复合诱变筛选avermectins高产菌株

来源：华佗健康网

中国抗生素杂志2005年3月第30卷第3期・143・

文章编号:1001286(2005)0320143204

攸德伟1　谌颉1　储炬1　庄英萍1　张嗣良13　罗家立2　白骅2

　　　　　　　　　　(1华东理工大学生物反应器工程国家重点实验室,　上海200237;

2浙江海正药业股份有限公司,　台州318000)

　　摘要:　由Streptomycesavermitilis初始菌株经过自然分离可以得到三种不同类型的菌株,即灰色粉末型、白色和光秃型。其中灰色粉末型产素水平最高,摇瓶发酵效价达到683511Λg󰃗ml,B1组分达到5613%。经过紫外线和亚硝基胍对初始菌株的孢子的诱变及对其原生质体的诱变再生,并且经过异亮氨酸和链霉素的定向筛选,得到的高产菌株摇瓶发酵效价达到8219Λg󰃗ml,B1组分达到19%;同时通过对高产菌株进行传代培养检验其传代稳定性,结果表明,传代3代后,菌株开始退化,并且其发酵效价有比较显著的下降。

关键词:　阿维链霉菌;　定向选育;　原生质体诱变及再生中图分类号:Q933　　　文献标识码:A

Screeningofhigh-yieldavermectinsproducingstrainbycomplexmutation

1111

YouDe2wei,　ChenJie,　ChuJu,　ZhuangYing2ping,

122

ZhangSi2liang,　LuoJia2li　and　BaiHua

　　　　　　　(1StateKeyLaboratoryofBioreactorEngineering,EastUniversityofScience

andTechnology,　Shanghai200237;

2ZhejiangHaisunPharmaceuticalCo.Ltd.,　Taizhou318000)

ABSTRACT　Threetypesofcolony,powderygray,whiteandbald,werenaturallyisolatedfrom

Streptomycesavermitilisinitialstrain.Amongthem,thepowderygreyoneproducesthehighestlevelof

avermectins,anditstotaltiterreaches683511Λg󰃗mlinshakingflaskwithB1componentaccountingfor5613%.Aftermuta2tedwithUVandNTGonsporesandprotoplast(mutatedprotoplastneedtoberegeneratedbeforeselection),theninducedandselectedbyIleandStreptomycin,anavermectinshigh2yieldingstrainwasselectedwithtotaltiter8219Λg󰃗mlandB1component19%.Thestabilityofthehigh2yieldingmutantwastested,theresultshowedthatafterpassing3generations,thestrainbegantoretrogressandthetotaltiterhadasubstantialdecline.

KEYWORDS　Streptomycesavermitilis;　Directedscreening;　Protoplastmutagenesisandregeneration

　　1976年,美国Merck公司的研究人员从日本提供的一株阿维链霉菌(Streptomycesavermitilis)MA24680的发酵液中获得一族结构相似的16元环大环内酯类新型抗生素,定名为avermectins(AVMs)。它们是四对八个同系物,即avermectinA1a󰃗A1b、B1a󰃗B1b、A2a󰃗A2b、B2a󰃗B2b,它们经过催化剂氢化生成的还原产物含80%以上22,232双氢avermectinBla,20%以下22,232双氢avermectinB1b的混合物的非专利商品名收稿日期:2004205212

基金项目:国家“十・五”攻关(2002BA708B07205)项目。

称为依维菌素(ivermectin)。虽然AVMs既没有抗细

菌也没有抗真菌的活性,但随后的研究表明,它们是迄今为止发现的最为有效的杀虫剂、杀螨剂和杀昆虫剂之一,对防治人、畜及农林业的多种螨虫、昆虫和寄生虫危害有着重要的意义。

本文利用紫外线和亚硝基胍对孢子诱变及对诱变原生质体再生,并且经过异亮氨酸和链霉素的定向筛选,得到的高产菌株摇瓶发酵效价为初始菌株发酵效

作者简介:攸德伟,男,生于1976年,在读硕士研究生。　　Email:deweiyou@hotmail.com　　3通讯联系人,Email:siliangz@ecust.edu.cn

・144・

价的1125倍。同时从菌株发酵产物的HPLC图谱可以知道没有导致产生高组分杂质的突变。1　材料与方法1.1　实验菌株

Streptomycesavermitilis由浙江海正制药有限公司菌种保藏中心提供。1.2　培养基及培养条件

1.2.1　斜面培养基(%)　玉米淀粉210,酵母粉012,K2HPO40105,CoCl2・6H2O010005,MgSO4・7H2O0101,MnSO4・7H2O01005,琼脂215g,pH712～714。

1.3　试剂

复合诱变筛选avermectins高产菌株　攸德伟等

培养基　蛋白胨(Oxoid),酵母粉、酵母膏(上海

生工生物试剂公司),琼脂(纯化,中国医药(集团)上海化学试剂公司)。

诱变筛选试剂　亚硝基胍(分析纯,FlukaChemicAG,CH29470Buchs1瑞士包装),溶菌酶(lysozyme,

甘氨酸、顺丁烯二酸(分Sigma公司,USA),异亮氨酸、

析纯,上海康达氨基酸厂),链霉素(海正药业)。

HPLC试剂　无水甲醇、无水乙醇(色谱纯,Merck公司)。1.4　实验方法

1.4.1　单孢子悬液制备　向待处理的斜面中加入10ml无菌水,用接种环刮下孢子,玻璃珠震荡打碎,然

蒸馏水配制。置于灭菌锅内在0111MPa,121℃消毒20min。

1.2.2　种子培养基(%)　葡萄糖015,玉米淀粉210,黄豆饼粉110,酵母粉016,酵母膏0108,Α2淀粉酶0103,玉米浆01003,花生饼粉01005,CoCl2・6H2O010005,自来水配制,分装40ml󰃗250ml三角瓶。置灭菌pH712。

锅内,在0111MPa,121℃消毒20min。种子的培养条件

为27℃。

1.2.3　发酵培养基(%)　玉米淀粉510,NaCl012,K2HPO40105,CoCl2・6H2O010005,MgSO4・7H2O0101,MnSO4・7H2O01005,ZnSO4・7H2O01005,FeSO4・7H2O01005,pH710,蒸馏水配制,分装40ml󰃗250ml三角瓶。以上培养基0111MPa,121℃灭菌柜蒸

后过滤得到单孢子悬液。

1.4.2　原生质体的制备　参照文献[1]。

1.4.3　原生质体的再生　将经过亚硝基胍(NTG)诱

变、洗涤稀释后的原生质体涂布于原生质体再生培养基,28℃培养48h。1.4.4　菌株诱变紫外线(UV)诱变[2]　出发菌株孢子悬液的制备参照文献[3]进行。将孢子悬液用无菌生理盐水稀释至浓度约为107个󰃗ml后,于28℃保温预培养8h。开启波长为25317nm的紫外灯预照射20s,然后在直径为6cm的无菌平皿中加入5ml孢子悬液和2枚无菌大头针,并放置于距紫外灯管30cm的磁力搅拌器上,打开皿盖和启动磁力搅拌器进行紫外光根据实验照射不同时间。照射完毕后用黑布包裹平皿,置28℃培养24h,在红灯下进行梯度稀释涂平皿,继续用黑布包裹,置28℃培养4d,计数各梯度平皿菌落数。

NTG诱变参照文献[2]。1.4.5　筛选方法

汽灭菌30min。摇瓶发酵培养条件为28℃,摇床转速220r󰃗min,偏心距5cm。1.2.4　原生质备及再生培养基[1]

菌丝培养基(%)　蔗糖110,葡萄糖012,蛋白胨016,NaCl014,KH2PO40103,MgSO4・7H2O0102,MnSO4・7H2O01005,(NH4)2SO40125,pH710,蒸馏

水配制。

以上培养基0111MPa,121℃灭菌柜蒸汽灭菌30min。

原生质体再生培养基(%)　蔗糖1010,葡萄糖110,蛋白胨0115,琼脂212,(NH4)SO40115,MgCl2・6H2O110,CaCO3013,pH712,蒸馏水配制。

微量元素溶液012%(V󰃗V),015%K2HPO41%(V󰃗V),0125mol󰃗LTES溶液10%(V󰃗V),分别灭菌后加入。0107MPa蒸汽灭菌25min。

稳定液(%)　蔗糖1010,MgCl2・6H2O210,蒸馏水配制。

微量元素溶液012%(V󰃗V),25%K2SO4014%(V󰃗V),3168%CaCl2,10%(V󰃗V),0125mol󰃗LTES溶液10%(V󰃗V),分别灭菌后加入。0107MPa蒸汽灭菌25min。

筛选流程　出发菌株→单孢子悬液(或原生质体

悬液)→诱变→稀释涂平皿→母斜面→初步筛选→子斜面→复筛→目的菌株

L2异亮氨酸诱导按文献[3]操作进行。因为avermectinA组份分子结构中C25位的22丁基来自L2

异亮氨酸,B组份分子结构中相应部位的异丙基是来自L2缬氨酸(L2Val),因此,从理论上说用L2异亮氨酸诱导可提高变异株产生有效组份B1a的能力。

链霉素筛选按文献[4]进行。1.4.6　avermectins含量测定

HPLC条件色谱柱　HypersilC18(250mm×416mm,5Λm);流动相:CH3OH∶H2O=90∶10;流速:110ml󰃗min;检测波长:246nm;柱温:25℃;进样量:

中国抗生素杂志2005年3月第30卷第3期・145・

的回归曲线方成为:

Y=0.0005632X-3.4671　R=0.9999

1.4.7　单菌落效价测定　挑取28℃培养8d的单菌落,加入10ml丙酮,超声波处理20min后效价测定按1.4.6进行,然后将测得的丙酮浸提液效价(mg󰃗L)乘以10,即得到单菌落效价。2　结果与讨论

2.1　菌落特征与产素能力的关系

对出发菌株进行自然分离时三种菌落形态的摇瓶发酵后的avermectins产量及B组分所占的比例如Tab.1所示。

20Λl;B1a标准品由浙江海正制药有限公司提供。

分析方法　根据不同发酵时间来判断效价从而确定合适发酵液的稀释倍数,在预期发酵效价低于1500Λg󰃗3倍,也就是3ml发酵液与ml时可以采用10󰃗

7ml乙醇共置于具塞带有刻度的10ml试管中,混合摇匀后超声处理30min,然后过滤取上清液246nm波长下做HPLC曲线。当预期效价高于1500Λg󰃗ml采用10倍稀释,其它操作同上。

绘制标准曲线　用乙醇配置一系列梯度浓度的

～6000Λg󰃗avermectinB1a标准溶液(0ml),分别注入色

谱工作站并且测定各溶液的吸收峰面积,对浓度(Y)和峰(X)的面积之间的关系进行一元线性回归,得到

从Tab.1可以看出,出发菌株的菌落形态主要有

　　Tab.1　　　　Therelationshipbetweencolonialmorphologyandavermectinsproducingcapability

ColonialmorphologyPowderygreyWhiteBald

Totaltiter(Λg󰃗ml)

<4500147

4500～5500

9610

5500～650018197

6500～750035243

>750013150

三种类型,并且以灰色粉末型和白色粉末型为主要的菌落形态。比较它们的生产能力可以发现灰色粉末型最强,而且高产菌落的比例也最高;白色粉末型次之,光秃型产量最低。所以,后面实验中菌株筛选是以灰色粉末型为主。

2.2　选择合适的诱变剂

2.2.1　紫外线(UV)诱变　在实验中照射时间分别选择为0、15、30、45、60、75s。选取灰色粉末型菌落的孢子进行紫外线诱变处理。实验结果表明,该菌株对紫外线十分敏感,作用时间超过60s后,致死率几乎达到100%,这与一般链霉菌的差异较大。同时可以发现接近45s菌株的致死率为90%,在这个致死率下取得好的诱变效果的几率比较大,所以后面的实验中选择照射时间为45s。

2.2.2　亚硝基胍(NTG)诱变　通过实验确定了合适的诱变pH[5]、诱变时间和诱变剂量。实验结果表明,综合致死率、正变率、负变率和高产菌株的比例等几个因素,当NTG的浓度为110mg󰃗ml、pH为610的缓冲液诱变45～60min为比较合适的诱变条件。

2.2.3　紫外线(UV)与亚硝基胍(NTG)复合诱变　根据上面的实验结果,我们设计了先用紫外线,然后用亚硝基胍进行复合诱变的方法。实验结果表明,紫外灯30W,照射时间45s;亚硝基胍浓度110mg󰃗ml,pH610,诱变时间45min为合适的诱变条件;结果还表明,复合

诱变剂处理Streptomycesavermitilis后的效果要稍好于单一的诱变剂,可以复合诱变出高于130%的菌株。2.2.4　原生质体诱变及再生　原生质体没有细胞壁,所以对诱变剂更加敏感,在用NTG诱变原生质体时的诱变条件改为:NTG浓度110mg󰃗ml,诱变时间15min,pH610,其他操作不变。实验结果表明,原生质体诱变和再生后菌株正变率和产量正变幅度都有较大的提高,诱变和再生的正变率分别为自然分离的对照菌株的1137和2127倍,产量正变幅度分别高于30%和40%。因此利用原生质体诱变和再生技术对Streptomycesavermitilis进行菌种选育是一种有效的方法。

2.3　筛选结果

Fig1和Fig2是分别以L2异亮氨酸(L2isoleucine,Ile)为诱导筛选介质和以链霉素为选择压力的筛选结果。当L2异亮氨酸的浓度为0106%时得到较好的筛选结果。

由Fig.1可以看出,经过Ile筛选得到的菌株的B1a

组分的生产能力比自然分离和诱变得到的菌株高,比较经过Ile筛选的孢子和再生后的原生质体的筛选结果可以看出,两者B1a组分的生产能力分别为自然分离的1137倍和1128倍。所以Ile对提高B1a组分的效果还是很明显的。

由Fig2可以看出,各种诱变筛选组合方法都可以

・146・复合诱变筛选avermectins高产菌株　攸德伟等

A:Spores;　B:Regeneratedprotoplast

1:NS;　2:UV;　3:UV+Ile;　4:NTG;　5:NTG+Ile;　6:UV+NTG;　7:UV+NTG+Ile

Fig.1　　ComparisonofB1aproductivityamongthenaturalisolates,induced2mutantsandtheIle2screeningmutants

A:Spores;　B:Regeneratedprotoplast

1:NS;　2:UV;　3:UV+SM;　4:NTG;　5:NTG+SM;　6:UV+NTG;　7:UV+NTG+SM

　　　　　　Fig.2　　ComparisonofAvermectinsproductivityamongthenaturalisolates,induced2mutantsand

theStreptomycinresistancescreeningmutants

不同程度地提高avermectin的产量,以NTG(原生质体再生)+链霉素(SM)的效果最好,该方法得到的高产菌株avermectin的生产能力是自然分离菌株的1113倍。

2.4　初发菌株和诱变后菌株的生产能力比较2.4.1　菌种选育谱　对出发菌株进行选育的系谱如Fig.3所示。

2.4.2　菌株Av26传代稳定性　将所得的菌株Av26

连续传代5次,所得的各子斜面进行摇瓶发酵,考察其总的效价和B1组分的稳定性,实验结果如Tab.2所示。

从Tab.2可以看出,目的菌株经过5代无论是总的发酵效价还是B1a组分都有所下降,但B1组分占总组分的比例没有大的变化,另外可以发现传3代时表中三个指标基本稳定,所以可以3代为时间标准来进行菌株的复筛和复壮。

“t”:totaltiter(Λg󰃗“:percentageofB1componentml);　B”

Fig.3　　Strainpedigreeofavermectins2producingstrains(part)

(下转第158页)

・158・肺炎克雷伯菌和阴沟肠杆菌中的检出率及耐药情况比较　李耘等ESBLs在大肠埃希菌、

isolatesfromEurope,theAmericas,andtheWestern

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松和头孢噻肟;耐药株中AmpC酶检出率(7814%)约是ESBLs检出率(5618%)的114倍。由此可见,在阴沟肠杆菌中,对头孢曲松和头孢噻肟中介的菌株,以产ESBLs为主,耐药菌株以产AmpC酶为主。提示对阴沟肠杆菌、大肠埃希菌和克雷伯菌属以外的其它菌种中ESBLs的监测研究也很有必要。

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(上接第146页)

.2　　　ProductionstabilityofstrainAv26Tab

Generation

F1F2F3F4F5Totaltiter(Λg󰃗ml)82.8527.8518.8356.8271.93152B1acomponent(Λg󰃗ml)

42.4803.4679.4307.4153.105PercentageofB1(%).63.62.63.62.918452.4.3　高产菌株Av26发酵产物的HPLC图谱　高产

Fig.4　　Thechromatogramofhigh2yieldingstrain

菌株的发酵效价由683511Λg󰃗ml上升到8219Λg󰃗ml,组分由5613%上升到19%。由Fig.4还看出在诱变过程中菌株没有导致产生高组分的突变。2.5　讨论

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