一种细胞RNA快速提取试剂盒及RNA提取方法[发明专利]

(12)发明专利申请

(10)申请公布号 CN 112725334 A(43)申请公布日 2021.04.30

(21)申请号 202110200887.9(22)申请日 2021.02.23

(71)申请人 山东思科捷生物技术有限公司

地址 250000 山东省济南市中国（山东）自

由贸易试验区济南片区新泺大街786号生产装配车间B座506(72)发明人 冯锐　任光琳　韩小东　程建祥　

李昌静　(74)专利代理机构 青岛清泰联信知识产权代理

有限公司 37256

代理人 张洁(51)Int.Cl.

C12N 15/10(2006.01)

权利要求书1页 说明书6页 附图1页

()发明名称

一种细胞RNA快速提取试剂盒及RNA提取方法

(57)摘要

本发明提出一种细胞RNA快速提取试剂盒及RNA提取方法，属于分子生物学检测技术领域，该细胞RNA快速提取试剂盒包括：裂解液、漂洗液、洗脱液和RNA吸附柱，所述裂解液含有盐酸胍4.0‑6.0M、pH6.5‑8.5的Tris‑HCl 0.01‑0.1M、N‑十二烷基肌氨酸钠0.1‑5.0％、氯化钠0.1‑0.5M、EDTA 25‑100mM、异丙醇30‑55％(v/v)，所述漂洗液含有pH6.5‑7.5的Tris‑HCl 10‑200mM、氯化钠10‑200mM、无水乙醇50‑80％(v/v)。本发明能够解决现有RNA提取方法存在操作步骤繁琐、耗时长、RNA纯度低且稳定性差等的技术问题。本发明能够应用于RNA提取方面。

CN 112725334 ACN 112725334 A

权　利　要　求　书

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1.一种细胞RNA快速提取试剂盒，其特征在于，包括：裂解液、漂洗液、洗脱液和RNA吸附柱；

所述裂解液含有盐酸胍4.0‑6.0M、pH6.5‑8.5的Tris‑HCl 0.01‑0.1M、N‑十二烷基肌氨酸钠0.1‑5.0％、氯化钠0.1‑0.5M、EDTA 25‑100mM、异丙醇30‑55％(v/v)；

所述漂洗液含有pH6.5‑7.5的Tris‑HCl 10‑200mM、氯化钠10‑200mM、无水乙醇50‑80％(v/v)。

2.根据权利要求1所述的细胞RNA快速提取试剂盒，其特征在于，所述洗脱液为RNase Free H2O。

3.根据权利要求2所述的细胞RNA快速提取试剂盒，其特征在于，所述洗脱液是一种加入蛋白酶K，终浓度为0.5‑1.5ng/mL，再经消化、灭菌处理后的溶液。

其特征在于，所述RNA吸附柱为硅膜4.根据权利要求1所述的细胞RNA快速提取试剂盒，

吸附柱。

5.根据权利要求1所述的细胞RNA快速提取试剂盒，其特征在于，所述试剂盒用于人肺癌细胞A9、中国仓鼠卵巢细胞亚株CHO‑K1、人肝癌细胞HEPG2、小鼠胚胎肌母细胞C2C12、大鼠心肌细胞H9C2或小鼠胚胎成骨细胞前体细胞MC3T3‑E1的提取。

6.根据权利要求1‑5中任意一项所述细胞RNA快速提取试剂盒的RNA提取方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：

样品裂解：利用裂解液对样品进行裂解处理，静置1‑5min后，得到裂解混合物，将所述裂解混合物转入RNA吸附柱中离心0.5‑1min后，弃掉滤液；

杂质漂洗：向RNA吸附柱中加入漂洗液，离心0.5‑1min后，弃掉滤液，并重复此步骤一次，随后将吸附柱放回空收集管中，离心2‑3min；

RNA洗脱：将吸附柱置于新的离心管中，再向其中加入洗脱液，离心0.5‑3min后，收集滤液即得RNA。

7.根据权利要求6所述的细胞RNA快速提取试剂盒的RNA提取方法，其特征在于，在所述样品裂解和杂质漂洗步骤中，离心转速均为12000‑13000rpm。

8.根据权利要求6所述的细胞RNA快速提取试剂盒的RNA提取方法，其特征在于，在所述RNA洗脱步骤中，离心转速为10000‑12000rpm。

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一种细胞RNA快速提取试剂盒及RNA提取方法

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技术领域

[0001]本发明属于分子生物学检测技术领域，尤其涉及一种细胞RNA快速提取试剂盒及RNA提取方法。

背景技术

[0002]RNA提取技术是现代分子生物学研究和应用中一项最基本且尤为关键的实验技术，同时，高质量的RNA也是构建cDNA文库、研究基因表达和、进行RT‑PCR和qRT‑PCR等的关键。

[0003]目前，细胞RNA的提取方法多采用溶液法和离心柱法，其中，溶液法是最传统的提取方法，原理是先利用异硫氰酸胍等变性剂破坏细胞结构，释放核酸和蛋白质，再借助酚、氯仿等有机溶剂分离RNA，此种方法在提取过程中会用到苯酚、氯仿等有毒物质，且提取时间较长，RNA纯度较低，而离心柱法是利用一种独特的内硅基质膜，在高离液剂(例如异硫氰酸胍、盐酸胍等)下裂解，在低pH条件下吸附核酸，再通过一系列的漂洗去除杂质，最后低盐洗脱RNA，虽然该方法并未使用苯酚、氯仿等有毒物质，但在吸附柱结合RNA时要调节上柱环境，同时需增加去基因组DNA步骤，且容易出现RNA纯度不稳定现象，因此，为解决上述技术问题，如何研发出一种操作简单、耗时短、提取的RNA纯度高且稳定的细胞RNA提取方法是本领域技术人员而言的重要研究课题。

发明内容

[0004]本发明针对现有RNA提取方法存在操作步骤繁琐、耗时长、RNA纯度低且稳定性差等的技术问题，提出一种操作简单、耗时短、提取的RNA纯度高且稳定好的细胞RNA快速提取试剂盒及RNA提取方法。

[0005]为了达到上述目的，本发明采用的技术方案为：[0006]一种细胞RNA快速提取试剂盒，包括：裂解液、漂洗液、洗脱液和RNA吸附柱；[0007]所述裂解液含有盐酸胍4.0‑6.0M、pH6.5‑8.5的Tris‑HCl 0.01‑0.1M、N‑十二烷基肌氨酸钠0.1‑5.0％、氯化钠0.1‑0.5M、EDTA 25‑100mM、异丙醇30‑55％(v/v)；[0008]所述漂洗液含有pH6.5‑7.5的Tris‑HCl 10‑200mM、氯化钠10‑200mM、无水乙醇50‑80％(v/v)。

[0009]作为优选，所述洗脱液为RNase Free H2O。[0010]作为优选，所述洗脱液是一种加入蛋白酶K，终浓度为0.5‑1.5ng/mL，再经消化、灭菌处理后的溶液。[0011]作为优选，所述RNA吸附柱为硅膜吸附柱。[0012]作为优选，所述试剂盒用于人肺癌细胞A9、中国仓鼠卵巢细胞亚株CHO‑K1、人肝癌细胞HEPG2、小鼠胚胎肌母细胞C2C12、大鼠心肌细胞H9C2或小鼠胚胎成骨细胞前体细胞MC3T3‑E1的提取。

[0013]本发明还提供了一种利用上述任一优选技术方案所述细胞RNA快速提取试剂盒的

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RNA提取方法，所述方法包括如下步骤：[0014]样品裂解：利用裂解液对样品进行裂解处理，静置1‑5min后，得到裂解混合物，将所述裂解混合物转入RNA吸附柱中离心0.5‑1min后，弃掉滤液；[0015]杂质漂洗：向RNA吸附柱中加入漂洗液，离心0.5‑1min后，弃掉滤液，并重复此步骤一次，随后将吸附柱放回空收集管中，离心2‑3min；[0016]RNA洗脱：将吸附柱置于新的离心管中，再向其中加入洗脱液，离心0.5‑3min后，收集滤液即得RNA。[0017]作为优选，在所述样品裂解和杂质漂洗步骤中，离心转速均为12000‑13000rpm。[0018]作为优选，在所述RNA洗脱步骤中，离心转速为10000‑12000rpm。[0019]与现有技术相比，本发明的优点和积极效果在于：[0020]1、本发明提供了一种细胞RNA快速提取试剂盒及RNA提取方法，该试剂盒中的裂解液能够专一结合RNA，在RNA提取过程中无需单独增加去基因组DNA步骤，操作简单，漂洗液能够漂洗掉蛋白、胍盐等杂质，在RNA提取过程中，无需增加去蛋白步骤，且提取得到的RNA纯度高、稳定性好；[0021]2、本发明提供了一种细胞RNA快速提取试剂盒及RNA提取方法，该试剂盒在进行RNA提取时仅有裂解、漂洗和洗脱三步，与现有提取方法相比，操作步骤更为简单，耗时短，单个样品提取仅需6.5min。

附图说明

[0022]图1为本发明实施例所提供的RNA电泳结果示意图。[0023]在上图中，泳道从左至右依次为：DNA marker 2000、对比例1提取的RNA平行样1、对比例1提取的RNA平行样2、实施例3提取的RNA平行样1、实施例3提取的RNA平行样2。具体实施方式

[0024]下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

[0025]本发明实施例提供了一种细胞RNA快速提取试剂盒，包括：裂解液、漂洗液、洗脱液和RNA吸附柱；

[0026]所述裂解液含有盐酸胍4.0‑6.0M、pH6.5‑8.5的Tris‑HCl 0.01‑0.1M、N‑十二烷基肌氨酸钠0.1‑5.0％、氯化钠0.1‑0.5M、EDTA 25‑100mM、异丙醇30‑55％(v/v)；[0027]所述漂洗液含有pH6.5‑7.5的Tris‑HCl 10‑200mM、氯化钠10‑200mM、无水乙醇50‑80％(v/v)。

[0028]在上述技术方案中，所述裂解液中的异丙醇是在裂解液中其他成分配制好后再加入的，所述裂解液中异丙醇的体积分数具体可选取30％(v/v)、35％(v/v)、40％(v/v)、45％(v/v)、50％(v/v)、55％(v/v)或在使用过程中根据实际所需选取上述范围内的任一数值均落在本发明的保护范围之内，其中，异丙醇的体积分数优选50％，所述漂洗液中的无水乙醇也是在漂洗液中其他成分配制好后再加入的，所述漂洗液中无水乙醇的体积分数具体可选

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取50％(v/v)、60％(v/v)、70％(v/v)、80％(v/v)或在使用过程中根据实际所需选取上述范围内的任一数值均落在本发明的保护范围之内，其中，无水乙醇的体积分数优选80％。[0029]由上述技术方案可知，本发明提供了一种新型细胞RNA快速提取试剂盒，该试剂盒通过优化裂解液和漂洗液的配方，使得该试剂盒具有操作简单、耗时短、提取的RNA纯度高且稳定性好的技术效果，具体地，裂解液和漂洗液的具体优化方案如下：[0030]一方面，本发明提供的试剂盒通过优化裂解液中高离序盐和异丙醇的浓度，使得二者以合适配比组合，既能达到充解细胞的目的，也保证了合适的盐浓度及异丙醇配比特异性结合RNA，无需单独增加去基因组DNA步骤，简化了操作步骤；[0031]进一步地，裂解液中选用的是沉降效果更好的异丙醇，而非无水乙醇，并将其比例限定在30‑55％，配以浓度为4.0‑6.0M的盐酸胍，使其在提取过程中能够专一的结合RNA，且结合的RNA是包含miRNA的总RNA。[0032]另一方面，本发明提供的试剂盒中漂洗液包括三种组分，分别为提供缓冲作用的Tris，提供阳离子的阳离子盐和一定比例的乙醇，本发明提供的漂洗液将乙醇的比例调为50‑80％，在该添加比例下，能使得漂洗效果达到最佳。此外，现有的RNA提取试剂盒中漂洗液一般包括去蛋白液和漂洗液两种试剂，二者搭配使用才能达到漂洗效果，而本发明的试剂盒中只有漂洗液，无去蛋白液，提取的RNA纯度稳定且符合标准。[0033]在一优选实施例中， H2O。所述洗脱液为RNase Free[0034]在一优选实施例中，所述洗脱液是一种加入蛋白酶K，终浓度为0.5‑1.5ng/mL，再经消化、灭菌处理后的溶液。[0035]在一优选实施例中，所述RNA吸附柱为硅膜吸附柱。[0036]在一优选实施例中，所述试剂盒用于人肺癌细胞A9、中国仓鼠卵巢细胞亚株CHO‑K1、人肝癌细胞HEPG2、小鼠胚胎肌母细胞C2C12、大鼠心肌细胞H9C2或小鼠胚胎成骨细胞前体细胞MC3T3‑E1的提取，可以理解的是，本发明提供的细胞RNA快速提取试剂盒的应用范围包括但不仅局限于上述几种细胞类型，对于其他类型的细胞RNA提取同样适用。

[0037]本发明还提供了一种利用上述任一优选实施例所述细胞RNA快速提取试剂盒的RNA提取方法，所述方法包括如下步骤：[0038]S1、样品裂解：利用裂解液对样品进行裂解处理，静置1‑5min后，得到裂解混合物，将所述裂解混合物转入RNA吸附柱中离心0.5‑1min后，弃掉滤液；[0039]S2、杂质漂洗：向RNA吸附柱中加入漂洗液，离心0.5‑1min后，弃掉滤液，并重复此步骤一次，随后将吸附柱放回空收集管中，离心2‑3min；[0040]S3、RNA洗脱：将吸附柱置于新的离心管中，再向其中加入洗脱液，离心0.5‑3min后，收集滤液即得RNA。

[0041]由上述技术方案可知，本发明提供的细胞RNA快速提取试剂盒的RNA提取方法仅包括三个步骤，即样品裂解步骤、杂质漂洗步骤和RNA洗脱步骤，而现有的RNA提取方法包括裂解、DNA清除、乙醇吸附RNA、去蛋白、漂洗、空离以及洗脱等步骤，由此可见，与现有提取方法相比，本发明提供的提取方法操作步骤更为简单、耗时短，提取单个样品时仅需6.5min即可完成，且提取得到的RNA纯度高且稳定性好。[0042]在一优选实施例中，在所述样品裂解和杂质漂洗步骤中，离心转速均为12000‑13000rpm。

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在一优选实施例中，在所述RNA洗脱步骤中，离心转速为10000‑12000rpm。

[0044]为了更清楚详细地介绍本发明实施例所提供的一种细胞RNA快速提取试剂盒及RNA提取方法，下面将结合具体实施例进行描述。[0045]对比例1

[0046]本对比例提供了一种目前市面上常用的细胞RNA提取试剂盒及RNA提取方法，具体内容如下：

[0047]细胞RNA提取试剂盒包括：裂解液、去蛋白液、漂洗液、洗脱液、RNA吸附柱、DNA清除柱；

[0048]提取方法：[0049](1)样本处理：对于悬浮细胞直接离心收集沉淀加裂解液裂解，对于贴壁细胞，可以直接裂解或者胰蛋白酶消化后收集再裂解；[0050](2)加入裂解液吹打细胞，混匀后用手剧烈振荡20s，充解；[0051](3)将裂解混合物全部加到DNA清除柱上(清除柱放在收集管内)，如混合物过多可分两次过柱；[0052](4)立刻12,000rpm离心60s，保留滤过液(RNA在滤过液中)；[0053](5)精确估计滤过液体积加入等体积的70％乙醇，开始本步骤前需先检查是否已加入无水乙醇；[00](6)立刻将混合物(每次小于700μL，多可以分两次加入)加入RNA吸附柱中(吸附柱放入收集管中)，12,000rpm离心60s，弃废液；[0055](7)加去蛋白液，室温放置1min，12,000rpm离心60s，弃废液；[0056](8)加入漂洗液，使用前需先检查是否已加入无水乙醇，12,000rpm离心60s，弃废液；[0057](9)重复步骤(8)一遍；[0058](10)将RNA吸附柱放回空收集管中，12,000rpm离心2min；[0059](11)取出RNA吸附柱，放入干净的RNase Free离心管中，根据预期RNA产量在吸附膜的中间部位加RNase Free H2O，室温放置1min，12,000rpm离心1min。[0060]实施例1

[0061]本实施例提供了一种细胞RNA快速提取试剂盒，该试剂盒具体包括：裂解液、漂洗液、洗脱液和RNA吸附柱；[0062]其中，裂解液组分为：盐酸胍4.0M、pH6.5的Tris‑HCl 0.01M、N‑十二烷基肌氨酸钠0.1％、氯化钠0.1M、EDTA 25mM，配好后加入异丙醇30％(v/v)；[0063]漂洗液组分为：pH6.5的Tris‑HCl 10mM、氯化钠10mM，配好后加入无水乙醇50％(v/v)；

[00]洗脱液：RNase Free H2O；[0065]RNA吸附柱：硅膜吸附柱。[0066]实施例2

[0067]本实施例提供了一种细胞RNA快速提取试剂盒该试剂盒具体包括：裂解液、漂洗液、洗脱液和RNA吸附柱；[0068]其中，裂解液含有盐酸胍6.0M、pH8.5的Tris‑HCl 0.1M、N‑十二烷基肌氨酸钠

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5.0％、氯化钠0.5M、EDTA 100mM，配好后加入异丙醇55％(v/v)；[0069]漂洗液含有pH7.5的Tris‑HCl 200mM、氯化钠200mM，配好后加入无水乙醇80％(v/v)；

[0070]洗脱液：RNase Free H2O；[0071]RNA吸附柱：硅膜吸附柱。[0072]实施例3

[0073]本实施例提供了一种细胞RNA快速提取试剂盒的RNA提取方法，具体内容如下：[0074]样品：悬浮培养的细胞或者经消化脱落的贴壁细胞；[0075]试剂盒：选用实施例1所示的细胞RNA快速提取试剂盒；[0076]提取方法：[0077](1)对于悬浮培养的细胞或者经消化脱落的贴壁细胞离心收集，弃掉上清留下细胞沉淀，细胞量为(1‑2)×106，向处理好的样本管中加入500μL裂解液后，立即剧烈震荡或吹打混匀直至没有细胞团块，静置1min，得到裂解混合物；[0078](2)将裂解混合物转入RNA吸附柱中(吸附柱放入收集管中)，于12000rpm转速下离心30s，弃掉滤液；[0079](3)向吸附柱内加入500μL漂洗液(在加入前需确认是否已加入无水乙醇)，于12000rpm转速下离心30s，弃掉滤液；[0080](4)重复步骤(3)一次；[0081](5)将吸附柱RA放回空收集管中，于12000rpm转速下离心2min，尽量除去漂洗液，以免漂洗液中残留乙醇抑制下游反应；[0082] Free离心管中，在吸附膜的中间部位加入(6)取出吸附柱，将其置于干净的RNase25‑50μL洗脱液，为提高RNA收率可事先将洗脱液进行70‑90℃水浴，室温放置1min，于10000rpm转速下离心1min，收集滤液即得细胞样品RNA。[0083]电泳检测分析：

[0084]本发明还对上述对比例和实施例提取得到的RNA样品分别进行浓度检测和电泳检测，具体检测结果如下表所示：

[0085]表1对比例与实施例提取RNA浓度检测结果

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电泳结果如图1所示，图中泳道从左至右依次为：DNA marker 2000、对比例1提取

的RNA平行样1、对比例1提取的RNA平行样2、实施例3提取的RNA平行样1、实施例3提取的RNA平行样2，其中，DNA marker 2000泳道中的条带自上而下依次为2000bp、1000bp、750bp、500bp、250bp、100bp。

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由图1可看出，第4、5泳道中可看到三条清晰的条带，从上至下分别为28S、18S和

5S，且28S亮度大于18S，这表明RNA完整性好，且没有基因组DNA残留，提取效果好，而第2、3泳道中无5S条带，这表明对比例1提取的RNA中不包含miRNA的mRNA，因此，对比例1提供的常规细胞RNA提取试剂盒在提取简单细胞样时的操作步骤较为繁琐，吸附柱结合RNA时要调节上柱环境，同时需增加去基因组DNA步骤，且容易出现RNA纯度不稳定现象；同时提取的RNA为mRNA，而利用本发明提供的细胞RNA快速提取试剂盒及提取方法不仅操作简单、耗时短，且提取得到的RNA纯度高、完整性好，无基因组DNA残留，由此可见，本发明提供的细胞RNA快速提取试剂盒在分子生物学检测技术领域，尤其是RNA提取技术领域具备十分广阔的应用前景。

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图1

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