青岛农业大学学报（自然科学版） ３０（３）：１９５～１９９，２０１３ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｑｉｎｇｄａｏ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ（Ｎａｔｕｒａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ） 文章编号：１６７４—１４８Ｘ（２０１３）０３—０１９５一Ｏ５ Ｈ９亚型禽流感病毒ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｉ荧光定量 ＲＴ—ＰＣＲ法检测方法的建立 徐守振，尹燕博 （青岛农业大学动物科技学院，山东青岛２６６１０９） 摘要：ＲＴ—ＰＣＲ扩增Ｈ９亚型禽流感病毒（ＡＩＶ（Ｈ９））的ＨＡ基因保守片段，将其克隆到ｐＭＤ１８一Ｔ载体，经测序验 证正确作为阳性质粒。以阳性质粒为标准品，建立ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｉ荧光定量ＲＴ—ＰＣＲ的标准曲线。结果表明，该方 法灵敏性可达７４．３ｃｏｐｉｅｓ／￣Ｌ，且特异性好、重复性佳。ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｉ实时荧光定量ＲＴ—ＰＣＲ方法为Ｈ９亚型禽流 感的病原的快速诊断和病毒的定量分析提供重要手段。 关键词：Ｈ９亚型禽流感病毒；ＨＡ基因；ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｉ荧光定量ＰＣＲ 中图分类号：￥８５２．６５ 文献标识码：Ａ ＤＯＩ：１０．３９６９／Ｊ．ＩＳＳＮ．１６７４—１４８Ｘ．２０１３．０３．００９ Ｅｓｔａｂｌｉｓｈｍｅｎｔ ｏｆ ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｉ Ｒｅａｌ－ｔｉｍｅ ＲＴ—ＰＣＲ Ｄｅｔｅｃｔｉｎｇ Ｈ９ Ａｖｉａｎ Ｉｎｆｌｕｅｎｚａ Ｖｉｒｕｓ ＸＵ Ｓｈｏｕｚｈｅｎ。ＹＩＮ Ｙａｎｂｏ （Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ａｎｉｍａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，Ｑｉｎｇｄａｏ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｑｉｎｇｄａｏ ２６６１０９，Ｃｈｉｎａ） Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｃｏｎｓｅｒｖａｔｉｖｅ ｆｒａｇｍｅｎｔ ｏｆ ＨＡ ｇｅｎｅ ｏｆ ＡＩＶ（Ｈ９）ｗａｓ ａｍｐｌｉｆｉｅｄ ｂｙ ＲＴ—ＰＣＲ ａｎｄ ｃｌｏｎｅｄ ｉｎｔｏ ｐＭＤ１８一Ｔ ｖｅｃｔｏｒ．Ａｆｔｅｒ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ，ｔｈｅ ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｐｌａｓｍｉｄ ｗａｓ ａｃｑｕｉｒｅｄ ａｎｄ ｕｓｅｄ ｔｏ ｅｓｔａｂｌｉｓｈ ｓｔａｎｄａｒｄ ｃｕｒｖｅ ｏｆ ｔｈｅ ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｉ ｒｅａｌ—ｔｉｍｅ ＲＴ－ＰＣＲ．Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅ ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ ｗａｓ ｓｏ ｇｏｏｄ ｔｈａｔ ７４．３ ｃｏｐｉｅｓ／￣Ｌ ｏｆ ｔｈｅ ｖｉｒｕｓ ｃｏｎｔｅｎｔ ｃｏｕｌｄ ｂｅ ｄｅｔｅｃｔｅｄ．Ｆｕｒｔｈｅｒｍｏｒｅ，ｔｈｉｓ ｍｅｔｈｏｄ ｗａｓ ｈｉｇｈｌｙ ｓｐｅ— ｃｉｆｉｃ ａｎｄ ｒｅｐｒｏｄｕｃｉｂｌｅ．Ｉｔ ｉｓ ｃｏｎｃｌｕｄｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅ ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｉ ｒｅａｌ—ｔｉｍｅ ＲＴ—ＰＣＲ ｉｓ ａ ｇｏｏｄ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ｆｏｒ ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃ ｄｉａｇｎｏｓｉｓ ａｎｄ ｖｉｒｕｓ ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ＡＩＶ（Ｈ ９）． Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ：Ｈ９Ｎ２ ａｖｉａｎ ｉｎｆｌｕｅｎｚａ ｖｉｒｕｓ；ＨＡ ｇｅｎｅ；ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｉ Ｒｅａｌ—ｔｉｍｅ ＲＴ—ＰＣＲ 禽流感（ａｖｉａｎ ｉｎｆｌｕｅｎｚａ，ＡＩ）是由于正黏病毒科 流感病毒属的Ａ型流感病毒（ＡＩＶ）引起的一种禽 养禽生产造成的巨大影响和损失，如何快速准确地 检测ＡＩＶ（Ｈ９）已成为防控的关键。 类或人类感染的传染病。根据ＡＩＶ的血凝素（ＨＡ） 和神经氨酸酶（ＮＡ）抗原差异，ＡＩＶ可分为１６个 ＨＡ亚型（Ｈ１～Ｈ１６）和９个ＮＡ亚型（Ｎ１～ 禽流感ＡＩ（Ｈ９）与新城疫（ＮＤ）、鸡传染性支气 管炎（ＩＢ）临床症状相似，给ＡＩ（Ｈ９）的诊断造成了 极大困难。传统的病毒分离和血清学诊断方法费时 费力，不利于ＡＩＶ（Ｈ９）的快速诊断；而常规ＲＴ— Ｎ９）口］。Ｈ９亚型ＡＩＶ（ＡＩＶ（Ｈ９））于１９６６年在美 国威斯康星在火鸡中首次发现，自１９９９年以来也出 现ＡＩＶ（Ｈ９）多次感染人的报道。目前，ＡＩＶ（Ｈ９） ＰＣＲ方法由于实验室污染等原因存在一定的假阳 性，且不能对病毒进行定量分析＿３］。近年发展起来 的实时荧光定量ＰＣＲ（Ｒｅａｌ－ｔｉｍｅ ＰＣＲ）技术以其快 在我国广泛存在，可引起雏鸡死亡，生产性能下降， 常与其他病原（如大肠杆菌）混合感染，给养禽业造 速简单、高度灵敏和强特异性等优点广泛应用到基 因表达分析，并引用到ＡＩＶ的定性和定量检 成严重经济损失Ｉ２］。鉴于ＡＩＶ（Ｈ９）对人类健康和 收稿日期：２０１３—０７—０９ 基金项目：青岛市公共领域科技支撑计划（１０－３－３—１７一ｎｓｈ）；山东省现代农业产业技术体系家禽创新团队项目 作者简介：徐守振（１９７７一），男，山东沂水人，副教授，博士，主要从事禽病防治研究。 青岛农业大学学报（自然科学版） 测［４ ］，但Ｒｅａｌ—ｔｉｍｅ ＰＣＲ方法用于检测ＡＩＶ（Ｈ９） 临床样品的研究很少。本试验旨在建立快速检测临 床病料中ＡＩＶ（Ｈ９）的ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｉ Ｒｅａｌ—ｔｉｍｅ ＰＣＲ检测方法，为ＡＩＶ（Ｈ９）的快速诊断和定量分 析提供了必要的工具。 １ 材料与方法 １．１ 毒株 禽流感病毒（ＡＩＶ，Ｈ９Ｎ２）、新城疫病毒（ＮＤＶ， Ｌａｓｏｔａ株）、鸡传染性支气管炎病毒（ＩＢＶ，ＨＩ２０株） 由山东澳兰百特生物工程有限公司惠赠；禽流感病 毒Ｈ５和Ｈ７亚型标准抗原（灭活病毒）购自哈尔滨 兽医研究所；鸡传染性喉气管炎病毒（ＩＬＴＶ，活疫 苗）购自梅里亚动物保健有限公司；鸡传染性法氏 囊病毒（ＩＢＤＶ，活疫苗）和大肠杆菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）由青 岛农业大学预防兽医学实验室保存。 １．２ 主要试剂 总ＲＮＡ抽提试剂Ｔｒｉｚｏｌ购自Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ公 司；Ｍ—ＭＬＶ反转录酶购自Ｐｒｏｍｅｇａ公司；ＲＮａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ购自Ｔｏｙｏｂｏ公司；ｒＴａｑ ＤＮＡ聚合酶、 ｄＮＴＰｓ和ＤＮＡ Ｍａｒｋｅｒ购自宝生物工程（大连）有 限公司；ｐＭＤ１８一Ｔ载体购自宝生物工程（大连）有 限公司；凝胶回收试剂盒和质粒小提试剂盒购自生 工生物工程（上海）有限公司；ＦａｓｔＳｔａｒｔ Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｍａｓｔｅｒ（ＲＯＸ）试剂盒及荧光ＰＣＲ仪 购自杭州博日生物技术有限公司。 １．３ 引物设计 参照ＧｅｎＢａｎｋ已登录的ＡＩＶ（Ｈ９）的ＨＡ基因 保守区，利用Ｏｌｉｇｏ ６．０软件设计了１对特异性引 物。上游引物和下游引物分别为： ５ 一ＣＡＡＣＡＡＡＣＴＣＣＡＣＡＧＡＡＡＣＴ一３ ５ 一ＡＴＣＴＧＡＡＣＡＴＧＣＴＴＴＧＣＴＴＧ一３ 扩增目的片断大小为３８０ｂｐ，由北京六合华大 基因科技股份有限公司合成。 １．４病毒ＲＮＡ的提取 按照Ｔｒｉｚｏｌ试剂盒说明书提取ＡＩＶ（Ｈ９）病毒 总ＲＮＡ。 １．５ 阳性标准品的制备 反转录体系：ＲＮＡ模板４ Ｌ，５×Ｂｕｆｆｅｒ ４ｇＬ， ｄＮＴＰ（１０ｍｍｏｌ／Ｌ）２ Ｌ，Ｍ—ＭＬＶ（２００Ｕ／ｕＬ）１ Ｌ， ＲＮａｓｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ（１０Ｕ／ｇＬ）１ＦＬ，上游引物（３０ｐｍｏｌ／ Ｌ）１ＦＬ，加ＤＥＰＣ灭菌水至２Ｏ Ｌ，混匀。进行以下 循环：４２℃６０ｒａｉｎ，９８℃５ｍｉｎ，４℃５ｍｉｎ，反应后瞬 间离心，ＰＣＲ扩增或一２０℃保存备用。ＰＣＲ体系： １０×Ｂｕｆｆｅｒ ３肚Ｌ，ＭｇＣ１２ ３ Ｌ，ｄＮＴＰ（１０ｍｍｏｌ／Ｌ） ２．５ＦＬ，ｒＴａｑ酶０．５ＦＬ，上下游引物各０．５ＦＬ，反转 录产物２ＦＬ，加双蒸水至３０ＦＬ，混匀。ＰＣＲ扩增： ９５℃５ｍｉｎ；９５℃５０ｓ、５５℃４０ｓ、７２℃６０ｓ，３０个循 环；７２℃１０ｍｉｎ。ＰＣＲ产物经琼脂糖凝胶电泳，回 收纯化目的片段，后克隆到ｐＭＤ１８一Ｔ载体，经ＰＣＲ 鉴定和测序验证后的阳性质粒命名为ｐＭＤ～ＨＡ，分 光光度计测其ＯＤ。。 和ＯＤ。 值，根据以下公式 计算其拷贝数，～２Ｏ℃保存作为标准品备用。 唧ｉｅｓ／ＦＬ一６．０２ Ｘ １０ｚａ Ｘ １．６标准曲线的建立 质粒标准品连续１０倍梯度稀释，选定１Ｏ ～ １Ｏ ６个稀释度作为模板进行Ｒｅａｌ—ｔｉｍｅ ＰＣＲ反 应，制作标准曲线。反应体系２５ＦＬ，其中１×Ｆａｓｔ— Ｓｔａｒｔ Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｍａｓｔｅｒ（ＲＯＸ） １２．５ＦＬ，上下游引物（３０ｐｍｏｌ／ＦＬ）各０．５ＦＬ，模板 ２．０／，Ｌ，ｄｄＨ２Ｏ ９．５肚Ｌ。反应条件：９５℃１０ｍｉｎ； ９５℃１５ｓ、５５℃６０ｓ，共４Ｏ个循环。反应结束后先加 热至９５℃１５ｓ，后降至６Ｏ℃，开始以０．２℃／ｓ递增加 热至９５℃，检测荧光信号得出扩增产物的熔解曲 线。每次试验均设立１个空白对照即不加模板，当 空白对照为阴性时，试验有效。 １．７敏感性试验 阳性质粒１Ｏ倍梯度稀释到最低浓度为几个 ｃｏｐｉｅｓ／ＦＬ，以其作为未知模板进行检测，得出Ｒｅａｌ— ｔｉｍｅ ＰＣＲ所能检出的最低模板拷贝数。阳性判定 标准为３Ｏ个循环内出现荧光信号。 １．８特异性试验 以ＡＩＶ（Ｈ９）、ＡＩＶ（Ｈ７）、ＡＩＶ（Ｈ５）、ＮＤＶ、 ＩＢＶ、ＩＬＴＶ、ＩＢＤＶ和Ｅ．ｃｏｌｉ等病毒和细菌的ＤＮＡ 或ｅＤＮＡ为模板，检验该方法的特异性，同时设阴 性和阳性对照。 １．９重复性试验 分别取３个１Ｏ倍梯度稀释的质粒标准品进行 组内和组间重复试验（每个样品３次重复），统计学 方法计算标准差和变异系数，检验该方法的重复性。 １．１０临床样品的检测 对来自山东不同地区送检的５０份疑似临床病 料进行检测，同时用普通ＲＴ—ＰＣＲ进行对照检测。 ２ 结 果 ２．１标准阳性质粒的制备 以ＡＩＶ（Ｈ９）ｅＤＮＡ为模板，ＰＣＲ扩增获得 ３期 馀守振，等：Ｈ９亚型禽流感病毒ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｉ荧光定量ＲＴ－ＰＣＲ法检测方法的建立 ４ 一 ｉ ６ １９９ 参考文献： Ｉ２１］Ｍｏｎｎｅ Ｉ，Ｏｒｍｅｌｌｉ Ｓ，Ｓａｌｖｉａｔｏ Ａ，ｅｔ ａ１．Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ａｎｄ ｖａｌｉｄａ— ｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｏｎｅ－ｓｔｅｐ ｒｅａｌ ｔｉｍｅ ＰＣＲ ａｓｓａｙ ｆｏｒ ｓｉｍｕｌｔａｎｅｏｕｓ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ［７］Ｍ Ｂｅｎ Ｓｈａｂａｔ，Ｒ Ｍｅｉｒ，Ｒ Ｈａｄｄａｓ，ｅｔ ａ１．Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ ａ ｒｅａｌ— ｔｉｍｅ ＴａｑＭａｎ ＲＴ—ＰＣＲ ａｓｓａｙ ｆｏｒ ｔｈｅ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｈ９Ｎ２ ａｖｉａｎ ｉｎ— ｏｆ ｓｕｂｔｙｐｅ Ｈ５，Ｈ７，ａｎｄ Ｈ９ ａｖｉａｎ ｉｎｆｌｕｅｎｚａ ｖｉｒｕｓｅｓ［－Ｊ＇］．Ｊｏｕｒｎａｌ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，２００８，４６（５）：１７６９—１７７３ ｆｌｕｅｎｚａ ｖｉｒｕｓｅｓ［Ｊ￣．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｖｉｒｏｌｏｇｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ，２０１０，１６８： ７２—７７ ［２］徐守振，王光，郭艳艳，等．胶东地区规模鸡场３种主要病毒感染 情况的调查［Ｊ］．动物医学进展，２０１０，３１（２）：７８—８３ ［３］宫爱艳，吴胜昔，胡仁健，等．荧光ＲＴ—ＰＣＲ与常规ＲＴ—ＰＣＲ检 测禽流感病毒比较研究［Ｊ］．重庆工学院学报，２００６，２０（１１）：８ —［８］Ｎａｊｍｅｈ Ｍｏｓｌｅｈ，Ｈａｂｉｂｏｌｌａｈ Ｄａｄｒａｓ，Ａｌｌ Ｍｏｈａｍｍａｄｉ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｏｎ ｏｆ ＨｇＮ２ ａｖｉａｎ ｉｎｆｌｕｅｎｚａ ｖｉｒｕｓ ｉｎ ｖａｒｉｏｕｓ ｏｒｇａｎｓ ｏｆ ｂｒｏｉｌｅｒ ｃｈｉｃｋｅｎｓ ｕｓｉｎｇ ＴａｑＭａｎ ｒｅａｌ ｔｉｍｅ ＰＣＲ［Ｊ］．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ａｎｄ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，２００９，３（１）：１５２—１５７ １０ ［９］王秋泉，黄平，胡守旺，等．建立禽流感Ｈ７和Ｈ９亚型荧光定量 ＰＣＲ检测方法［Ｊ］．第三军医大学学报，２０１０，３２（３）：２４６—２４９ ［１Ｏ］刘丽玲，姜永萍，王秀荣，等．ＳＹＢＲＧｒｅｅｎＩ荧光ＲＴ—ＰＣＲ方法 ［４］Ｌｅｓｔｅｒ Ｊ Ｐ￣ｒｅｚ，Ｈ Ｄｉａｚ ｄｅ Ａｒｃｅ，Ｆ Ｃｉｌｌｏｎｉ，ｅｔ ａ１．Ａｎ ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ— ｂａｓｅｄ ｒｅａｌ—－ｔｉｍｅ ＲＴ－ＰＣＲ ａｓｓａｙ ｆｏｒ ｔｈｅ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｈ５ ｈｅｍａｇ－－ ｇｌｕｔｉｎｉｎ ｓｕｂｔｙｐｅ ａｖｉａｎ ｉｎｆｌｕｅｎｚａ ｖｉｒｕｓ［Ｊ］．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ａｎｄ Ｃｅｌｌｕ— ｌａｒ Ｐｒｏｂｅ，２０１２，２６：１３７—１４５ 检测禽流感病毒［Ｊ］．畜牧兽医学报，２００６，３７（１１）：１１８９— １１９３ ［５］金一，李毅，张国中，等．禽流感病毒ＮＳ基因荧光定量ＰＣＲ检 测方法的建立［Ｊ］．中国兽医杂志，２００９，４５（１０）：１８—１９ ［６］卢亦愚，严菊英，冯燕，等．ＴａｑＭａｎ—ＭＧＢ荧光定量ＲＴ－ＰＣＲ技 术快速检测Ｈ５亚型禽流感病毒［Ｊ］．中国病毒学，２００６，２１（５）： ［１１］Ｊｉｎｇ Ｌｖ，Ｂａｏｚｈｉ Ｗｅｉ，Ｔｏｎｇｊｉｅ Ｃｈａｉ，ｅｔ ａ１．Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ ａ ｒｅａｌ— ｔｉｍｅ ＲＴ—ＰＣＲ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｒａｐｉｄ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｈ９ ａｖｉａｎ ｉｎｆｌｕｅｎｚａ ｖｉｒｕｓ ｉｎ ｔｈｅ ａｉｒ［Ｊ］．Ａｒｃｈｉｖｅｓ ｏｆ ｖｉｒｏｌｏｇｙ，２０１１，１５６：１７９５— １ ８Ｏ１ （上接１８７页） 呈现梅红色，这可能与物种特异性有关，有待于进一 步的解剖观察分析［６］。 在对山茶属植物胚状体研究中，茶梅（Ｃ． ｓａｓａｎｑｕａ）、防城金花茶（Ｃ．ｃｈｒｙｓａｎｔｈａ ｖａｒ． １ｏｎｇｉｓｔｙｌａ）等多个物种胚状体都是在１．Ｏｍｇ／Ｌ ６ 一参考文献： ［１］王仁卿，张治国，石竹，等．青岛山茶的多样性研究Ⅲ．生态学分 析［Ｊ］．山东大学学报（自然科学版），１９９９，３４（１）：１０９—１１６ ［２］王奎玲．耐冬山茶种质资源研究［Ｄ］．北京：北京林业大学博士 学位论文，２００６：２５—２６ ［３］Ｐｏｎｓａｍｕｅｌ Ｊ，Ｓａｍｓｏｎ Ｎ Ｐ，Ｇａｎｅｓｈａｎ Ｐ Ｓ，ｅｔ ａ１．Ｓｏｍａｔｉｃ ｅｍｂｒｙｏ— ｇｅｎｅｓｉｓ ａｎｄ ｐｌａｎｔ ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｆｒｏｍ ｔｈｅ ｉｍｍａｔｕｒｅ ｃｏｔｙｌｅｄｏｎａｒｙ ＢＡ＋低浓度ＮＡＡ的激素组合条件下易诱导发 生，但发生率一般都在５Ｏ 以下［７ ］。这和本实验 对于胚状体直接诱导的结果相似，只是物种不同，激 素浓度有所差异。在对茶树（Ｃ．ｓｉｎｅｎｓｉｓ）体胚研 ｔｉｓｓｕｅｓ ｏｆ ｃｕｌｔｉｖａｔｅｄ ｔｅａ（Ｃａｍｅｌｌｉａ ｓｉｎｅｎｓｉｓ（Ｌ）．Ｏ．Ｋｕｎｔｚｅ）［Ｊ］． Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｒｅｐｏｒｔｓ，１９９６，１６（３—４）：２１０—２１４ ［４］董慧慧，王奎玲，薛秋华，等．耐冬山茶愈伤组织诱导研究［Ｊ］． 福建林业科技，２００７，３４（３）：１３５—１３８ 究中发现，在胚状体诱导培养基中附加一些渗透调 节剂，如５００＂－－１０００ｍｇ／Ｌ甜菜碱，体胚的发生率会 ［５］赖钟雄，林莉．山茶属植物体细胞胚胎发生研究进展［Ｊ］．福建 农林大学学报（自然科学版），２００４，３３（４）：４７１—４７６ 提高口。。。实验中，耐冬山茶胚性愈伤的诱导率普遍 较高，间接诱导的胚性愈伤可以再进一步诱导为胚 状体，这比直接诱导胚状体更能够获得更多的再生 ［６］张志兰．山茶花组织培养过程中的防外植体褐化试验［Ｊ］．西部 林业科学，２００７，３６（２）：１１８—１２１ ［７］庄承纪，段金玉，周建葵．茶梅体细胞胚胎发生和植株的再生 ［Ｊ］．云南植物研究，１９８８，１０（２）：２４—２４４ 苗。在对金花茶体胚愈伤组织诱导中，ＭＳ＋ １．５ｍｇ／Ｌ ２，４Ｄ＋０．５ｍｇ／Ｌ ＫＴ的培养基中愈伤组 ［８］李红．防城金花茶体细胞胚状体发生的研究［Ｊ］．广西园艺， １９９９，２９（３）：２—３ 织诱导率高，这与本实验采用的组合差异有所不同， 耐冬山茶中对于其他激素组合诱导培养基还有待于 尝试［１ 。目前山茶属中对于其他物种胚性愈伤的 ［９７张智俊，罗淑萍，李亚玲，等．油茶优良无性系子叶体细胞胚植 株再生［Ｊ］．植物学通报，２００５，２２（Ｓ１）：４３—４９ ［１０］Ａｋｕｌａ Ａ，Ａｋｕｌａ Ｃ，Ｂａｔｅｓｏｎ Ｍ．Ｂｅｔａｉｎｅ ａ ｎｏｖｅｌ ｃａｎｄｉｄａｔｅ ｆｏｒ ｒａｐｉｄ ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｓｏｍａｔｉｃ ｅｍｂｒｙｏｇｅｎｅｓｉｓ ｉｎ ｔｅａ（Ｃａｍｅｌｌｉａ 诱导培养基配方报道较少，本实验可以为山茶属植 物通过胚性愈伤诱导的胚状体快速繁殖方式提供 参考。 ｓｉｎｅｎｓｉｓ（Ｌ．）０．Ｋｕｎｔｚｅ）［Ｊ－１．Ｐｌａｎｔ Ｇｒｏｗｔｈ Ｒｅｇｕｌａｔｏｒｓ，２０００， ３０（３）：２４１—２４６ ［１１］高宇琼，赖钟雄．金花茶体胚和叶片愈伤组织培养［Ｊ］．亚热带 农业研究，２０１０，６（２）：１３０—１３５
