纸基核酸提取、扩增与检测一体化的检测系统及检测方法[发明专利]

(12)发明专利申请

(10)申请公布号 CN 105273997 A (43)申请公布日 2016.01.27

(21)申请号 201510695760.3(22)申请日 2015.10.21

(71)申请人西安交通大学

地址710049 陕西省西安市咸宁西路28号(72)发明人徐峰 陈玧如 巩燕 冯上升

贝琳达·墨菲(74)专利代理机构西安通大专利代理有限责任

公司 61200

代理人王霞(51)Int.Cl.

C12M 1/38(2006.01)C12M 1/34(2006.01)C12Q 1/68(2006.01)

权利要求书2页 说明书4页 附图1页

()发明名称

纸基核酸提取、扩增与检测一体化的检测系统及检测方法(57)摘要

本发明公开了一种纸基核酸提取、扩增与检测一体化的检测系统及检测方法，属于生物试纸检测技术领域。本发明提供了一种可对任意食品、环境及临床等样本进行核酸提取，任何一种核酸扩增及检测一体化操作，尤其是在纸基上实现核酸提取、恒温扩增(LAMP)及试纸检测，同时提供了一种实现核酸扩增温度的小型手持检测装置。检测结果可轻易用肉眼观察，用手机软件定量。总扩增及检测时间只需大约1小时。与现有其它方法相比，本发明提供的方法可简化核酸提取、扩增和检测，减少操作步骤，实现现场高效的快速检测。 C N 1 0 5 2 7 3 9 9 7 A CN 105273997 A

权 利 要 求 书

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1.一种纸基核酸提取、扩增与检测一体化的检测系统，其特征在于，由检测箱体(1)和检测试纸条组成；

所述检测箱体(1)内部设有加热控温设备，在检测箱体(1)顶部开设腔体(2)，腔体(2)内设有加热腔(3)和检测腔(4)，加热腔(3)的深度大于检测腔(4)；在检测腔(4)上方设有盖板；

所述检测试纸条为侧向流试纸条，包括检测结合垫(6)、层析膜(7)、吸收垫(8)及支撑垫(9)，检测结合垫(6)设置在层析膜(7)的一端，吸收垫(8)设置在层析膜(7)的另一端；在层析膜(7)上设有检测区(11)和对照区(12)；支撑垫(9)设置在层析膜(7)下方，且支撑垫(9)的长度大于层析膜(7)的长度；

所述支撑垫(9)为四层，顶层支撑垫紧贴于层析膜(7)下方；第二层支撑垫的前端处设有扩增结合垫(10)，且在该扩增结合垫(10)上涂覆显色纳米金颗粒层，形成扩增区；第三层支撑垫上设有FTA卡(13)；底层支撑垫的前端处设有底层吸收垫(14)；

所述检测系统还包括用于遮挡扩增结合垫(10)和FTA卡(13)的胶纸(15)。2.根据权利要求1所述的一种纸基核酸提取、扩增与检测一体化的检测系统，其特征在于，所述检测箱体(1)的体积小于7cm×12cm×11cm。

3.根据权利要求1所述的一种纸基核酸提取、扩增与检测一体化的检测系统，其特征在于，加热腔(3)为长方体，体积小于5mm×10mm×25mm；检测腔(4)为圆柱体，直径小于5mm，深度小于10mm。

4.根据权利要求1所述的一种纸基核酸提取、扩增与检测一体化的检测系统，其特征在于，所述加热腔(3)由铝合金制成，加热腔(3)外部包覆隔热材料层。

5.根据权利要求1所述的一种纸基核酸提取、扩增与检测一体化的检测系统，其特征在于，加热腔(3)内的控温范围为环温+5℃～100℃，控温精度达±0.1℃。

6.根据权利要求1所述的一种纸基核酸提取、扩增与检测一体化的检测系统，其特征在于，所述检测腔(4)由聚甲醛制成，检测腔(4)上方的盖板由塑料制成。

7.根据权利要求1所述的一种纸基核酸提取、扩增与检测一体化的检测系统，其特征在于，检测箱体(1)的顶部设有温度调节触控显示屏(5)，检测箱体(1)的内部设有可充电锂离子电池。

8.根据权利要求1所述的一种纸基核酸提取、扩增与检测一体化的检测系统，其特征在于：

层析膜(7)由纤维素膜制成，用于固定待检物与对照物；吸收垫(8)由纤维素膜制成，用于为试纸条内液体流动提供毛细驱动力；检测结合垫(6)和扩增结合垫(10)由玻璃纤维膜或聚酯纤维膜制成，用于承载显色纳米金颗粒；

支撑垫(9)由聚氯乙烯膜制成，用作支持检测结合垫(6)、层析膜(7)及吸收垫(8)的基板。

9.基于权利要求1所述的纸基核酸提取、扩增与检测一体化的检测系统进行检测的方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)先将总量为10μL的待检测样本滴加在FTA卡(13)上，提取核酸，15分钟后用40μL FTA纯化剂及80μL TE缓冲液将FTA卡(13)清洗干净，再将吸收垫(8)拆开；

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权 利 要 求 书

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2)待5分钟后，将扩增结合垫(10)及FTA卡(13)合起，将25μL的扩增试剂及引物滴加在扩增结合垫(10)上，形成扩增区，再用胶纸(15)将扩增区遮盖，使测试纸的扩增区和检测区隔开，然后将测试纸置于检测箱体(1)的加热腔(3)中进行核酸扩增；

3)待扩增完成后，把胶纸(15)拆开，通过单面粘胶让测试纸的扩增区和检测区结合，然后将检测腔(4)的上盖打开，向检测腔(4)中滴加50μL缓冲液，将扩增区和检测区结合的测试纸放入检测腔(4)中进行核酸检测；

4)检测反应完成后，观察检测区和对照区，若检测区和对照区同时显色，表明阳性；若检测区未显色，对照区显色，表明阴性；若检测区和对照区均未显色，结果不可靠，重复检测。

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说 明 书

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纸基核酸提取、扩增与检测一体化的检测系统及检测方法

技术领域

本发明属于生物试纸检测技术领域，具体涉及一种纸基核酸提取、扩增与检测一体化的检测装置及检测方法。

[0001]

背景技术

核酸检测是分子生物学的研究热点，已广泛用于临床疾病诊断和流行性细菌或病

毒检测等领域。随着微流体技术的蓬勃发展，小型化、低成本、便捷化的检测方法，如核酸试纸检测法日渐受到重视。因原样品(血液、唾液、尿液等)成分复杂，核酸浓度偏低，核酸提取及扩增步骤在试纸检测前是有必要的。常规核酸提取及扩增需要昂贵的设备且耗时耗力。相比而言，纸基核酸提取、扩增及试纸检测具有成本低、设计简单、易于使用及携带方便等优点。目前的纸基核酸检测研究，包括使在纸上实现Human Immunodeficiency Virus(HIV)、Chlamydia trachomatis及Influenza A检测，但是纸基提取、扩增与试纸检测分步进行，没有实现三者的一体化集成，使得整体操作步骤复杂，无法进行高效、快速的检测。

[0003] 随着生物技术的发展，低成本、小型化、便携式一体化集成检测法日渐受人们的重视。近日，有相关研究报导，在“造纸机”上实现了核酸提取、扩增与检测一体化集成。然而，核酸扩增需使用外接电源或大功率的大型加热器加热，步骤繁多，还需要外界紫外光采集检测信号，无法达到高效的现场检测。

[0002]

发明内容

为了克服上述现有技术存在的缺陷，本发明的目的在于提供一种纸基核酸提取、扩增与检测一体化的检测装置及检测方法，该检测系统设计精致，温度可控，操作简单；该检测方法能够简化核酸提取、扩增和检测的操作步骤，达到高效、快速检测的目的。[0005] 本发明是通过以下技术方案来实现：[0006] 本发明还公开了一种纸基核酸提取、扩增与检测一体化的检测系统，由检测箱体和检测试纸条组成；

[0007] 所述检测箱体内部设有加热控温设备，在检测箱体顶部开设腔体，腔体内设有加热腔和检测腔，加热腔的深度大于检测腔；在检测腔上方设有盖板；[0008] 所述检测试纸条为侧向流试纸条，包括检测结合垫、层析膜、吸收垫及支撑垫，检测结合垫设置在层析膜的一端，吸收垫设置在层析膜的另一端；在层析膜上设有检测区和对照区；支撑垫设置在层析膜下方，且支撑垫的长度大于层析膜的长度；[0009] 所述支撑垫为四层，顶层支撑垫紧贴于层析膜下方；第二层支撑垫的前端处设有扩增结合垫，且在该扩增结合垫上涂覆显色纳米金颗粒层，形成扩增区；第三层支撑垫上设有FTA卡；底层支撑垫的前端处设有底层吸收垫；

[0004]

所述检测系统还包括用于遮挡扩增结合垫和FTA卡的胶纸。[0011] 所述检测箱体的体积小于7cm×12cm×11cm。

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说 明 书

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加热腔为长方体，体积小于5mm×10mm×25mm；检测腔为圆柱体，直径小于5mm，深度小于10mm。

[0013] 所述加热腔由铝合金制成，加热腔外部包覆隔热材料层。[0014] 加热腔内的控温范围为环温+5℃～100℃，控温精度达±0.1℃。[0015] 所述检测腔由聚甲醛制成，检测腔上方的盖板由塑料制成。[0016] 检测箱体的顶部设有温度调节触控显示屏，检测箱体的内部设有可充电锂离子电池。

[0017] 层析膜由纤维素膜制成，用于固定待检物与对照物；[0018] 吸收垫由纤维素膜制成，用于为试纸条内液体流动提供毛细驱动力；[0019] 检测结合垫和扩增结合垫由玻璃纤维膜或聚酯纤维膜制成，用于承载显色纳米金颗粒；

[0020] 支撑垫由聚氯乙烯膜制成，用作支持检测结合垫、层析膜及吸收垫的基板。[0021] 本发明还公开了基于上述的纸基核酸提取、扩增与检测一体化的检测系统进行检测的方法，包括以下步骤：

[0022] 1)先将总量为10μL的待检测样本滴加在FTA卡上，提取核酸，15分钟后用40μL FTA纯化剂及80μL TE缓冲液将FTA卡清洗干净，再将吸收垫拆开；[0023] 2)待5分钟后，将扩增结合垫及FTA卡合起，将25μL的扩增试剂及引物滴加在扩增结合垫上，形成扩增区，再用胶纸将扩增区遮盖，使测试纸的扩增区和检测区隔开，然后将测试纸置于检测箱体的加热腔中进行核酸扩增；[0024] 3)待扩增完成后，把胶纸拆开，通过单面粘胶让测试纸的扩增区和检测区结合，然后将检测腔的上盖打开，向检测腔中滴加50μL缓冲液，将扩增区和检测区结合的测试纸放入检测腔中进行核酸检测；[0025] 4)检测反应完成后，观察检测区和对照区，若检测区和对照区同时显色，表明阳性；若检测区未显色，对照区显色，表明阴性；若检测区和对照区均未显色，结果不可靠，需重复检测。

[0026] 与现有技术相比，本发明具有以下有益的技术效果：[0027] 本发明公开的纸基核酸提取、扩增与检测一体化的检测系统，由检测箱体和检测试纸条组成，检测箱体内部设有加热控温设备，箱体顶部开设测试腔，测试腔包括一个加热腔和一个常温的检测腔。本系统的检测试纸条为侧向流试纸条，较现有的试纸条，设计了额外的三层支撑垫，能够在纸基上实现核酸提取、恒温扩增及检测。将本发明的试纸条先放置在室温进行核酸提取，加热腔内进行核酸扩增，待扩增完成后再转移到检测腔内进行核酸检测，非常便捷的完成一体化操作，同时本系统可以根据不同的扩增温度进行温度的调节和控制，操作简单，使用方便。

[0028] 本发明公开的核酸提取、扩增及检测方法，先用胶纸将测试纸上的扩增区遮盖，使测试纸的扩增区和检测区隔开，以提防液体蒸发，然后将测试纸放置在加热腔内进行扩增，待扩增完成后，通过单面粘胶让测试纸两个区域结合，并滴加缓冲液后在检测腔中进行检测。本发明提供的方法，能够对任意食品、环境及临床样本进行核酸提取、任何一种核酸扩增及检测一体化操作，尤其是在纸基上实现核酸扩增(LAMP)及其检测一体化集成，纸基LAMP核酸扩增适宜的温度范围为65℃，过程仅需45分钟。总提取、扩增及检测时间大约1

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说 明 书

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小时。附图说明

图1为本发明检测装置的结构示意图；[0030] 图2为本发明检测装置的结构俯视图；[0031] 图3为本发明的试纸条的结构示意图；[0032] 其中，1为箱体；2为腔体；3为加热腔；4为检测腔；5为温度调节触控显示屏；6为检测结合垫；7为层析膜；8为吸收垫；9为支持垫；10为扩增结合垫；11为检测区；12为对照区；13为FTA卡；14为底层吸收垫；15为胶纸。

[0029]

具体实施方式

[0033] 下面结合具体的实施例对本发明做进一步的详细说明，所述是对本发明的解释而不是限定。

[0034] 参见图1和2，本发明公开的一种纸基核酸提取、扩增与检测一体化的检测装置，该装置为便携一体式结构，包括内部设有加热控温设备的检测箱体1，在检测箱体1顶部开设腔体2，腔体2内设有加热腔3和检测腔4，加热腔3的深度大于检测腔4；在检测腔4上方设有盖板。在检测箱体1顶部设有温度调节触控显示屏5，能够实现实测温度与设定温度的双数码显示。[0035] 优选地，检测装置体积不超过7cm×12cm×11cm。腔体2内的加热腔3是个长方体，体积不超过5mm×10mm×25mm。检测腔4是个圆柱体或其它截面形状，直径不超5mm，深度不超过10mm，检测腔体不加热，为常温环境。检测腔4是由耐腐蚀的聚甲醛构成，其顶部设有塑料上盖。

[0036] 加热腔3由导热性能良好耐腐蚀的金属材料构成，如铝合金等。其底面由电加热膜加热，外部有隔热材料保温，以减小腔体内的温度波动。加热腔3的内控温范围为环温+5℃～100℃，控温精度可达最高±0.1℃。

[0037] 纸基LAMP核酸扩增适宜的温度范围为65℃，过程45分钟，后95℃加热30秒，以让核酸变性。

[0038] 加热腔3用以纸基等温核酸扩增，如LAMP、RPA、NASBA、SDA或HDA等。核酸扩增前，将扩增试剂、目标核酸及引物滴加在试纸的结合垫上，然后将试纸条放置在加热腔内。[0039] 所述检测系统的检测箱体1内置可充电锂离子电池，可通过外接充电器充电。充电电源为交流电：电压AC220V±10％；频率：50Hz；最大功率为50W。[0040] 控温以全自动智能PID单向功率控温方式，温度连续可调。在无需外接电源的情况下工作有效时间可维持大约24小时。[0041] 参见图3，本发明所述的测试纸为侧向流试纸条，由检测结合垫6、层析膜7、吸收垫8及支持垫9组成。检测结合垫6设置在层析膜7的一端，吸收垫8设置在层析膜7的另一端；在层析膜7上设有检测区11和对照区12；支撑垫9设置在层析膜7下方，且支撑垫9的长度大于层析膜7的长度；所述支撑垫9为四层，顶层支撑垫与层析膜7结合；第二层支撑垫的前端处设有扩增结合垫10，且在该扩增结合垫10上涂覆显色纳米金颗粒层，形成扩增区；第三层支撑垫为FTA卡13；底层支撑垫的前端处设有底层吸收垫14；还包括用

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于遮挡扩增结合垫10和FTA卡13的胶纸15。

[0042] 试纸扩增区10及滴加纳米金区的结合垫6材料为玻璃纤维膜，用于进行扩增及承载显色纳米金颗粒。层析膜7材料为纤维素膜，用于固定2mg/ml的检测物，链霉素及100μM的对照物，对照分子，形成检测区11与对照区12。吸收垫材料为纤维素，用于给试纸内溶液流动提供毛细驱动力。支持垫材料为聚氯乙烯膜，用作支持结合垫、层析膜、吸收垫的基板。指示颗粒为纳米金颗粒，粒度为13nm。[0043] 为实现核酸提取、扩增与检测一体化，试纸条包括扩增区和检测区两个区域，但两者的结合垫事先被隔开。在FTA卡13上实现核酸提取后，用40μL FTA卡纯化剂及80μL缓冲液进行冲洗，后把底层吸收垫14撕掉。扩增前先将总量为25μL的扩增试剂及引物滴加在试纸的扩增区结合垫上，用胶纸15把扩增区10及FTA卡13遮盖，以提防液体蒸发，然后将试纸条放置在加热腔内，把盖子盖上，再进行扩增。待扩增完成后，通过单面粘胶让两个区域结合，并滴加缓冲液后进行检测。以上所述两个区域的结合垫材料可以是玻璃纤维膜或聚酯纤维膜，都可承载颗粒。[0044] 本发明公开的检测方法，包括以下步骤：

[0045] 1)先将总量为10μL的待检测样本滴加在FTA卡13上，提取核酸，15分钟后用40μL FTA纯化剂及80μL TE缓冲液将FTA卡13清洗干净，再将吸收垫8拆开；[0046] 2)待5分钟后，将扩增结合垫10及FTA卡13合起，将25μL的扩增试剂及引物滴加在扩增结合垫10上，形成扩增区，再用胶纸15将扩增区遮盖，使测试纸的扩增区和检测区隔开，然后将测试纸置于检测箱体1的加热腔3中进行核酸扩增；[0047] 3)待扩增完成后，把胶纸15拆开，通过单面粘胶让测试纸的扩增区和检测区结合，然后将检测腔4的上盖打开，向检测腔4中滴加50μL缓冲液，将扩增区和检测区结合的测试纸放入检测腔4中进行核酸检测；[0048] 4)检测反应完成后，观察检测区和对照区，若检测区和对照区同时显色，表明阳性；若检测区未显色，对照区显色，表明阴性；若检测区和对照区均未显色，结果不可靠，需重复检测。

[0049] 本发明利用链霉素在检测线上捕获带有生物素的扩增物。目标物能与纳米金颗粒结合。捕获分子能与纳米金颗粒结合，也能与目标物特异性结合。对照分子能与捕获分子特异性结合。检测反应完成后，观察检测区11和对照区12，检测结果显双区同时显色，表明阳性；检测区未显色，对照区显色，表明阴性；双区未显色，结果不可靠，需重复检测。[0050] 综上所述，本发明提供了一种可对任意食品、环境及临床等样本进行核酸提取,任何一种核酸扩增及检测一体化操作，尤其是在纸基上实现核酸提取、恒温扩增(LAMP)及试纸检测，同时提供了一种实现核酸扩增温度的小型手持检测装置。检测结果可轻易用肉眼观察，用手机软件定量。总扩增及检测时间只需大约1小时。与现有其它方法相比，本发明提供的方法可简化核酸提取、扩增和检测，减少操作步骤，实现现场高效的快速检测。

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说 明 书 附 图

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图1

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图3

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