橘皮提取物的抗氧化能力与有效成分分析

橘皮提取物的抗氧化能力与有效成分分析

作者：淡小艳，王芳，薛佳尔，谢依锦 来源：《湖北农业科学》2012年第14期

摘要：用不同溶剂（石油醚、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇、去离子水）于室温对橘皮进行提取，得到不同溶剂的橘皮提取物。研究５种溶剂的橘皮提取物对１，１－二苯基－２－苦基肼（ＤＰＰＨ）和亚盐的清除能力，并考察其有效成分的含量。结果表明，５种溶剂的橘皮提取物均具有清除ＤＰＰＨ和亚盐的能力，其中乙酸乙酯提取物的清除能力最强。在５种溶剂的橘皮提取物中柠檬苦素含量有极显著差异，黄酮、总酚的含量也如此；而氯仿提取物和石油醚提取物的单宁含量差异不显著，其他３种提取物的单宁含量差异极显著。乙酸乙酯提取物中各有效成分含量均最高，且相关性分析表明，橘皮提取物清除ＤＰＰＨ和亚盐的能力与其黄酮含量之间存在显著的相关性。

关键词：橘皮；提取物；１，１－二苯基－２－苦基肼（ＤＰＰＨ）；亚盐；抗氧化能力；有效成分

中图分类号：ＴＳ２０２．３ 文献标识码：Ａ 文章编号：0439－８114（２０12）14－3052-04

Antioxidant Ａｂｉｌｉｔｙ ｏｆ ｔｈｅ Ｅｘｔｒａｃｔｓ ｆｒｏｍ Ｏｒａｎｇｅ Ｐｅｅｌｓ and Its Effectire Components

ＤＡＮ Ｘｉａｏ－ｙａｎ，ＷＡＮＧ Ｆａｎｇ，ＸＵＥ Ｊｉａ－ｅｒ，ＸＩＥ Ｙｉ－ｊｉｎｇ

(College of Chemistry and Life Sciences, Zhejiang Normal University, Jinhua 321004, Zhejiang, China)

Ａｂｓｔｒａｃｔ： Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｅｘｔｒａｃｔｓ ｏｆ ｏｒａｎｇｅ ｐｅｅｌｓ ｗａｓ ｏｂｔａｉｎｅｄ ａｔ ｒｏｏｍ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ ｕｓｉｎｇ ｐｅｔｒｏｌｅｕｍ ｅｔｈｅｒ， ｃｈｌｏｒｏｆｏｒｍ， ｅｔｈｙｌ ａｃｅｔａｔｅ， ｎ－ｂｕｔｙｌ ａｌｃｏｈｏｌ ａｎｄ ｗａｔｅｒ ａｓ ｓｏｌｖｅｎｔ． Ｔｈｅ ＤＰＰＨ ｆｒｅｅ ｒａｄｉｃａｌ ａｎｄ ｎｉｔｒｉｔｅ ｓｃａｖｅｎｇｉｎｇ ｃａｐａｃｉｔｙ ｏｆ ｔｈｅ ５ ｅｘｔｒａｃｔｓ ｗｅｒｅ ｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄ； ａｎｄ ｔｈｅ ｃｏｎｔｅｎｔｓ ｏｆ ｔｈｅｉｒ ｍａｉｎ ａｃｔｉｖｅ ｉｎｇｒｅｄｉｅｎｔｓ ｗｅｒｅ ｅｘａｍｉｎｅｄ． Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ａｌｌ ｔｈｅ ｆｉｖｅ ｅｘｔｒａｃｔｓ ｆｒｏｍ ｔｈｅ ｏｒａｎｇｅ ｐｅｅｌｓ ｈａｄ ａｎｔｉｏｘｉｄａｎｔ ａｃｔｉｖｉｔｙ ａｎｄ ｎｉｔｒｉｔｅ－ｓｃａｖｅｎｇｉｎｇ ａｂｉｌｉｔｙ． Ａｎｄ ｔｈｅ ｓｔｒｏｎｇｅｓｔ ａｎｔｉｏｘｉｄａｎｔ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｗａｓ ｏｂｓｅｒｖｅｄ ｉｎ ｅｔｈｙｌ ａｃｅｔａｔｅ ｅｘｔｒａｃｔ． Ｔｈｅ ｃｏｎｔｅｎｔ ｏｆ ｌｉｍｏｎｉ

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ｎ， ｆｌａｖｏｎｏｉｄ， ｔｏｔａｌ ｐｈｅｎｏｌｉｃｓ ａｎｄ ｔａｎｎｉｎｓ ｏｆ ｔｈｅ ｆｉｖｅ ｅｘｔｒａｃｔｓ ｗａｓ ｄｉｆｆｅｒｅｎt． Ｔｈｅ ｈｉｇｈｅｓｔ ｃｏｎｔｅｎｔ ｏｆ ｔｈｅ ｆｏｕｒ ｉｎｇｒｅｄｉｅｎｔｓ ｗａｓ ｄｅｔｅｃｔｅｄ ｉｎ ｅｔｈｙｌ ａｃｅｔａｔｅ ｅｘｔｒａｃｔ； ａｎｄ ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ ａｎａｌｙｓｉｓ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅ ｃｏｎｔｅｎｔ ｏｆ ｆｌａｖｏｎｏｉｄｓ ｅｘｈｉｂｉｔｅｄ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ ｗｉｔｈ ｔｈｅ ａｎｔｉｏｘｉｄａｔｉｖｅ ａｃｔｉｖｉｔｙ ａｎｄ ｎｉｔｒｉｔｅ－ｓｃａｖｅｎｇｉｎｇ ａｂｉｌｉｔｙ ｏｆ ｔｈｅ ｅｘｔｒａｃｔｓ ｆｒｏｍ ｏｒａｎｇｅ ｐｅｅｌｓ．

Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ： ｏｒａｎｇｅ ｐｅｅｌ； ｅｘｔｒａｃｔ； ＤＰＰＨ； ｎｉｔｒｉｔｅ； antioxidant ａｂｉｌｉｔｙ； effective component

柑橘为中国著名果品之一，年产量超过１０７ ｔ［１］。橘皮约占柑橘质量的２０％～４０％，除含维生素Ｃ、精油外，还含有丰富的黄酮类物质［２，３］。近年来，国内外关于橘皮抗氧化成分的研究较多，并取得了较大的进展。已有的报道表明天然橘皮中含有的黄酮类、酚类、精油、色素类、柠檬苦素等都是具有开发潜力的抑菌和抗氧化的化学成分［４－６］。随着人们对食品安全的关注程度不断加大，开发能够清除食品中亚盐的天然活性物质具有广阔的市场前景。目前橘皮的天然提取物对亚盐清除能力的研究尚未见报道，以橘皮为研究材料，分别使用石油醚、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇、去离子水５种不同极性的溶剂进行常压提取，测定５种提取物对１，１－二苯基－２－苦基肼（ＤＰＰＨ）和亚盐的清除能力，并分析其中有效成分的含量，旨在为橘皮的进一步开发利用提供理论依据。 １ 材料与方法 １．１ 材料

１．１．１ 原料与试剂 柑橘购自浙江省金华市水果市场，于４５ ℃条件下将新鲜橘皮烘干，用粉碎机粉碎得橘皮粉，于４ ℃保存备用；ＤＰＰＨ购自日本和光纯药工业株式会社，柠檬苦素标准品购自上海锐谷生物科技有限公司；其余试剂均为分析纯，购自金华市医药有限公司。

１．１．２ 仪器与设备 料理机购自九阳股份有限公司，ＤＺＦ－９１４０Ｂ型真空干燥箱购自上海一恒科学仪器有限公司，Ｒ－１００１－Ｌ旋转蒸发仪购自郑州长城科工贸有限公司，ＵＶ１０００紫外可见分光光度计购自上海天美科学仪器有限公司。 １．２ 方法

１．２．１ ５种溶剂的橘皮提取物的制备 取５０ ｇ橘皮粉，分别加入５００ ｍＬ石油醚、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇和去离子水，提取６ ｈ，离心，收集上清液，再同法提取３

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次。合并上清液，用旋转蒸发仪浓缩，回收溶剂。将浓缩后的样品放入５５ ℃烘箱中烘干，得到５种膏状提取物，于４ ℃冰箱中备用。

１．２．２ 对ＤＰＰＨ清除能力的测定 精确称取１２．０ ｍｇ ＤＰＰＨ，用无水乙醇溶解并定容于２５０ ｍＬ容量瓶中，ＤＰＰＨ浓度为０．１２ ｍｍｏｌ／Ｌ，避光保存［７］。

将不同溶剂提取物用无水乙醇配成浓度为０．０５、０．１０、０．２０、０．４０和０．８０ ｍｇ／ｍＬ的样品液，取２ ｍＬ待测样品，加入２ ｍＬ ０．１２ ｍｍｏｌ／Ｌ ＤＰＰＨ溶液，混匀避光放置３０ ｍｉｎ，在５１７ ｎｍ处测其吸光度（Ａｉ）；以溶剂为参比，于５１７ ｎｍ处测定吸光度（Ａｃ）；同时，取待测样品２ ｍＬ，加入２ ｍＬ无水乙醇，混匀，于５１７ ｎｍ处测定吸光度（Ａｊ）。ＤＰＰＨ清除率＝［１－（Ａｉ－Ａｊ）／Ａｃ］×１００％。

１．２．３ 对亚盐清除能力的测定 采用盐酸萘乙二胺法［８］。向２５ ｍＬ比色管中加入２ ｍＬ ２５ μｇ／ｍＬ ＮａＮＯ２标准溶液、３ ｍＬ样品液（不同提取物用去离子水配成的，浓度为０．０５、０．１０、０．２０、０．４０、０．８０ ｍｇ／ｍＬ），迅速加入适量０．０５ ｍｏｌ／Ｌ HCl调至ｐＨ ３，于８０ ℃水浴１０ ｍｉｎ，然后加入１ ｍＬ ４ ｇ／Ｌ对氨基苯磺酸混合均匀，静置３～５ ｍｉｎ，加入０．５ ｍＬ ２ ｇ／Ｌ盐酸萘乙二胺，振荡混匀，加去离子水定容至２５ ｍＬ，静置１５ ｍｉｎ，以相应的试样空白调零，测定５３８ ｎｍ波长处的吸光度（Ａ样品），亚盐清除率按以下公式计算：清除率＝［１－（Ａ样品－Ａ样空）／Ａ对照］×１００％，式中，Ａ对照为用３ ｍＬ去离子水代替对应体积的样品液试验测得的吸光度；Ａ样空为用２ ｍＬ去离子水代替２ ｍＬ 25 μｇ／mＬ ＮａＮＯ２标准溶液试验测得的吸光度。 １．２．４ 有效成分含量的测定方法

１）总酚含量的测定。采用Ｆｏｌｉｎ－Ｃｉｏｃａlteu试剂比色法［９］。精确称取０．００５ ｇ没食子酸标准样品，用去离子水溶解并定容至５０ ｍＬ，标准溶液浓度为０．１ ｍｇ／ｍＬ。准确量取上述标准溶液０、０．５、１．０、１．５、２．０、２．５、３．０ ｍＬ于７个５０ ｍＬ容量瓶中，各加３０ ｍＬ去离子水，摇匀，再加２．５ ｍＬ福林酚试剂，充分摇匀。１ ｍｉｎ后加入７．５ ｍＬ ２００ ｇ／Ｌ Ｎａ２ＣＯ３溶液，混匀。在７５ ℃水浴反应１０ ｍｉｎ，于７６０ ｎｍ波长下测定吸光度，以没食子酸浓度为横坐标，吸光度为纵坐标制作标准曲线。用最小二乘法作线性回归。按照同样的方法测定样品的吸光度，带入得到的标准方程中即可得到样品总酚的浓度，从而得到提取物总酚的含量。

２）黄酮含量的测定。称取２０ ｍｇ芦丁，用体积分数为１０％的乙醇定容至２５ ｍＬ，备用。取７支具塞试管，分别加入０、０．５、１．０、１．５、２．０、２．５、３．０ ｍＬ芦丁标准溶液，用体积分数为３０％的乙醇补足体积至５ ｍＬ，混匀，各加入

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０．３ ｍＬ ５０ ｇ／Ｌ ＮａＮＯ２，混匀静置５ ｍｉｎ，加入０．３ ｍＬ １００ ｇ／Ｌ Ａｌ（ＮＯ３）３，混匀后静置６ ｍｉｎ，加入４ ｍＬ １ ｍｏｌ／Ｌ ＮａＯＨ，再加入０．４ ｍＬ 体积分数为３０％的乙醇使总体积为１０ ｍＬ，混匀后静置１０ ｍｉｎ，用ＵＶ１０００紫外可见分光光度计于５１０ ｎｍ处测定吸光度，以试剂为空白参比。以芦丁浓度为横坐标，吸光度为纵坐标制作标准曲线。用最小二乘法作线性回归。按照同样的方法测定样品的吸光度，带入得到的标准方程中即可得到样品黄酮的浓度［１０］，从而得到提取物黄酮的含量。

３）单宁含量的测定。采用香草醛比色法［１１］。准确称取０．０５ ｇ单宁溶于５０ ｍＬ甲醇中，分别取上述标准溶液０、０．５、１．０、１．５、２．０ ｍＬ，依次加入２．０、１．５、１．０、０．５、０ ｍＬ甲醇，然后加２ ｍＬ ４０ ｇ／Ｌ香草醛溶液和１．０ ｍＬ浓盐酸，于３０ ℃水浴加热２０ ｍｉｎ，冷却，在５１０ ｎｍ处测定吸光度。以单宁浓度为横坐标，吸光度为纵坐标制作标准曲线。用最小二乘法作线性回归。按照同样的方法测定样品的吸光度，带入得到的标准方程中即可得到样品单宁的浓度，从而得到提取物单宁的含量。

４）柠檬苦素含量的测定。反应液的制备：将１２５ ｍｇ对二－甲氨基苯甲醛溶解于１００ ｍＬ体积比为３５∶６５的硫酸、无水乙醇混合液中，加入０．５ ｍＬ ９ ｇ／Ｌ三氯化铁溶液，现配现用。标准曲线的制作：将柠檬苦素标准品用无水甲醇配成１３０ μｇ／ｍＬ的标准溶液，在６支试管中分别加入０、０．５、０．８、１．２、１．５和２．０ ｍＬ标准溶液，分别加无水乙醇至２．０ ｍＬ，加入反应液５．０ ｍＬ，摇匀，静置３０ ｍｉｎ，在５００ ｎｍ处测定吸光度，以空白溶液为参比溶液。以柠檬苦素浓度为横坐标，吸光度为纵坐标制作标准曲线。用最小二乘法作线性回归。按照同样的方法测定样品的吸光度，带入得到的标准方程中即可得到样品柠檬苦素的浓度［１２］，从而得到提取物柠檬苦素的含量。 ２ 结果与分析

２．１ 有效成分含量测定中各标准方程的建立

１）总酚含量的测定。吸光度（ｙ）与没食子酸浓度（ｘ//μｇ/ｍＬ）的标准曲线的标准方程为＝０．１４４ 0ｘ－０．０３０ ６，ｒ＝０．９９３ ９。

２）黄酮含量的测定。吸光度（ｙ）与芦丁浓度（ｘ//ｍｇ/ｍＬ）的标准曲线的标准方程为＝１．３０１ ９ｘ＋０．００１ ７，ｒ＝０．９９９ ９。

３）单宁含量的测定。吸光度（ｙ）与单宁浓度（ｘ//ｍｇ／１００ ｍＬ）的标准曲线的标准方程为＝０．４９７ ５ｘ－０．０２１ ７，ｒ＝０．９９７ ７。

４）柠檬苦素含量的测定。吸光度（ｙ）与柠檬苦素浓度（ｘ//ｍｇ/ｍＬ）的标准曲线的标准方程为＝５．２３５ 0ｘ－０．１０４ ５，ｒ＝０．９９０ ７。

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２．２ 不同溶剂的橘皮提取物对ＤＰＰＨ的清除能力

由图１可知，不同溶剂的橘皮提取物对ＤＰＰＨ都具有清除作用，清除率与提取物的浓度存在剂量效应关系，当提取物的浓度为０．８0 ｍｇ／ｍＬ时，乙酸乙酯提取物对ＤＰＰＨ的清除率达到９４．２％。由ＩＣ５０计算小软件可以计算出５种溶剂的橘皮提取物的ＩＣ５０分别为乙酸乙酯０．１０６ ｍｇ／ｍＬ、正丁醇０．１７１ ｍｇ／ｍＬ、氯仿０．３１１ ｍｇ／ｍＬ、去离子水０．５８４ ｍｇ／ｍＬ和石油醚０．８８７ ｍｇ／ｍＬ，可见５种溶剂的橘皮提取物中乙酸乙酯提取物对ＤＰＰＨ的清除能力最强。 ２．３ 不同溶剂的橘皮提取物对亚盐的清除能力

由图２可知，５种溶剂的橘皮提取物对亚盐均有一定的清除作用，且清除率与提取物的浓度存在剂量效应关系，当提取物的浓度为０．８0 ｍｇ／ｍＬ时，乙酸乙酯提取物对亚盐的清除率达到６４．２％。由ＩＣ５０计算小软件计算得出５种溶剂的橘皮提取物的ＩＣ５０分别为：乙酸乙酯０．３６６ ｍｇ／ｍＬ、正丁醇０．５３３ ｍｇ／ｍＬ、氯仿１．０２０ ｍｇ／ｍＬ、去离子水１．８１０ ｍｇ／ｍＬ和石油醚４．４１９ ｍｇ／ｍＬ，与清除ＤＰＰＨ的能力表现出相同的特点，５种溶剂的橘皮提取物中乙酸乙酯提取物对亚盐的清除能力最强。

２．４ 不同溶剂的橘皮提取物中有效成分的含量

由表１可知，乙酸乙酯提取物中４种有效成分的含量远高于其他溶剂提取物中各成分的含量，黄酮含量最高，达４０．４０ ｍｇ／ｇ；不同溶剂的橘皮提取物中黄酮含量均为最高。由ＳＰＳＳ １８．０软件计算可知，柠檬苦素含量在５种溶剂的橘皮提取物中有极显著差异，黄酮、总酚的含量也如此；氯仿提取物和石油醚提取物的单宁含量差异不显著，其他３种提取物单宁含量差异极显著。

２．５ 橘皮提取物中有效成分与对ＤＰＰＨ和亚盐清除能力的相关性

橘皮提取物中黄酮、柠檬苦素、总酚和单宁含量与提取物对ＤＰＰＨ和亚盐清除能力的相关性分析结果如表２所示。由表２可知，黄酮含量与ＤＰＰＨ清除率之间呈显著正相关，其相关系数为０．９３６，与亚盐清除率之间呈极显著正相关，其相关系数为０．９６９，所以黄酮含量与提取物对ＤＰＰＨ和亚盐的清除能力之间有良好的相关性。柠檬苦素和总酚的含量与亚盐清除率之间也呈显著正相关。 ３ 结论

５种不同极性溶剂的橘皮提取物均具有清除ＤＰＰＨ和亚盐的能力，其中乙酸乙酯提取物的清除能力最强，表明橘皮中具有清除ＤＰＰＨ和亚盐能力的活性成分主要为中等极性的成分，乙酸乙酯是较为适宜的提取溶剂。

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柠檬苦素含量在５种溶剂的橘皮提取物中有极显著差异，黄酮、总酚的含量也如此；而氯仿提取物和石油醚提取物的单宁含量差异不显著，其他３种提取物单宁含量差异极显著。且５种溶剂的橘皮提取物中黄酮的含量均最大，而且黄酮含量与提取物清除ＤＰＰＨ的能力呈显著正相关，与提取物清除亚盐的能力呈极显著正相关，柠檬苦素与总酚的含量与提取物清除亚盐的能力呈显著正相关，因此推测橘皮的主要抗氧化成分为黄酮，清除亚盐的主要活性成分为黄酮、柠檬苦素、总酚等成分。 参考文献：

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