高转移肝癌ＭＨＣＣ９７细胞中Ｔｗｉｓｔ基因变化与Ｗｎｔ信号传导通路的关系马晓飞，徐静’．刘瑞鸣（广西医科大学第一附属医院，南宁５３００２１）摘要：目的研究高转移肝癌ＭＨＣＣ９７细胞中Ｔｗｉｓｔ基因表达与Ｗｒｉｔ信号通路的关系。方法取对数生长期ＭＨｃｃ９７细胞分为五组，Ａ、Ｂ组分别加入０．０５ｍｏｌ／Ｌ氯化锂分别培养１２、２４ｈ，Ｃ、Ｄ组予０．１ｍｏｌ／Ｌ氯化锂分别堵养１２、２４ｈ激活Ｗｎｔ通路，Ｅ组不干预。采用ＲＴ－ＰＣＲ和荧光定量ＰＣＲ方法观察各组ＴｗｉｓｔｍｌＬＮＡ表达情况。结果两种检测方法均显示ＴｗｉｓｔｍＲＮＡ在Ａ、Ｂ、ｃ、Ｄ组表达均明显高于Ｅ组，Ｐ＜０．０５；Ａ、Ｂ组，ｃ、Ｄ组，Ａ、Ｃ组，Ｂ、Ｄ组间比较，Ｐ均＞Ｏ．０５。结论ＭＨＣＣ９７细胞中Ｗｎｔ通路激活后Ｔｗｉｓｔ基因表达明显升高未激活，即Ｔｗｉｓｔ基因表达与Ｗｎｔ信号传导通路激活关系密切，ｗｎｔ传导通路激活与氯化锂浓度及作用时间无明显相关性。关键词：高转移肝癌细胞，ＭＨＣＣ９７细胞；Ｔｗｉｓｔ基因；Ｗｎｔ信号传导通路中图分类号：Ｒ７３５．７文献标志码：Ｂ文章编号：１００２－２６６Ｘ（２０１０）１９－００８１－０２Ｔｗｉｓｔ基因是在进化过程中的一个保守转录因‘子，属于螺一环一螺（ｂＨＬ—Ｈ）转录因子家族，可调节胚胎发育过程中的细胞重建，并赋予细胞迁移的能力。最近的研究结果表明，Ｔｗｉｓｔ基因在肝细胞癌（ＨＣＣ）组织中高表达对肿瘤的发生、发展起重要作用，Ｔｗｉｓｔ基因的激活可能作为一种新的肿瘤预后判１２、２４１．２．２ｈ激活Ｗｎｔ通路，Ｅ组不干预。Ｔｗｉｓｔ基因表达检测Ｔｒｉｚｏｌ试剂提取五组细胞总ＲＮＡ，电泳证实具有１８Ｓ和２８Ｓ条带的ＲＮＡ用于逆转录实验。利用Ｆｅｍｅｎｔａｓ公司逆转录试剂盒合成ｅＤＮＡ，反应按其说明书建议的操作步骤进行，ｅＤＮＡ产物一２０℃保存备用。两组引物均用Ｐｒｉｌｎｅｒ断指标，或成为肿瘤靶向治疗中的一个新靶点。ｗｎｔ信号传导通路是指由ｗｎｔ基因的信号传导系统，越来越多的证据表明Ｗｎｔ信号通路不仅在胚胎发育中起至关重要的作用，亦与肿瘤的发生和发展密切相关。研究证实，氯化锂可激活肝癌细胞株ＳＭＭｃ７７２ｌＷｎｔ信号通路。２００８年９月一２００９年８月，我们采用氯化锂为激活剂，观察了高转移肝癌细胞ＭＨＣＣ９７中Ｔｗｉｓｔ基因表达情况，进一步探讨其与ｗｎｔ信号通路的关系。１材料与方法３软件自行设计，由上海生工生物技术有限ｍＲＮＡ。ＴｗｉｓｔｍＲＮＡ／ＧＡＰＤＨｍＲＮＡ×１００％公司合成。利用ＲＴ－ＰＣＲ和荧光定量ＰＣＲ方法检测Ｔｗｉｓｔ代表其相对表达量，后者结果以Ｔｗｉｓｔ基因的平均起始模板数（ＳＱ）值／内参平均ｓＱ值表示。１．３统计学方法采用ＳＰＳＳ１３．０统计软件，数据采用嵌套设计和单因素方差分析。检验水准俚＝０．０５。２结果ＲＴ．ＰＣＲ法显示ＴｗｉｓｔｍＲＮＡ相对表达量Ａ、Ｂ、１．１材料肝癌高转移细胞（ＭＨＣＣ９７），购自上海复旦大学肝癌研究所。１０％胎牛血清；ＤＭＥＭ培养基；含１０％胎牛血清，青霉素１００Ｕ／ｎｉｌ、链霉素１００Ｕ／ｍｌ；氯化锂。１．２实验方法１．２．１细胞培养将ＭＨＣＣ９７Ｈ细胞置于ＤＭＥＭＣ、Ｄ、Ｅ组分别为０．５６０．１３、０．４９±０．０５、０．２８４－０．０３、０．７８４－０．０７、０．５８４－４－０．０２。Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ组明显高于Ｅ组，Ｐ均＜０．０５；Ａ、Ｂ组，Ｃ、Ｄ组，Ａ、Ｃ组，Ｂ、Ｄ组比较，Ｐ均＞０．０５（见图１）。荧光定量ＰＣＲ法显示ＴｗｉｓｔｍＲＮＡ在Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ组分别为０．３９０．０１、ｏ．５９±Ｏ．０１、ｏ．６２４－０．０２、０．５３４－４－４－０．０２、０．３１培养基，于标准条件下培养。取指数生长期细胞分为五组，Ａ、Ｂ组分别加入Ｏ．０５ｍｏｌ／Ｌ氯化锂分别培养１２、２４ｈ，Ｃ、Ｄ组予０．１ｍｏｌ／Ｌ氯化锂分别培养基金项目；广西卫生厅重点科研项目（桂卫重２００８３１）。・通讯作者０．０６，Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ明显高于Ｅ组，Ｐ均＜０．０５（见图２）。Ａ、Ｂ组，Ｃ、Ｄ组，Ａ、Ｃ组，Ｂ、Ｄ组间比较，Ｐ均＞Ｏ．０５。３讨论ＨＣＣ的转移是一个复杂的多级的生物学过程，在每一个阶段都通过不同的基因和信号通路进行调８】万方数据图１ＲＴ－ＰＣＲ法注：曲线１－５分别代表Ｃ…Ｂ图２荧光定量ＰＣＲ法ＤＡ、Ｅ组（ＥＭＴ）来获得分离的能力，而且与Ｔｗｉｓｔ基因表达Ｊ。Ｔｗｉｓｔ被认为是在胚胎生长发育阶段的迁移、侵袭和转移过程中，Ｔｗｉｓｔ基因起着重要的能转化良性细胞并促进癌细胞进一步恶化的癌基因‘‘１。Ｗｎｔ信号通路在胚胎正常发育、参与细胞叶分带过程中发挥着重要作用，但这条通路异常持万方数据（ＥＧＦ）及肝细胞生长因子（ＨＧＦ）可诱导不同类型细胞的迁移。相关研究表明，Ｗｎｔ信号对ＨＣＣ的侵袭和转移有促进作用ｎ】。２０％一９０％肝细胞癌（Ｈｃｃ）患者显示经典的Ｗｎｔ信号通路持续激活。综上所述，研究Ｗｎｔ信号通路激活在肝细胞癌的发生、侵袭及转移方面有重要意义。前期研究中我们发现肝癌细胞ＳＭＭＣ７７２１中，Ｔｗｉｓｔ基因可能作为Ｗｒｉｔ通路中的一个信号分子…。为进一步探讨Ｗｎｔ通路与Ｔｗｉｓｔ基因的关系，本实验采用ＲＴ—ＰＣＲ与荧光定量ＰＣＲ两种方法共同验证氯化锂激活Ｗｎｔ信号通路前后Ｔｗｉｓｔ基因在ＭＨ．ＣＣ９７细胞中表达情况，结果表明氯化锂激活Ｗｒｉｔ信号通路后的四组细胞中，Ｔｗｉｓｔ基因表达明显升高，且Ｔｗｉｓｔ基因在氯化锂浓度和两个时间段的表达量均无显著性差异。从方法学而言，荧光定量ＰＣＲ方法较前者检测结果更为精确。本研究结果表明ＭＨＣＣ９７细胞中Ｔｗｉｓｔ基因与Ｗｎｔ信号传导通路不但关系密切，且激活的Ｗｎｔ信号通路可诱导Ｔｗｉｓｔ基因表达增高，提示Ｔｗｉｓｔ基因的表达可能是通过ｗｍ信号传导通路来调节。抑制Ｗｎｔ信号通路激活能否降低Ｔｗｉｓｔ基因表达有待迸一步研究。总之，Ｗｎｔ信号通路和Ｔｗｉｓｔ基因可能是ＨＣＣ发生、发展过程中的重要组成部分，也可能是ＨＣＣ治疗中的一个新靶点，值得深入研究。参考文献：【１］董衍东，何涛。％咀与肿瘤的关系研究进展［Ｊ］．西南军医，２００９，１１（３）：４９３－４９５．［２］徐静，陈孝平，向秋．原发性肝癌Ｔｗｉｓｔ基因表达的研究［Ｊ］．中［３］Ｋａ唱Ｙ，地邺Ｊ．ＥｐｉｔｈｄｉＩｄ—ｍ喇词ｌｙⅡｌａｌ华肿瘤防治杂志，２００７。１４（１３）：９９４－９９６．ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎｓ：ｔｗｉｓｔｉｎｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｎｄｍｃ‘∞Ｉａ日ｉＢ［Ｊ］．Ｃｅｌｌ，２００４，１（ｉｓ）：２７７－２７９．［４】关剑．陈孝平．王其，等．Ｔｗｉｓｔ在人肝癌细胞系与正常肝细胞系［５】ｍ妇Ｔ．Ｌｉｖｅｒ中的表达差异［Ｊ］．腹部外科，２００７，２０（２）：１１５・１１７．Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ脚，２００４，４４２（１０）：３５８－３６１．ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎｆｒｏｍｍｙｔｈｔｏＩｎ∞ｈａＩｌｉ∞［Ｊ】．Ｎａｔｕｒｅ［６］ＭｕｌｌｅｒＴ，ＢａｌｎＧ，ＷａｎｇＸ，ｄａ１．Ｒ刚“恤０ｆｅｐｉｔｈｅｌｉａｌｃｅｌｌｍｌ－乎面∞ａｎｄＵｔｌｍｏｌ－白ｍ蟑虹∞ｂ甲ｐ＿ｃ曲ｅｎｉｎ８ｉ乎ｌｌｌｉｎｇ［Ｊ］．ＥｘｐＣｅｌｌＲｅｓ。２００２。２８０（１）：１１９－１３３．［７】ＣａｌｖｉｓｉＤＦ。ｈｄＩｌＳ，ＦａｃｔｏｒＶＭ．吐丑Ｉ．Ａｃｔｌｖａｔｉａｎ《ｂｅｔａ－ｃａｔｅｎｉｎｐｎｗｉｄｅｓｐｒｏｌｉｆｅｌ＇ａｔｌｖｅａｎｄｉｎｖｔｍｉｖｅａｄｖａｎｔａｇｅｓｉｎｃ－ｍｙｅ／＇ｌＢＦ－ｅｌｐｈａｈｅｐａｔｏｃａｒｃｉｎｏ萨ｎ翻ｉ摹ｐｍｍｏｔｅｄｂｙｐｈｅｎｏｂａｍ＇ｂｉｍｌ［Ｊ］．０皿ｃｉｌ∞妙５ｉｓ，２００４。２５（６）：９０１－９０８．【８］刘磺鸣．徐静．肝癌细胞中Ｔｗｉｓｔ基因表达变化与ｗＮＴ信号传导通路的关系［Ｊ］．山东医药，２００９，４９（６）：１６－１７．（收藕日期：７．００９．Ｉｌｄ３）控，近期研究表明肿瘤细胞从原发性肿瘤病灶中分离，在此过程中细胞需要经历上皮一问质转变关系密切ｕ诱导细胞迁移过程中起着关键作用的转录因子。它是一种癌基因蛋白，能编码凋亡抑制蛋白，与肿瘤细胞的凋亡关系密切【２】。Ｋ锄ｇ等旧１通过对ＥＭＴ基因标记的检测，发现在ＥＭＴ参与肿瘤细胞作用。其他的研究也证实Ｔｗｉｓｔ在肿瘤的发生、发展及演进过程中发挥了重要作用，可能是一个新的增殖与分化等过程中起着重要作用，其异常激活或调节基因失调均可导致肿瘤发生。经典的Ｗｎｔ信号通路称为Ｗｎｔ／１３一ｃａｔｅｎｉｎ信号通路，该通路是一条在生物进化中极为保守的通路＂】，它的暂时激活在肝脏发育、出生后肝脏正常生长、肝细胞再生、肝小续激活与肝细胞癌的进展显著相关。Ｍｕｌｌｅｒ等№１证实Ｗｎｔ，／［３－ｃａｔｅｎｉｎ在上皮细胞迁移过程中具有关键作用，异常表达的Ｂ—ｃａｔｃｎｉｎ辅以表皮生长因子
