由于四棱豆属包含两个品系，而我　国四棱豆种质资源较少，对品系间的亲缘关系的　研究不够深入，对栽培品种间的杂种优势无法预　测，本文以ｎｒＤＮＡ　ＩＴＳ序列为依据对７个栽培品　种间的亲缘关系进行分析，为四棱豆属物种的杂　交育种提供分子理论基础，为选育新型优质四棱　７９　ｄ，小叶以卯圆形和正三角形为多，茎蔓生，　紫花，荚长６～２６　ｃｍ，表面粗糙，种子和块根的产　量较低．　四棱豆的叶片、豆荚、种子及块根均可入药，　对冠心病、动脉硬化、脑血管硬化、不孕、习惯性　流产、口腔炎症、泌尿系统炎症、眼疾等疾病有良　好疗效．因此，有人称四棱豆为“２１世纪健康食　豆品种提供参考．　１材料与方法　１．１材料　供试材料中Ｍ４、Ｍ７、Ｍ８、Ｍ１４来自美国农业　部种质资源库，Ｓ３为怀化学院经过系统选育出的　良种，Ｚ８为怀化学院组配的杂交种，Ｐｈａｓｅｏｌｕｓ　品”、“奇迹植物”　．可见其营养价值、经济价值　和药用价值都相当高，目前四棱豆已成为许多国　ｃｏｃｃｚ’ｎｅｕ５　Ｌ．来自云南省农业科学研究院．　收稿日期：２０１０—０６　１１．　基金项目：湖南省教育厅资助项目（０７Ｃ５０２）、（０９Ｃ７５５）；湖南省科研计划重点资助项目（２００９ＦＪ２００８）　＊Ｅ　ｍａｉｌ：ｈｈｃｄｍ＠ｙａｈｏｏ．ｃｏｒｎ．ｃｎ．　第１期　蒋向辉等：四棱豆属７个栽培种ＩＴＳ序列亲缘关系分析　表１供试材料　Ｔａｂ．１　Ｔｈｅ　ｍａｔｅｒｉａｌｓ　ｕｓｅｄ　ｉｎ　ｔｈｉｓ　ｓｔｕｄｙ　１．２方法　１．２．１植物基因组ＤＮＡ的提取　采取ＣＴＡＢ法　提取供试材料基因组ＤＮＡ．　９　＿●　１．２．２　ＰＣＲ扩增与回收　引物采用ｗｈｉｔｅ等　（１９９０）设计的ＩＴＳ通用引物ＩＴＳ　和Ｉ㈨　叩　ＴＳｊ，序列如　下：ＩＴＳ　：ＴＣＣＴＣＣＧＣＴＴＡＴＴＧＡＴＡＴＧＣ；ＩＴＳ　；　ＧＧＡＡＧＧＴＡＡＡＡＧＴＣＡＡＧＧ．反应程序为：　９４℃预变性４　ｍｉｎ；９４℃变性４５　Ｓ，５５℃退火　１　ｍｉｎ，７２℃延伸１　ｒａｉｎ，３５个循环；７２℃后延伸　１０　ｍｉｎ．ＰＣＲ反应体系为总体系２５　Ｌ：ＤＮＡ　（３０￣５０　ｎｇ／ｔＢ　），２．０　ｔ，Ｉ　；１０×Ｂｕｆｆｅｒ，１．２５“Ｉ　；　Ｍｇ”（２５　ｍｍｏ１），０．７５　ｇＩ　；Ｔａｑ（２　ｕ／ｔｄ　），０．５“Ｌ；　ｄＮＴＰ　ＭＩＸ（１０　ｍｍｏ１），０．５　Ｌ；ＩＴ　（１０　ｕｔｏｏ１），　０．３７５　Ｉ　；ＩＴＳ（１０　ｔ￣ｍｏ１），０．３７５　Ｌ；ｄｄＨ２　Ｏ，　１９．２５／ｄ　．ＰＣＲ产物回收采用上海生工的ＤＮＡ柱式　通用回收试剂盒．　１．２．３测序　测序由上海生化工程技术服务公　司完成．测序仪器为ＡＢＩ　ＰＲＩＳＭ　３７３０，测序试　剂为ＢｉｇＤｙｅ　ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ　ｖ３．１，进行正反链同时　测序．　１．２．４　分析方法与分析软件　运用ＤＮＡ—　ＭＡＮ５．２．９对不同材料的ＩＴＳ序列进行对位排　列．用系统发育分析软件ＭＥＧＡ４．０进行计算和　系统发育树构建，采用平均距离法、邻位相接法　和最大简约法构建分子系统树，应用自展法对所　构建的系统树进行检测，自展重复次数设定为　１　０００次．　２结果与分析　２．１　ＰＣＲ产物纯化　以提取的植物基因组ＤＮＡ为模板扩增ＩＴＳ　序列（包括５．８Ｓ）．ＰＣＲ产物纯化后如图１，由图１　可以看出纯化后的条带清晰，且都在７５０　ｂｐ　左右．　图１　ＰＣＲ产物及其纯化后检测图　Ｆｉｇ　１　Ｐｕｒｉｆｉｅｄ　ＰＣＲ　ｐｒｏｄｕｃｔ　ａｎｄ　ｉｔｓ　ｔｅｓｔｉｎｇ　ｐｌａｎｓ　１～７分别为７种栽培品种的ＰＣＲ纯化后检测结果　２．２　ＩＴＳ序列提交与分析　２．２．１　ＩＴＳ序列提交将所得序列通过序列提交　软件处理后发送ＧｅｎＢａｎｋ，得到序列号，如下表　（表２）．　表２序列号　Ｔａｂ．２　ｓｅｑｕｅｎｃｅ　ｎｕｍｂｅｒ　栽培品种Ｍ４　Ｍ７　Ｍ８　Ｍ１４　Ｓ３　Ｋ００２１　Ｚ８　ＦＪ　ＦＪ　ＦＪ　ＦＪ　ＦＪ　ＦＪ　ＦＪ　序列号　８７３６８７　８７３６８９　８７３６９３　８７３６８８　８７３６９２　８７３６９Ｏ　８７３６９１　２．２．２　ＩＴＳ序列分析　ＩＴＳ序列测序结果分析发　现，七个栽培品种的ＩＴＳ序列在ＧＣ含量和序列长　度上不存在明显变异，栽培品种中的Ｍ４、Ｍ７、　Ｍ１４、Ｓ３在序列长度上相同（６５９　ｂｐ），其中Ｍ４、　Ｍ７与Ｓ３的ＧＣ含量相同（５１．６　），Ｍ８、Ｚ８的ＧＣ　含量（５１．５　Ａ）和序列长度相同（６５８ｏ　ｂｐ），Ｋ００２１序　列长度６６０　ｂｐ，ＧＣ含量与Ｍ１４　ＧＣ含量相同　（５１．４　）．进一步对四棱豆属的八种植物的ＩＴＳ　序列（包括５．８Ｓ在内）进行分析（表３）．从表可知，　所有四棱豆属植物的ＩＴＳ序列的长度在６５８－－６６０　ｂｐ，相差２　ｂｐ，长度变异为０．３　．从序列长度来　看，ＩＴＳ１序列的变异范围在２３９～２４１　ｂｐ之间，　ＩＴＳ２序列无变异．５．８Ｓ序列相对保守，在四棱豆　属中也不存在明显变异．ＧＣ含量在５１．０　～　５１．６　，变异范围非常小，其中Ｍ４，Ｍ７，Ｓ３为　５１．６　，Ｋ００２１为５１．３　，Ｍ８，Ｚ８，Ｍ２为　５１．１　，Ｍ１４为５１．０　．Ｐｈａｓｅｏｌｕｓ　ｃｏｃｃｉｎｅｕ５　Ｌ．的　ＧＣ含量明显高于供试栽培品种．　用软件ＤＮＡＭＡＮ对７种四棱豆栽培品种进　行两两比对（见表４）．从表中结果可知个栽培品种　的相似度都在９５．０　以上，且Ｍ８和Ｚ８相似度为　９９．７　．几个栽培品种与Ｐｈａｓｅｏｌｕｓ　ｃｏｃｃｉｎｅｕｓ　Ｉ　．　的相似度明显降低在６３．０　左右．　１１０　华中师范大学学报（自然科学版）　第４５卷　类群　Ｍ４　Ｍ１４　Ｍ７　Ｋｏｏ２１　Ｚ８　Ｓ３　Ｍ８　Ｐｈａ５∞ｚ“　ｆｏｃｃ　Ｐ“ｓ　Ｌ　注：对角线Ｆ为遗传距离，对角线上为相似性．　２．３系统发育分析　３种发育树均为无根树，通过外类群豇豆确定树　根，将本文研究的类群大致分为２枝．１枝由Ｍ４，　Ｍ７，Ｍ８，Ｍ１４，Ｚ８等构成，在３棵树中ＮＪ支持率　较低为６７　９／６，ＭＰ的支持率为７９　，但ＵＰＧＭＡ则　用软件ＭＥＧＡ　４．０分析得出上述植物问的遗　传距离，结果见表４，以菜豆属红花菜豆（Ｐｈａｓｅｏｌｕｓ　ｃｏｃｃｉｎｅｕｓ　Ｉ　．）为外类群，用软件ＤＮＡＭＡＮ对供试　的７种四棱豆属栽培品种的ＩＴＳ进行两两比对和　为９９　，能很好地支持该分支．另一支由Ｋ００２１构　成．在３种树中，栽培品种Ｚ８和Ｍ８，Ｓ３和Ｍ７都　显示出较近的亲缘关系．在ＭＰ和ＮＪ树中Ｍ７，Ｓ３　和Ｍ１４聚为一类，支持率分别为７９　和１９　．从　ＵＰＧＭＡ树中可以更好的得出Ｋ００２１与其他栽培　多重比对，排序后的ＩＴＳ序列总长度为７４７　ｂｐ，变　异位点（Ｖ）有３９个（占５．２２　），信息位点（Ｐｉ）有　１６个（占２．１５　）．再用软件ＭＥＧＡ　４．０构建系统　发育树进行聚类分析．本文采用ＭＰ法、ＮＪ法和　ＵＰＧＭＡ法获得３棵发育树．用最大简约法构建　发育树时，通过随机添加树法寻找简约树，重复　１００次．用靴带（ｂｏｏｔｓｔｒａｐ）自展法检验发育树，重　中不属于同一品系，这也符合四棱豆的品系分类．　综合３种树可以看出四棱豆属物种间的亲远关系　较近，而其与菜豆属亲缘关系较远，同时差距较大．　Ｚ８　Ｍ８　Ｍ４　复１　０００次，判断各分支处的可信度，选出最简约　树，见图２．其中树长为７６８，一致性指数（ＣＩ）为　０．９８１９００，保持性指数（ＲＩ）为０．６９２３０８．邻接法和　ＵＰＧＭＡ法构建的发育树同样用靴带自展法检验　发育树，重复１　０００次，分别获得ＮＪ树和ＵＰＧＭＡ　Ｍｌ４　Ｍ７　Ｓ３　Ｋ００２ｌ　ＰｈａｓｅｏｌＵＳ　ＣＯＣｃｉｎｅｕＳ　Ｌ　树，分别见图３和图４．图中分支上的数字为ｂｏｏｔ　ｓｔｒａｐ值，表明各分支的可信度．ＮＪ法和ＵＰＧＭＡ　法获得的发育树的拓扑结构基本相似，但略有差　异，最大简约法构建的树拓扑结构与前两种方法构　其中树长为７６８，一致性指数（ＣＩ）为０．９８１　９００，　保持性指数（ＲＩ）为０．６９２　３０８　９　图２基于ＩＴＳ序列构建的四棱豆属植物ＭＰ系统发育树　Ｆｉｇ．２　Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｅｄ　ｂａｓｅｄ　ｏｎ　ＩＴＳ　ｓｅｑｕｅｎｃｅ　ｏｆ　ｗｉｎｇｅｄ　ｂｅａｎ　ｐｌａｎｔ　ＭＰ　ｐｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃ　ｔｒｅｅ　建的树也基本相似，但差异稍大些．研究结果如下：　第１期　蒋向辉等：四棱豆属７个栽培种ＩＴＳ序列亲缘关系分析　图３　基于ＩＴＳ序列构建的四棱豆属植物ＮＪ系统发育树　Ｆｉｇ．３　Ｂａｓｅｄ　ｏｎ　ｔｈｅ　ＩＴＳ　ｓｅｑｕｅｎｃｅ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｗｉｎｇｅｄ　ｂｅａｎ　ｐｌ４　薹三　ａｎｔ　ｔｏ　ｂｕｉｌｄ　ＮＪ　ｐｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃ　ｔｒｅｅ　Ｚ｝｛　Ｍ８　Ｍ１　４　Ｍ４　Ｍ７　Ｓ３　Ｋ【Ｉ｛ｌ２ｌ　ＰｈａｓｅＯ１ＵＳ　ｅｏｃｃｉｎｅｕｓ　Ｌ　图４基于ＩＴＳ序列构建的四棱豆属　植物ＵＰＧＭＡ系统发育树　Ｆｉｇ．４　Ｂａｓｅｄ　ＯＦＩ　ｔｈｅ　ＩＴＳ　ｓｅｑｕｅｎｃｅ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｗｉｎｇｅｄ　ｂｅａｎ　ｐｌａｎｔ　ｔｏ　ｂｕｉｌｄ　ＵＰＧＭＡ　ｐｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃ　ｔｒｅｅ　３小结与讨论　３．１四棱豆属７个栽培品种亲缘关系探讨　本研究基于ＩＴＳ序列分析和聚类分析认为：　（１）四棱豆属各栽培品种的种序列特点相近，ＧＣ　含量都在５１．５％左右，长度小于６５９　ｂｐ左右．ＩＴＳ　序列变异不大，其变异位点为３９个，信息位点１６　个．这些变异位点能将四棱豆属的物种问区分开，　在分类价值中有一定的作用．（２）在３种发育树中　都能很好的支持ＫＯ０２１与其他栽培品种不同属于　一个品系，Ｓ３和Ｍ７，Ｚ８和Ｍ８，序列相似性较高，　且ＧＣ含量与序列长度都相差不大，在发育树上聚　为一类．（３）四棱豆属７个栽培品种的遗传分化距　离变异范围在０．０００　０～０．０００　９，表明四棱属内　ｎｒＤＮＡ　ＩＴＳ区存在遗传变异，但变异率较低，其亲　缘关系较近．　３．２　ＩＴＳ序列保守性和应用可靠性的讨论　近年来ＩＴＳ序列分析已广泛应用于植物科、　亚科、族、属和种间系统学研究　】，但在不同的植　物类群以及不同的分类等级上，ＩＴＳ序列的长度是　不一样的　。　，许多研究表明Ｆｌｌ　１　３］，属内种间ＩＴＳ　序列长度比较保守，相差的碱基数从几个到十几　个，如菜豆属与四棱豆属同为蝶形花科菜豆族，其　ＩＴＳ序列长度的变化仅相差１Ｏ个碱基，忍冬属　ＩＴＳ序列的变异范围为６１１～６１８　ｂｐ之间Ⅲ．　本试验研究的四棱豆属类群的ＩＴＳ序列在长　度和ＧＣ含量上相差不大，长度变化在６５８～　６６０　ｂｐ之间，最大相差２　ｂｐ，ＧＣ含量在５１．４　～　５１．６　，最大相差０．３　．从ＩＴＳ序列长度的保守　性看，现在划分到四棱豆属的物种仍有值得探讨　之处．　ＩＴＳ序列长度较保守，在被子植物中长度一般　小于７００　ｂｐ，但序列变异速率较快，可以提供较丰　富的变异位点和信息位点，已证实它是研究许多被　子植物类群系统与进化的重要分子标记，不仅可用　于解决科、亚科、族、属、组内的系统发育和分类问　题．本试验选用的类群包括外类群豌豆均为蝶形花　科植物，故能应用ＩＴＳ序列进行分析．排序后的　ＩＴＳ序列总长度７８４，一致性指数（ＣＩ）０．９５１　９６．５，　保持性指数（ＲＩ）为０．５２１　７３９，提高了分子系统研　究的准确性．　３．３不同建树方法对结果的影响　如前所述，最大简约法（ＭＰ）假定进化过程是　最简约的，在有多个选择时，进化步骤最少的分支　图为最可靠的系统发育．最大简约法对于近缘类群　的分析，一般都能给出正确的简约数，目前应用较　广，但对于进化时间较长的类群和序列，由于平行　或回复突变的干扰，简约法会得出不正确的结果．　本试验研究的序列相似性较差，构建的发育树误差　较大，未能获得最简约树．邻接法利用原始数据双　重对比的距离矩阵来构建系统树，具有方法简单直　观，结果稳定，系统树系统能够进行严格的检验等　优点，但不足之处表现为将原始数据转化为距离矩　阵，可能会引起某些信息的丢失．本研究采用ＭＰ　和ＮＪ法及ＵＰＧＭＡ法进行分子系统树的构建，结　果显示，供试的７个物种在３种方法中的聚类结果　大致一致．分析认为在对四棱豆属物种进行亲缘关　系分析时，应综合比较３种方法的聚类结果才较　可靠．　参考文献：　［１］陈东明，艾辛，王佩芝，等．四棱豆的主要农艺性状和品种　亲缘关系研究＿＿Ｊ］．湖南农业大学学报：自然科学版，２００５，３１　（５）：５２１　５２３．　［２］全妙华，陈东明．四棱豆可溶性总糖含量的测定［Ｊ］．怀化学　院学报：自然科学版，２００８（３）：１２．　［３］全妙华，陈东明．四棱豆种质资源遗传多样性的ＲＡＰＤ分析　［ＪＪ．湖南师范大学：自然科学学报，２００６（４）：７１　７３．　［４］党选民，张欣．四棱豆品种问亲缘关系的蛋白质分析［Ｊ］．　热带作物学报２０００（４）：５９—６２．　［５］　Ｗｈｉｔｅ　Ｔ　Ｊ，Ｂｒｕｎｓ　Ｔ，Ｌｅｅ　Ｓ，ｅｔ　ａ１．Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ａｎｄ　ｄｉｒｅｃｔ　ｓｅ一　１１２　华中师范大学学报（自然科学版）　第４５卷　ｑｕｅｎｃｉｎｇ　ｏｆ　ｆｕｎｇａｌ　ｒｉｂｏｓｏｍａｌ　ＲＮＡ　ｇｅｎｅｓ　ｆｏｒ　ｐｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃｓ　［Ｊ］．ＰＣＲ　ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：ａ　ｇｕｉｄｅ　ｔｏ　ｍｅｔｈｏｄｓ　ａｎｄ　ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，　１　９９０，３１５－３２２．　［１０］　葛　颂，Ｓｅｈａａｌ　Ｂ　Ａ，洪德元．用核糖体ＤＮＡ的ＩＴＳ序列探　讨裂叶沙参的系统位置一兼论ＩＴＳ片段在沙参属系统学研　究中的价值［Ｊ］．植物分类学报，１　９９７．３５（５）：３８５—３９５．　Ｂａｌｄｗｉｎ　Ｂ　Ｇ，Ｓａｎｄｅｒｓｏｎ　Ｍ　Ｊ，Ｗｏｊｃｉｅｃｈｏｗｓｋｉ　Ｍ　Ｆ，ｅｔ　ａ１．．Ｔｈｅ　ＩＴＳ　ｒｅｇｉｏｎ　ｏｆ　ｎｕｃｌｅａｒ　ｒｉｂｏｓｏｍａｌＤＮＡ　ａ　ｖａｌｕａｂｌｅ　ｓｏｕｒｃｅ　ｏｆ　［１１］赵珥，赵文军，朱水芳，等．核ｒＤＮＡ　ＩＴＳ序列在植物种质　资源鉴定中的应用ＥＪ］．辽宁农业科学，２００５（５）：２６—２８．　ｅｖｉｄｅｎｃｅ　ｏｎ　ａｎｇｉｏｓｐｅｒｍ　ｐｈｙｌｏｇｅｎｙ［Ｊ］．Ａｎｎａｌｓ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ｍｉｓｓｏｕｒｉ　Ｂｏｔａｎｉｃａｌ　Ｇａｒｄｅｎ，１　９９５，８２：２４７　２７７．　［１２］李学营，彭建营，白瑞霞．基于核ｒＤＮＡ的ＩＴＳ序列在种子　植物系统发育研究中的应用［Ｊ］．西北植物学报，２００５，２５　（４）：８２９　８３４．　ｅｒ　Ｐ，Ｄｏｙｌｅ　Ｊ　Ｊ．Ｉｎｆｒａｇｅｎｅｒｉｃ　ｐｈｙｌｏｇｅｎｙ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ｅ７Ｊ　Ｙｕａｎ　Ｙ　Ｍ，ＫｕｐｆｇｅｎｕｓＧｅｎｔｉａｎａｉｎｆｅｒｒｒｅｄ　ｆｒｏｍ　ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ　ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ　Ｏｆ　ｔｈｅ　ｉｎ　［ｉ３］刘艳玲，徐立铭，倪学明，等．基于ＩＴＳ序列探讨睡莲属植物　的系统发育［Ｊ］．武汉大学学报：理学版，２００５，５１（２）：　２５８　２６２．　ｔｅｒｎａｌ　ｔｒａｎｓｃｒｉｂｅｄ　ｓｐａｃｅｒｓ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｎｕｃｌｅａｒ　ｒｉｂｏｓｏｍａｌ　ＤＮＡ［Ｊ］．　Ａｍｅｒｉｅａｎ　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｂｏｔａｎｙ，１　９９６，８３　ｒ６４１－６５２．　刘艳玲，徐立铭，倪学明，等．睡莲科的系统发育：核糖体　ＤＮＡ　ＩＴＳ区序列证据［Ｊ］．植物分类学报，２００５，４３（１）：　２２—３Ｏ．　［１４］　朱颖，董玉芝，咎少平．基于ｎｒＤＮＡ　ＩＴＳ序列对忍冬属部　分植物系统发育关系的研究［Ｃ］．西部六省中心城市园林科　技信息网第２６次会议论文集，乌鲁木齐：中国风景园林学　会，２００７．　汪小全，邓峥嵘，洪德元．铁破锣属的系统位置一ＩＴＳ（ｎｒＤＮＡ）　序列证据［Ｊ］．植物分类学报，１９９８，３６（５）：４０３　４１Ｏ．　Ｐｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃ　ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐ　ａｎａｌｙｓｉｓ　ｏｆ　ｓｅｖｅｎ　ｃｕｌｔｉｖａｒｓ　ｏｆ　Ｐｓ０ｐｈ０ｃａｒｐｕｓ　Ｎｅｃｋ。　ｂａｓｅｄ　ｏｎ　ＩＴＳ　ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ　ｏｆ　ｎｒＤＮＡ　ＪＩＡＮＧ　Ｘｉａｎｇｈｕｉ　，。～，ＳＨＥ　Ｃｈａｏｗｅｎ　’　～，Ｘｕ　Ｄｏｎｇ　，ＣＨＥＮ　Ｄｏｎｇｍｉｎｇ　＇　・。　（１．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ　ｏｆ　Ｌｉｆｅ　Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｈｕａｉｈｕａ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｈｕａｉｈｕａ，Ｈｕｎａｎ　４１８００８；　２．Ｋｅｙ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　ｏｆ　Ｈｕｎａｎ　Ｐｒｏｖｉｎｃｅ　ｆｏｒ　Ｓｔｕｄｙ　ａｎｄ　Ｕｔｉｌｉｚａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｅｔｈｎｉｃ　Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ　Ｐｌａｎｔ　Ｒｅｓｏｕｒｃｅｓ，Ｈｕａｉｈｕａ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｈｕａｉｈｕａ，Ｈｕｎａｎ　４ｌ８００８　３．Ｋｅｙ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　ｏｆ　Ｈｕｎａｎ　Ｈｉｇｈｅｒ　Ｅｄｕｃａｔｉｏｎ　ｆｏｒ　Ｈｕｎａｎ　ｗｅｓｔｅｒｎ　Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ　Ｐｌａｎｔ　ａｎｄ　Ｅｔｈｎｏｂｏｔａｎｙ，Ｈｕａｉｈｕａ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｈｕａｉｈｕａ，Ｈｕｎａｎ　４１８００８）　Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｐｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃ　ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐ　ｏｆ　ｓｅｖｅｎ　ｃｕｌｔｉｖａｒｓ　ｏｆ　Ｐｓｏｐｈｏｃａｒｐｕｓ　Ｎｅｃｋ．ｗｅｒｅ　ｅｓｔｉ—　ｍａｔｅｄ　ｂａｓｅｄ　ｏｎ　ｎｒＤＮＡ　ＩＴＳ　ｂｙ　ｕｓｉｎｇ　ＭＥＧＡ４．０　ｓｏｆｔｗａｒｅ　ｉｎ　ｔｈｅ　ｓｔｕｄｙ．Ｔｈｅ　ｒｅｓｕｌｔｓ　ｓｈｏｗｅｄ：（１）Ｔｈｅ　ＩＴＳ　ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ　ｈａｄ　ａ　ｓｍａｌ１　ｖａｒｉａｔｉｏｎ　ｉｎｔｅｓｔｅｄ　ｍａｔｅｒｉａｌｓ，ｔｈｅ　ｃｏｎｔｅｎｔ　ｏｆ　ＧＣ　ｗａｓ　ｌｏｗ，ｆｒｏｍ　５１．４　ｔｏ　５１．６　．（２）ｔｈｅ　ｒａｎｇｅ　ｏｆ　ｇｅｎｅｔｉｃ　ｖａｒｉａｔｉｏｎ　ｉｓ　ｆｒｏｍ　０．００００～　０．０００９　ａｍｏｎｇ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ　Ｐｓｏｐｈｏｃａｒｐｕｓ　ｔｅｔｒａｇｏｎｏｌｏｂｕｓ，ｔｈｅ　ｓｅｑｕｅｎｃｅ　ｄａｔａ　ｒｅｖｅａｌｅｄ　ｃｏｎｓｉｄ—　ｅｒａｂｌｅ　ｖａｒｉａｔｉｏｎ，ｂｕｔ　ｔｈｅ　ｍｕｔａｔｉｏｎ　ｒａｔｅ　ｗａｓ　ｌｏｗ，ｔｈｅ　ｓｅｖｅｎ　ｃｕｈｉｖａｒｓ　ｏｆ　Ｐｓｏｐｈｏｃａｒｐｕｓ　Ｎｅｃｋ．ｈａｄ　ａ　ｎｅａｒ　ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐ，（３）Ｉｎ　ｔｈｅ　ｔｈｒｅｅ　ｃｌｕｓｔｅｒｉｎｇ　ｔｒｅｅ　Ｋ００２　１　ｓｈｏｗｅｄ　ｂｅｌｏｎｇｉｎｇ　ｔｏ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ　ｃｕｈｉｖａｒｓ　ｃｏｍｐａｉｒｅｄ　ｗｉｔｈ　ｏｔｈｅｒ　ｃｕｌｔｉｖａｒ．Ｚ８　ａｎｄ　Ｍ８　ｉｎ　ｔｈｅ　ｔｈｒｅｅ　ｔｒｅｅｓ　ｗｅｒｅ　ａｌｌ　ｃｌｕｓｔｅｒｅｄ　ｉｎ　ｔｈｅ　ｓａｍｅ　ｂｒａｎｃｈ，ａｌｓｏ　Ｓ３　ａｎｄ　Ｍ７，ｔｈｅｒｅ　ｗａｓ　ａ　ｃｌｏｓｅ　ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐ　ｂｅｔｗｅｅｎ　Ｚ８　ａｎｄ　Ｍ８，ｓｏ　ｗａｓ　Ｓ３　ａｎｄ　Ｍ７．Ｔｈｅ　ｒｅｓｅａｒｃｈ　ｓｈｏｗｅｄ　ｔｈｅ　ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐ　ｗａｓ　ｆａｒ　ｂｅｔｗｅｅｎ　Ｐｓｏｐｈｏｃａｒｐｕｓ　ｔｅｔｒａｇｏｎｏｌｏｂｕｓ　ａｎｄ　Ｐｈａｓｅｏｌｕｓ　ｃｏｃｃｉｎｅｕｓ　Ｌ．．Ｔｈｅ　ｓｔｕｄｙ　ｐｒｏｖｉｄｅｄ　ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ　ｆｏｒ　ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｐｓｏｐｈｏｃａｒｐｕｓ　Ｎｅｃｋ．．　Ｋｅｙ　ｗｏｒｄｓ：Ｐｓｏｐｈｏｃａｒｐｕｓ　Ｎｅｃｋ；ＩＴＳ　ｓｅｑｕｅｎｃｅ；Ｐｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃ　ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐｓ　ａｎａｌｙｓｉｓ