发酵工程(期末考试)

获得发酵产品的条件：适宜的微生物 保证或控制微生物进行代谢的各种条件 进行微生物 发酵工程组成：上游工程、发酵工程、下游工程

发酵工程的范围1、以微生物细胞为产物的发酵工程2、以微生物代谢产物为产品的发酵工程3、以微生物酶为产品的发酵工程4、生物转化或修饰化合物的发酵工程5、微生物废水处理和其他

生产微生物细胞物质：定义：是以获得具有多种用途的微生物菌体细胞为目的的产品的发酵工程，包括单细胞的酵母和藻类、担子菌，生物防治的苏云金杆菌以及人、畜防治疾病用的疫苗等。

特点：细胞的生长与产物积累成平行关系，生长速率最大时期也是产物合成速率最高阶段，生长稳定期产量最高。

微生物酶发酵酶的特点：易于工业化生产，便于改善工艺提高产量。分类：胞内酶和胞外酶 发酵酶生物合成特点：需要诱导作用，或遭受阻遏、抑制等作用的影响，在菌种选育、培养基配制以及发酵条件等方面需给予注意。

微生物代谢产物发酵包括初级代谢产物、中间代谢产物和次级代谢产物。

初级代谢产物：对数生长期形成的产物是细胞自身生长所必需的，称为初级代谢产物或中间代谢产物。

各种次级代谢产物都是在微生物生长缓慢或停止生长时期即稳定期所产生的，来自于中间代谢产物和初级代谢产物。 微生物的生物转化 定义：是利用生物细胞对一些化合物某一特定部位（基团）的作用，使它转变成结构相类似但具有更在经济价值的化合物。

最终产物是由微生物细胞的酶或酶系对底物某一特定部位进行化学反应而形成的。 搅拌作用：打碎空气气泡，增加气液接触界面以提高气液间的传质效率； 使发酵液充分混和。

挡板的作用——防止液面产生漩涡，促使液体激烈翻动，提高溶解氧。 竖立的蛇管、列管、排管也可以起挡板作用； 直管缺点：会有培养基冲入，污染压力表；起不到缓冲作用；灭菌冷却后有冷凝水（含菌）掉入罐内，污染菌种 发酵罐的灭菌步骤：

（在夹套中）关好空气阀，蒸气上进下出，冲蒸气，压力大于2 kg/cm2（120℃），最好是4～5 kg/cm2（160℃）。

当罐内温度>80℃，进蒸气口（蒸气阀）关掉，出蒸气口（排气阀）关小。打开空气阀，蒸气直接进罐，121℃，20～30min。 从80℃～100℃上升很快，大于100℃后温度上升很慢，到118℃时就开始计时，到计时25min时立即关掉蒸气阀。

关掉蒸气阀后通入无菌空气，使罐内一直保持正压（高于大气压，空气不会倒灌入罐内）。 （在夹套中）立即加自来水冷却，从下向上，使温度尽快降到55℃左右，到37～38℃时关掉水，也有缓冲性。

管路和死角的消除：尽量减少管路；发酵罐的出口越少越好；出料口和进气管可以合并；接种管、消泡管、补料管可以合并；排气管不能合并，易引起交叉污染；

消灭死角：丝口连接处改用法兰连接 焊接部位：堆焊、电焊、氧焊、鱼鳞焊，选用鱼鳞焊； 管道转弯有弧度；放料管、取料管的阀腔处装小阀

接种的三种方法 火圈直接倒种；注射器接种；压力差接种接种口用火圈杀菌；

接种步骤：橡胶口在火圈上过一下，套入接种口；进气阀打开，排气阀关闭，罐内和种子瓶同时升压至1kg/cm2；关闭发酵罐和种子瓶之间的阀门，打开发酵罐排气阀，罐内压力下降至0.5kg/cm2，倒置种子瓶，打开发酵罐和种子瓶之间的阀门，瓶内种子液进入罐内；一次没有接完再重复。

工业生产常用的微生物：细菌 \\酵母菌 \\霉菌 \\放线菌\\ 担子菌\\ 藻类

对菌种有下列要求：1原料廉价、生产迅速、目的产物产量高。2易于控制培养条件，酶活性高，发酵周期较短。3抗杂菌和噬菌体的能力强。4菌种遗传性能稳定，不易变异和退化，不产生任何有害的生物活性物质和毒素，保证安全生产

工业微生物分离的程序：定方案：首先要查阅资料，了解所需菌种的生长培养特性。 采样：有针对性地采集样品。增殖：人为地通过控制养分或培养条件，使所需菌种增殖培养后，在数量上占优势。分离：利用分离技术得到纯种。

发酵性能测定：进行生产性能测

定。这些特性包括形态、培养特征、营养要求、生理生化特性、发酵周期、产品品种和产量、耐受最高温度、生长和发酵最适温度、最适pH值、提取工艺等。 自然选育或自然分离：在生产过程中，不经过人工诱变处理，根据菌种的自发突变而进行菌种筛选的过程，叫做自然选育或自然分离。

诱变育种的基本过程：选择选择合适的出发菌株↓制备待处理的菌悬液↓诱变处理↓筛选↓保藏和扩大试验

影响诱变效果的因素：出发菌株的遗传特性；诱变剂；菌种的生理状态；被处理菌株的预培养和后培养条件；诱变处理时的外界条件等。

营养缺陷型：经诱变产生的一些合成能力出现缺陷，而必须在培养基内加入相应有机养分才能正常生长的变异菌株。 野生型：自然界分离到的任何微生物，在其发生营养缺陷突变前的原始菌株，为该微生物的野生型。

原养型 ：指营养缺陷型突变菌株回复突变或重组后产生的菌株，与野生型的表型相同。 影响原生质备的因素：菌体的预处理 菌体的培养时间 酶浓度 酶解温度 酶解时间 渗透压稳定剂

影响原生质体融合的因素菌体的前处理；菌体的培养时间；融合剂的浓度；融合剂作用的时间；阳离子的浓度；融合的温度；融合体系的pH值等

融合：是把两个亲株的原生质体混合在一起，在融合剂PEG和Ca2+作用下，发生原生质体的融合。

融合子的选择：主要依靠两个

亲株的选择性遗传标记。 在选择性培养基上，通过两个亲株的遗传标记互补而挑选出融合子。

在融合体再生后，进行几代自然分离、选择，才能确定真正融合子。

DNA重组过程：基因的分离 载体的选择 DNA分子的切割与连接 重组载体引入宿主细胞 重组体的选择和鉴定 外源基因的表达

菌种的退化是由个别、少数菌体细胞衰退后逐渐导致整个菌株退化的一个从量变到质变的遗传变异过程。

菌种衰退的原因：1、菌种连续传代导致自发突变或回复突变是菌种发生退化的直接原因。2、菌种保藏方法不当。3、菌种生长的条件要求没有得到满足，或是遇到不利的条件，或是失去某些需要的条件。

防止菌种衰退的措施：1 控制传代次数2 创造良好的培养条件3 利用不易衰退的细胞传代4 采用有效的菌种保藏方法 狭义的复壮仅是一种消极的措施，指在菌种已发生衰退的情况下，通过纯种分离和测定典型性状、生产性能等指标，从已衰退的群体中筛选出少数尚未退化的个体，以达到恢复原菌株固有性状的相应措施；广义的复壮是一项积极的措施，指在菌种的典型特征或生产性状尚未衰退前，就经常有意识地采取纯种分离和生产性状的测定工作，以期从中选择到自发的正变个体。 菌种保藏的原理：菌种保藏主要是根据菌种的生理、生化特性，人工创造条件使菌体的代谢活动处于休眠状态。 保藏时，一般利用菌种的繁殖体和休眠体

（孢子、芽胞等），创造最有利于休眠状态的环境条件，如低温、干燥、隔绝空气或氧气、缺乏营养物质等，使菌体的代谢活性处于最低状态，同时也应考虑到经济、简便方法。 由于微生物种类繁多，代谢特点各异，对各种外界环境因素的适应能力不一致，一个菌种选用何种方法保藏较好，要根据具体情况而定。

菌种保藏的方法：冷冻干燥或真空干燥保藏；超低温或在液氮中冷冻保藏； 转接培养或斜面传代保藏；土壤或陶瓷珠等载体于燥保藏。

菌种保藏的注意事项：菌种在保藏前所处的状态 菌种保藏所用的基质 操作过程对细胞结构的损害

种子制备：菌种的扩大培养是发酵生产的第一道工序，该工序又称之为种子制备。

微生物生长：生物个体物质有规律地、不可逆增加，导致个体体积扩大的生物学过程。 微生物繁殖：生物个体生长到一定阶段，通过特定方式产生新的生命个体，即引起生命个体数量增加的生物学过程。

在生产实践中缩短延滞期的常用手段：通过遗传学方法改变种的遗传特性使迟缓期缩短；利用对数生长期的细胞作为种子；尽量使接种前后所使用的培养基组成不要相差太大；适当扩大接种量

种子的要求：菌种细胞的生长活力强，移种至发酵罐后能迅速生长，延缓期短；生理性状稳定；菌体总量及浓度能满足大容量发酵罐的要求；无杂菌污染；保持稳定的生产能力。

种子制备：是将固体培养基上培

养出的孢子或菌体转入液体培养基中培养，使其繁殖成大量菌丝或菌体的过程。

工业微生物培养法分为静置培养和通气培养两大类型。 静置培养 即将培养基盛于发酵容器中，在接种后，不通空气进行培养。

通气培养法 的生产菌种以需氧菌和兼性需氧菌居多，它们生长的环境必须供给空气，以维持一定的溶解氧水平，使菌体迅速生长和发酵，又称好气培养法。 影响种子质量的因素1培养基２）培养条件３）种龄４）接种量

协同诱导：一种诱导剂可以同时诱导产生若干种酶的现象。 顺序诱导：一种诱导剂诱导产生的酶的反应产物可继续诱导产生下一个酶，这种连续诱导产生一系列酶的现象称为顺序诱导。 终点产物反馈阻遏：合成代谢过程中，相关酶的合成被过量终点产物所阻遏。

分解代谢物阻遏：可被组成酶快速利用的基质，阻遏了分解难利用基质的酶的合成。

酶合成调节的遗传机制：操纵子学说操纵子是指基因组DNA分子的一个片段，这个片断由启动子、调节基因、操纵基因和结构基因组成。

诱导型操纵子：效应物存在导致基因表达。

阻遏型操纵子：效应物存在导致基因表达的关闭。

酶活性的激活前体激活：代谢途径中后面的酶促反应，可被该途径中较前面的一个中间产物所促进。

代谢中间产物的反馈激活：代谢中间产物对该代谢途径的前面的酶起激活作用。

积累代谢产物的有效措施（一）反馈抑制作用的解除：实质是使代谢途径中的关键酶（别构酶）的调节亚基的结构基因发生突变，使末端产物或其类似物不再与别构中心结合，从而解除反馈抑制，积累末端产物；（二）反馈阻遏作用的解除：实质是使调节基因或操纵基因发生突变，使调节蛋白改变或不发生，调节蛋白不再与末端产物相结合，或结合后的复合物不能同操纵基因结合，从而解除了末端产物对酶合成的阻遏；（三）遗传障碍：使某酶蛋白结构基因突变，使酶蛋白缺失或酶蛋白的活性中心改变，可以解除末端产物对途径中的第一个酶的反馈抑制，积累中间产物；（四）使细胞膜透性增大：如利用甘油缺陷型或生物素缺陷型或油酸缺陷型，通过控制甘油或生物素或油酸浓度以控制细胞膜的透性，使胞内代谢产物外漏，缓解反馈抑制或阻遏作用。

巴斯德效应概念：有氧条件下，发酵作用受抑制的现象（或氧对发酵的抑制现象）。

巴斯德在研究酵母的酒精发酵时发现：厌氧条件下酵母菌进行酒精发酵，葡萄糖的消耗速度很快；而在有氧条件下，酵母菌进行呼吸作用，糖的消耗速度较低，酒精产量也降低。 巴斯德效应机理 巴斯德在研究酵母的酒精发酵时发现：厌氧条件下酵母菌进行酒精发酵，葡萄糖的消耗速度很快；而在有氧条件下，酵母菌进行呼吸作用，糖的消耗速度较低，酒精产量也降低。

乳酸发酵乳酸细菌能利用葡萄糖及其他相应的可发酵的糖产

生乳酸，称为乳酸发酵。由于菌种不同，代谢途径不同，生成的产物有所不同，将乳酸发酵又分为同型乳酸发酵、异型乳酸发酵和双歧杆菌发酵

培养基的营养成分及用途：1能源 功能：生长、繁殖需要 2碳源 功能：提供能量、构成菌体、代谢产物的物质基础； 3氮源 功能：构成菌体、含氮代谢物4无机盐 功能：构成菌体，参与酶的组成，维持酶活性，调节渗透压，调节pH值，维持氧化还原电位；

5特殊生长因子功能：酶的辅助部分，维持生命活动6发酵的促进剂与抑制剂 发酵培养基中某些成分的加入有利于调节产物的形成，而并不促进微生物的生长，这些物质包括前体、促进剂和抑制剂 6水分功能：生化反应均在水溶液中进行

前体：指某些化合物加入到发酵培养基中，能直接被微生物在生物合成过程中结合到产物分子中去，而其自身的结构没有多大的变化，但产物的产量却因加入前体而有较大的提高。 促进剂：指那些既不是营养物又不是前体，但却能提高产量的添加剂。

抑制剂：在发酵过程中加入抑制剂会抑制某些代谢途径的进行，同时会使另外一些代谢途径活跃，从而获得人们所需要的某种产物或使正常代谢的某一代谢中间物积累起来。

依营养物质的来源分类：天然培养基, 是采用化学成分还不清楚或化学成分还不恒定的各种植物和动物组织或微生物的浸出物、水解液等物质(例如牛肉膏、酵母膏、麦芽汁、蛋白胨等)

制成的。

合成培养基，也称组合培养基（多用于定量研究）；是用化学成分和数量完全了解的物质配制而成的。

半合成培养基，（用的最多）多数培养基配制是采用一部分天然有机物作碳源、氮源和生长因子的来源，再适当加入一些化学药品以补充无机盐成分，使其更能充分满足微生物对营养的需要。

依培养基的物理状态来分类1、固体培养基2、半固体培养基3、液体培养基

（一）、配置培养基的原则1、根据不同微生物的营养需要配置不同的培养基2、注意各营养物质的浓度和配比3、调节适宜的物理化学条件4、根据培养微生物的目的配置5、尽量使用廉价易得的原料

（二）、配置培养基的方法1、生态模拟2、查阅文献3、借助优选法或正交试验法精心设计培养基配方4、实验比较 实验的规模一般由定性到定量，由小到大。发酵培养基的用途与要求、成分、配比经实验确定，配制时兼顾原料来源、成本及工艺管理；

淀粉水解糖的制备方法（一）、酸解法 定义：以酸（无机酸或有机酸）为催化剂，在高温高压下将淀粉水解为葡萄糖的方法.优点：设备要求简单，水解时间短（20min），设备生产能力大缺点：高温高压下进行，设备要求耐腐蚀、耐高温、耐高压，副反应多，对原料要求严格，淀粉颗粒不宜过大，淀粉乳浓度不能过高。

（二）、酶解法：定义：用淀粉酶将淀粉水解为葡萄糖的过程。一般分为两步：第一步是利用α－淀粉酶将淀粉液化转为糊精及低聚糖，使淀粉的可溶性增加，这个过程称为液化。 第二步是利用糖化酶将糊精或低聚糖进一步水解，转变为葡萄糖的过程，称为糖化。也称双酶法优点：1、反应条件温和。2、酶的专一性强，副反应少3、可在较高的淀粉乳浓度下水解4、糖液的营养物质丰富 5、糖液色泽浅，无苦味，有利于糖液的精制缺点：时间长（2～3）天，要求的设备多，糖液过滤困难。 、3酸酶结合法

DE值：糖化液中还原糖含量（以葡萄糖计）占干物质的百分率，用以表示淀粉糖的糖组成。 灭菌：指用化学或物理的方法杀灭或去除物料及设备中所有生命物质的技术或工艺过程。 一 常见的灭菌方法

（一）化学物质灭菌原理：药物与微生物细胞中的成分反应，使蛋 白质变性酶失活。 （二） 辐射灭菌原理：利用高能量的电磁辐射与菌体核酸的光化学反应造成菌体死亡 （三） 干热灭菌原理：利用高温对微生物有氧化、蛋白质变性和电解质浓缩作用而杀灭微生物。

（四）湿热灭菌 原理：蒸汽冷凝放出大量潜热，具有穿透力，且在高温有水分条件下，蛋白质易变性。

（五）过滤除菌 原理：利用微生物不能透过滤膜除菌。

分批灭菌：将配制好的培养基输入发酵罐中，用蒸汽加热，使培养基和设备同时灭菌的一种灭

菌方式。优点：1．不需附加设备2． 蒸汽利用率高3． 节约劳动力 缺点1． 培养基质量比较差2． 罐的利用率低3. 冷却水用量大

连续灭菌：将培养基通过专门设计的灭菌器，进行连续流动灭菌后，进入预先灭过菌的发酵罐中的灭菌方式。优点：1 采用高温快速灭菌法2．可以把培养基按其性质分开灭菌3． 有利于自动控制4． 节省冷却水缺点1． 投资费用高2． 对物料要求高3． 蒸汽用量大 消除高温有害影响的措施采用特殊加热灭菌法(连续灭菌方法）；对易破坏的含糖培养基进行灭菌时，应先将糖液与其他成分分别灭菌后再合并；对含Ca2+或Fe3+的培养基与磷酸盐先作分别灭菌，然后再混合，就不易形成磷酸盐沉淀；对含有在高温下易破坏成分的培养基（如含糖组合培养基）可进行低压灭菌。 空气净化的方法热灭菌法 静电除菌 介质过滤除菌法

介质过滤除菌法 绝对过滤 利用微孔滤膜，其孔隙小于0.5甚至0.1μm，将空气中的细菌滤除，从而获得无菌空气。 深层介质过滤 由多种介质组成过滤层，滤层较深，空隙较大，靠静电、扩散、惯性和阻截作用等将细菌截留在滤层中，从而获得无菌空气。

发酵过程四种类型的操作方式分批发酵、补料分批发酵、半连续发酵及连续发酵

分批发酵指在一个封闭的培养系统内含有初始量的基质的发酵方式。即一次性投料，一次性收获产品的发酵方式。根据产物生成是否与菌体生长同步的关系，将微生物产物形成动力

学分为① 生长关联型 和② 非生长关联型

正意义上的纯种培养。 下游加工过程的特点

染菌对不同发酵过程的影响 发酵液的特点 含水多，产物含

补料分批发酵是指分批培养过程中，间歇或连续地补加新鲜培养基的培养方法。与传统的分批发酵相比，优点在于使发酵系统中维持很低的基质浓度。低基质浓度的优点：

① 可以除去快速利用碳源的阻遏效应，并维持适当的菌体浓度，使不至于加剧供氧的矛盾； ② 克服养分的不足，避免发酵过早结束。

半连续发酵是指在补料－分批发酵的基础上，间歇地放掉部分发酵液的培养方法。优点： ① 可以除去快速利用碳源的阻遏效应，并维持适当的菌体浓度，使不至于加剧供氧的矛盾② 克服养分的不足，避免发酵过早结束；③缓解有害代谢产物的积累。

连续发酵即培养基料液连续输入发酵罐，并同时放出含有产品的发酵液的培养方法。优点： ① 维持低基质浓度：可以除去快速利用碳源的阻遏效应，并维持适当的菌体浓度，使不至于加剧供氧的矛盾；② 避免培养基积累有毒代谢物；③ 可以提高设备利用率和单位时间的产量，节省发酵罐的非生产时间；④ 便于自动控制。

发酵过程的主要控制参数 pH值（酸碱度）温度（℃）溶解氧浓度 基质含量 空气流量 压力 搅拌转速 搅拌功率 粘度浊度 料液流量 产物浓度 氧化还原电位 废气中的氧含量 废气中的CO2含量 菌丝形态 菌体浓度

发酵染菌：指在发酵过程中生产菌以外的其他微生物侵入了发酵系统，从而使发酵过程失去真

青霉素发酵过程：由于许多杂菌都能产生青霉素酶，因此不管染菌是发生在发酵前期、中期或后期，都会使青霉素迅速分解破坏，使目的产物得率降低，危害十分严重。

核苷或核苷酸发酵过程：由于所用的生产菌种是多种营养缺陷型微生物，其生长能力差，所需的培养基营养丰富，因此容易受到杂菌的污染，且染菌后，培养基中的营养成分迅速被消耗，严重抑制了生产菌的生长和代谢产物的生成。

柠檬酸等有机酸发酵过程：一般在产酸后发酵液的pH值比较低，杂菌生长十分困难，在发酵中、后期不太会发生染菌，主要是要预防发酵前期染菌。

谷氨酸发酵：周期短，生产菌繁殖快，培养基不太丰富，一般较少污染杂菌，但噬菌体污染对谷氨酸发酵的影响较大。 检查是否染菌的无菌试验方法主要有显微镜检查法、肉汤培养法、平板（双碟）培养法、发酵过程的异常观察法（如溶氧量）等。

噬菌体污染及其防治防治① 严禁活菌体排放，切断噬菌体的“根源”；② 做好环境卫生，消灭噬菌体与杂菌；③ 严防噬菌体与杂菌进入种子罐或发酵罐内；④ 抑制罐内噬菌体的生长；⑤ 轮换使用菌种或使用抗性菌株

挽救措施尽快提取产品 药物抵抗（如四环素可抵抗乳糖杆菌噬菌体；吐温60等表面活性剂可抑制噬菌体的增殖和吸附） 罐内灭噬菌体法（60-70℃，5min可灭活）

量低；含菌体蛋白；溶有原来培养基成分；相当多的副产物和色素；易被杂菌污染或使产物进一步分解；易起泡，粘性物质多 四个原则：时间短；温度低；pH适中（选择在生物物质的温度范围内）；严格清洗消毒（包括厂房、设备及管路，注意死角），这和传统产品抗生素的生产是一致的。

4个阶段：培养液（发酵液）的预处理和固液分离；初步纯化（提取）；高度纯化（精制）；成品加工。

一般流程：发酵液-预处理-细胞分离-细胞破碎-细胞碎片分离-初步纯化-高度纯化-成品加工 单元操作过滤、离心——固液分离；蒸发、蒸馏、结晶——进一步纯化；萃取——浓缩或提取液相中的成分；离子交换、层析、膜技术、超滤；干燥