维普资讯 http://www.cqvip.com 动物医学进展．２００４，２５（６）：５５—５８ Ｐｒｏｇｒｅｓｓ ｉｎ Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ＰＣＲ技术在沙门氏菌快速检测中的应用 刘华伟 ，郭蔼光 ，马立农¨，邱 立。 （１．西北农林科技大学，陕西杨陵７１２１００；２．深圳职业技术学院，广东深圳５１８０５５） 中圈分类号：Ｓ８５２．６１２ 文献标识码：Ａ 文章组号：１００７—５０３８（２００４）０６—００５５－０４ 摘要：ＰＣＲ是一种体外核酸扩增技术，具有敏 猪霍乱沙门氏菌、肠炎沙门氏菌、鸭沙门氏菌、新港沙门 其中以鼠伤寒沙门氏菌、肠炎沙门氏菌及猪霍 感性强、特异性高、快速、简便等优点，在医学、生 氏菌等， 物学等领域中得到了广泛应用。文章系统地阐 乱沙门氏菌最为常见。传统的检测方法过程复杂，周期长，所需试剂繁多。 述了ＰＣＲ技术在沙门氏茵快速检测中的应用， ＰＣＲ技术以其敏感性强、特异性高、简便、快速等优点， 并对引物基因设计、ＰＣＲ扩增过程中的技术参 现已广泛应用于微生物检测，本文重点论述了ＰＣＲ技 数和常见疑难问题做了归纳总结。同时简要介 术在沙门氏菌检测中的应用，并对其研究进展做了简要 绍了ＰＣＲ技术的研究进展，展望了今后微生物 介绍。 检测的发展方向。 １ ＰＣＲ技术简介 关键词：ＰＣＲ；沙门氏茵；快速检测；引物设计； 聚合酶链式反应（ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ）简称 血清型 ＰＣＲ，是一种体外核酸扩增技术。ＰＣＲ技术最初是为 ｎａ和 沙门氏菌是一类广泛分布于自然界，对人类和动物 了降低化学合成基因的工作量，１９７１年由Ｋｈｏｒａｉｓ和Ｃｅｔｕｓ公司 具有极大危害的革兰氏阴性致病茵。目前全世界已分 他的同事提出。１９８５年由Ｋａｒｙ Ｍｕｌｌ离出２ ５２３个血清型［１］，我国已发现２１６个［２］。与人类 的同事首次开发成功，随后在医学、生物学等领域中得 疾病有关的血清型主要集中于Ａ～Ｅ群，包括：伤寒沙 到了广泛应用，Ｋａｒｙ Ｍｕｌｌｉｓ因此获得１９９３年诺贝尔化 门氏菌、甲、乙、丙型副伤寒沙门氏菌、鼠伤寒沙门氏菌、 学奖。收穰日期：２００４—０７—２１ 作者简介：刘华伟（１９７５一），男，陕西西安人，在读硕士研究生，主要从事生物化学与分子生物学研究．＊通讯作者 ［１７］ Ｓ＆ｗｅ￣ｈ Ｍ，Ｒｉｃｈｔｅｒ Ｍ Ｆ，Ｈｅｒｒｍａｎｎ Ｃ，ｅｔ ａＬ Ｕｎｅｘｐｅｃｔｅｄ ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ ｒｅｑｕｉｒｅｍｅｎｔｓ ｆｏｒ ＧＴＰａｓｅ ａｃｆｉｖｉｔｙ Ｏｆ ｔｈｅ ｅＨｅｒｏｎ—ｉｎ＿ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，１９９５。２０６（１）Ｉ ５４５ ［２２］Ｒｏｒｍｉ Ｔ，Ｍａｔｉｋａｉｎｅｎ Ａ，Ｌｅｈｔｏｎｅｎ Ａ，ｅｔ ａＬ Ｔｈｅ ｐｒｏ￣ｍａ｜．ｎｔｉｅｒ－ ｆｅｒｏｎ－ｓｔｉｍｕｌａｔｅｄ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｅｌｅｍｅｎｔｓ ａｒｅ ｅｓｓｅｎｔｉａｌ ｆｏｒ ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ ｒｅ－ ｄｕｃｅｄ ＭｘＡ ｐｒｏｔｅｉｎ［刀．Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ，１９９５，２７０（２２）Ｉ １３５１８． ［１８］Ｐａｖｌｏｖｉｃ Ｊ，Ｓｃｈｒｏｄｅｒ Ａ，Ｂｌａｎｋ Ａ，ｅｔ ａＬ Ｍｘ ｐｒｏｔｅｉｎｓＩ ＧＴＰａａｅ８ ｉｎｖｏｌｖｅｄｉｎｔｈｅｉｎｔｅｄｅｒｏｎ－ｎｄｕｃｅｄ ｉａｎｔｉｖｉｒｌａ ｓａｔｔｅ［Ｊ］．Ｃ ａＦｏｕｎｄ Ｓｙｍｐ，１９９３，１７６ Ｉ２３３—２４３． ｓｐｏｎｓｉｖｅｎｅｓｓ，ａ ｐｒｏｍｏｔｅｒ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｈｅｔ ｎｔａｉｖｉｒａｌ ＭｘＡ ｇｅｎｅ［刀． Ｊ Ｉｎｔｅｄｅｒｏｓ Ｃｙｔｏｋｉｎｅ Ｒｅｓ，１９９８，１８（９）Ｉ７７３－７８１． ［２３］Ｈａｌｍｉｎｅｎ Ｍ，Ｉｌｏｎｅｎ Ｊ，Ｊｕｌｋｕｎｅｎ Ｉ，ｅｔ ａＬ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ＭｘＡ ｐｒｏ－ ｔｅｉｎ ｉｎ ｂｌｏｏｄ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ ｄｉｓｃｒｉｍｉｎａｔｅｓ ｂｅｔｗｅｅｎ ｖｉｒａｌ ａｎｄ ｂａｃｔｅｒｉ－ ［１９］ ￣ｈｗｅｍｍｌｅ Ｍ，Ｗｄｎｉｎｇ Ｋ Ｃ，Ｒｉｃｈｔｅｒ Ｍ Ｆ，ｅｔ ａＬ Ｖｅｓｉｃｕｌａｒ ｓｔｏ— ｍａｔｉｔｉｓ ｖｉｒｕｓ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｉｎｈｉｂｉｔｅｄ ｂｙ ｐｕｒｉｆｉｄ ｅＭｘＡ ｐｒｏｔｅｉｎ［Ｊ］． Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，１９９５，２０６（１）Ｉ ５４５－５５４． ｌａ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎｓ ｉｎ ｆｅｂｒｉｌｅ ｃｈｉｌｄｒｅｎ［刀．Ｐｅｄｉａｔｒ Ｒｅｓ，１９９７，４１（５）Ｉ ６４７－６５０． ［２Ｏ］ Ｎａｇａｔａ Ｋ，Ｍｉｂａｙａｓｉ ｈＭ．Ｔｈｅ Ｍｘ ｐｒｏｔｅｉｎ ｔｈａｔ ｃｏｎｆｅｒｓ ｔｈｅ ｒｅｓｉｓｔ— ［２４］ Ｍｕｌｌｅｒ－ＤｏｂｌｉｓＤ，Ａｃｅｋｅｒｍ．－ｕＭ，ＭｅｔＨｅｒ Ｉｎｖｉｔｒｏａｎｄｉｎｖｉｖｏ ａｎｃｅ ｔｏ ｉｎｆｌｕｅｎｚａ ｉｖｅｓ［Ｊ］．Ｎｉｐｐｏｎ Ｒｉｎｓｈｏ，１９９７，５５（１０）Ｉ ２６５４— ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｍｘ ｇｅｎｅ ｐｒｏｄｕｃｔｓ ｉｎ ｂｏｖｉｎｅ ｃｅｌｌｓ ｆｏ１１ｏｗｉｎｇ ｓｔｉｍｕｌａ— ２６５９． ｉｔｏｎ ｗｉｔｈ ａｌｐｈａ／ｂｅｔａ ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ ａｎｄ ｖｉｒｕｓｓ［Ｊ］．ａ Ｄｉｅａｇｎ Ｌａｂ Ｉｍｍｕｎｏｌ，２００２，９（６）Ｉ １１９２．１１９９． ［ｚ１］ Ｓｃｈｗｅｍｍｌｅ Ｍ，ｗｅｉｎｉｎｇ Ｋ Ｃ，Ｒｉｃｈｔｅｒ Ｍ Ｆ，ｅｔ ａＬ Ｖｅｓｉｃｕｌａｒ ｓｔｏ． ｍａｔｉｔｉｓ ｉｌｖｒｕ８ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｉｎｈｉｉｔｈｅｄ ｂｙ ｐｕｒｉｆｉｅｄ ＭｘＡ ｐｒｏｔｅｉｎ［Ｊ］． Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｐｒｏｇｒｅｓｓ ｉｎ Ｍｘ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ＹＡＮ Ｒｕｏ－ｑｉａｎ ，ＷＵ Ｗｅｎ－ｘｕｅ２，ＸＩＡ Ｃｈｕｎ ，ＬＩ Ｘｉｎ－ｓｈｅｎｇ （１・Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ Ｃｏｌｌｅｇｅ＇ＣｈｉｎａＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｂｅｉｊｉｎｇ，１０００９４・ＣｈｉａＩｎ ２．Ｃｈｉｎａ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，ＢｅＯｉｎｇ，１０００９４，Ｃｈｉｎａ） Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｍｘ ｐｒｏｔｅｉｎｓ，ｗｈｉｃｈ ａｒｅ ｍｅｍｂｅｒｓ ｏｆ ａ ｆａｍｉｌｙ ｏｆ ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ ｐｒｏｔｅｉｎｓ。ｈａｖｅ ｂｅｅｎ ｆｏｕｎｄ ｉｎ ｈｕ— ｍａｎ，ｍａｍｍａｌｓ，ｆｉｓｈｅｓ ａｎｄ ｐｏｕｈｒｙ．Ｍｘ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｅｘｈｉｂｉｔ ｔｈｅ ＧＴＰａｓｅｓ ａｃｔｉｖｉｔｙ，ｗｉｔｈ ｆｌ ｔｒｉｐａｒｔｉｔｅ ＧＴＰ ｂｉｎｄｉｎｇ ｃｏｎｓｅｎｓｕｓ ｍｏｔｉｆ ｉｎ ｔｈｅ Ｎ—ｔｅｒｍｉｎａｌ ｒｅｇｉｏｎ ａｎｄ ｆｌ ｈｉｇｈｌｙ ｃｏｎｓｅｒｖｅｄ ｌｅｕｃｉｎｅ ｚｉｐｐｅｒ ｍｏｔｉｆ ｉｎ ｔｈｅ Ｃ－ｔｅｒｍｉｎａｌ ｒｅｇｉｏｎ． Ｔｈｅ ａｎｔｉｖｉｒａ１ ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｍｘ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｈａｓ ｂｅｅｎ ｓｕｃｃｅｓｓｆｕｌｌｙ ｆｏｕｎｄ ｉｎ ｈｕｍａｎ ａｎｄ ｍｏｕｓｅ，ｂｕｔ ｎｏｔ ｉｎ ｔｈｅ ｄｕｃｋ．Ａ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｉｏｎ ａｔ ｐｏｓｉｔｉｏｎ ６３１（Ｓｅｒ ｔｏ Ａｓｎ）ｗａｓ ｃｏｎｓｉｄｅｒｅｄ ｔｏ ｄｅｔｅｒｍｉｎｅ ｔｈｅ ａｎｔｉｖｉｒａ１ ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｏｒ ｎｅｇａｔｉｖｅ Ｍｘ ｇｅｎｅ ｉｎ ｃｈｉｃｋｅｎ．Ｔｈｅ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ ｐｒｏｓｐｅｃｔ ｏｆ Ｍｘ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｉｎ ｐｏｕｌｔｒｙ ｗｅｒｅ ａｌｓｏ ｄｉｓｃｕｓｓｅｄ ｉｎ ｔｈｅ ｒｅｖｉｅｗ． Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ￣ｐｏｕｌｔｒｙ；Ｍｘ ｐｒｏｔｅｉｎｓ；ａｎｔｉｖｉｒａ１ ｆｕｎｃｔｉｏｎ！ＧＴＰａｓｅｓ ａｃｔｉｖｉｔｙ 维普资讯 http://www.cqvip.com ５６ 动物医学进展２００４年第２５卷第６期（总第１３４期） ＰＣＲ基本原理是利用Ｔａｑ ＤＮＡ聚合酶（Ｔａｑ酶） 沙门氏菌。依赖ＤＮＡ模板的特性，利用ＰＣＲ仪模仿生物体内 （３）ｈｉｌＡ基因——编码侵袭基因正调节蛋白。ｈｉｌＡ ＤＮＡ的复制过程：在由ＤＮＡ模板、引物、ｄＮＴＰ、Ｔａｑ 是ｉｎｖ基因的正转录调节蛋白。Ｘｕａｎ Ｇｕｏ等ｎ叼证实 酶及其ｂｕｆｆｅｒ（含Ｍ ）、去离子水组成的反应混合物 针对ｈｉｌＡ基因设计引物，可特异性地检测沙门氏菌。 中，通过不断循环进行的变性一退火（复性）～延伸反 （４）ｆｉｍＡ基因——编码Ｉ型菌毛主要的亚单元。 应，由Ｔａｑ酶催化对一对寡核苷酸引物所限定的ＤＮＡ ｆｉｍＡ基因编码沙门氏菌Ｉ型菌毛主要的亚单元，介导 片断进行指数式扩增，经电泳、染色后，在紫外光下检测 与上皮细胞表面的特异受体相结合。Ｃｏｈｅｎ Ｈ Ｊ等ｎ妇 目的条带。 ２ ＰＣＲ技术在沙门氏菌检测中的应用 ２．１模板的制备 ２．１．１菌株的培养挑取检测样品菌落接种于营养肉 汤，必要时需接种于增菌液，３７℃摇床恒温培养１８ ｈ 后，进行ＤＮＡ模板的提取。 ２．１．２模板的制备 （１）裂解法（酶裂解法或碱裂解法）。利用溶菌液 Ｉ、Ⅱ或碱裂解液Ｉ、ＩＩ裂解沙门氏菌，结合有机溶剂抽 提，预冷的无水乙醇沉淀制备模板ＤＮＡ。虽然裂解法 比较费时，而且氯仿、异戊醇有一定的刺激性，酚具有很 强的毒性和腐蚀性［３２。但此方法蛋白质及其它杂质去 除彻底，而且获得的模板ＤＮＡ量较多，重复性与稳定 性好，因此是制备模板ＤＮＡ的经典方法。 （２）冻融法。一２Ｏ℃冷冻，３７℃溶解，如此反复几 次，迫使沙门氏菌细胞壁破裂，离心去杂，获取模板 ＤＮＡ。 （３）热裂解法。利用沸水破坏沙门氏菌细胞壁，并 使蛋白质和ＤＮＡ变性，离心去杂，获取模板ＤＮＡ。此 法简单、快速，适用于对沙门氏菌的快速检测，但提取的 模板ＤＮＡ量少，稳定性不如经典裂解法，而且并非对 所有细菌都实用，如加热能释放大量碳水化合物的细菌 不宜使用此方法 ］。 （４）试剂盒提取法。已有很多公司生产ＤＮＡ提取 试剂盒，只需遵照说明书操作即可。 ２．２ 引物设计 引物设计是利用ＰＣＲ检测沙门氏菌成功与否的关 键，用来设计ＰＣＲ引物的基因主要分３类，即属特异性 引物基因、血清群特异性引物基因与血清型特异性引物 基因。 ２．２．１属特异性引物基因 （１）ｈｕｔ基因——编码组氨酸转运操纵子。Ｃｏｈｅｎ Ｎ Ｄ等［４］根据沙门氏菌组氨酸转运操纵子基因，设计出 沙门氏菌属的特异性引物，章新生等嘲利用此引物检测 沙门氏菌取得了很好的结果，我们也证实对１７种Ａ～ Ｆ群典型沙门氏菌标准菌株和５种分离菌株均在５００ ｂｐ附近（４９６ ｂｐ）扩增出一条特异性条带，而大肠埃希 氏菌等６株非沙门氏菌标准菌株则均表现阴性。 （２）ｉｎｖ基因簇——编码吸附和侵袭上皮细胞表面 蛋白。ｉｎｖ基因簇，与沙门氏菌对肠道上皮细胞的侵袭 有关，包括ｉｎｖＡ、ｉｎｖＢ、ｉｎｖＣ、ｉｎｖＤ、ｉｎｖＥ等基因。Ｒａｈｎ Ｋ等 、Ｓｔｏｎｅ Ｇ Ｇ等 、卢强等 、王军等嘲均证实基 于ｉｎｖ基因簇设计的引物，具有属特异性，可用于鉴别 根据ｆｉｍＡ基因设计特异引物，检测出牛奶等食品中的 沙门氏菌。 （５）ｈｎｓ基因——编码与蛋白质结合的ＤＮＡ。ｈｎｓ 基因编码与蛋白质结合的ＤＮＡ，Ｊｏｎｅｓ Ｄ Ｄ等ｎ２］根据 该序列设计引物和探针，检测出牡蛎中污染的多种沙门 氏菌。 （６）ｓｐｖ基因——编码沙门氏菌毒性质粒相关的毒 力因子。ｓｐｖ基因编码与沙门氏菌毒性质粒相关的毒 力因子，与沙门氏菌的致病性有关。Ｍａｈｏｎ Ｊ等［”］根 据鼠伤寒沙门氏菌ｓｐｖＲ基因设计引物，特异性检测到 具有该毒力相关基因的沙门氏菌，而不含质粒和质粒无 该毒力相关基因的菌株则表现阴性。 （７）１６ Ｓ ｒＲＮＡ基因。李君文等ｎ 将常规ＰＣＲ与 半套式ＰＣＲ相结合，以沙门氏菌中最保守的１６ Ｓ ｒＲＮＡ基因为模板设计了一对沙门氏菌属的特异性引 物，经过优化反应条件，敏感性提高到３ ｃｆｕ。 ２．２．２血清群特异性引物基因 ｒｆｂ基因一一编码沙 门氏菌的菌体抗原（０抗原）。Ｏ抗原与沙门氏菌对宿 主细胞的粘附、侵袭和在寄主细胞间扩散有关，是沙门 氏菌主要的致病因子之一，刺激机体产生ＩｇＭ抗体。 目前沙门氏菌属分为Ａ～Ｚ、０５１～０６３、０６５～０６７等 ４６个血清群Ｌ１］，其中引起人类疾病的主要分布在Ａ～Ｅ 群。Ｌｕｋ Ｊ Ｍ Ｃ等ｎ５］根据ｒｆｂＪ、ｒｆｂＳ基因序列分别设 计引物，检测Ａ，Ｂ，Ｃ２，Ｄ群沙门氏菌。Ｇｉｌｌｅｓｐｉｅ Ｂ Ｅ 等［１ ］在此基础上结合Ｌｅｅ Ｓ Ｊ等［＂ 设计的ｃ１群ｒｉｂ基 因引物，同时检测到Ａ，Ｂ，Ｃ１，Ｃ２，Ｄ群沙门氏菌，不足 的是该Ｃ１引物和大肠杆菌有交叉反应，尚需进一步改 进。 ２．２．３血清型特异性引物基因沙门氏菌的Ｈ抗原 （鞭毛抗原）本质是蛋白质，是沙门氏菌重要的毒力因 子，决定其对寄主细胞表面的吸附、侵入和定居过程，刺 激机体产生ＩｇＧ抗体。沙门氏菌的Ｈ抗原分为Ｈ１相 和Ｈ２相，根据０抗原的不同分为４６个血清群，各血清 群再根据Ｈ抗原各相的不同而分成不同的血清型。 （１）ｆｌｉＣ基因——编码Ｈ１相抗原。Ｈ１相又称特 异相，特异性高，大多数沙门氏菌都具有Ｈ１相抗原。 Ｗｅｉ Ｌ Ｎ等口。］测出沙门氏菌几种不同的ｆｌｉＣ基因序 列，经序列对比分析后将沙门氏菌的ｆｌｉＣ基因分为８个 区，其中Ｉ和ⅥⅡ区的保守性达到１００ ，李景鹏等［１妇 利用自行设计的Ｉ区引物扩增沙门氏菌，证实该引物具 有属特异性。ＩＩ～ＶⅡ则表现出不同程度的特异性，其 中Ｈ１一ｄ １ Ｏ７２～１ ０８９区段序列为伤寒沙门氏菌所特 有。Ｓｏｎｇ Ｊ Ｈ等［２。。、王礼文等［２１］根据此区结合套式 维普资讯 http://www.cqvip.com 刘华伟等：ＰＣＲ技术在沙门氏菌快速检测中的应用 ５７ ＰＣＲ，特异性检测到伤寒沙门氏菌。 （５）ｄＮＴＰ浓度。ｄＮＴＰ浓度过高会促进错配碱基 （２）ｆｌｊＢ基因——编码Ｈ２相抗原。Ｈ２相也称非 的延伸，过低则ＰＣＲ产物量少甚至出现假阴性。常规 特异相，特异性低，伤寒沙门氏菌、都柏林沙门氏菌等部 ＰＣＲ反应体系中各ｄＮＴＰ的终浓度为２０～２５０ ｇｍｏｌ／ 分沙门氏菌没有Ｈ２相。Ｅｃｈｅｉｔａ Ｍ Ａ等［２ ］利用多重 Ｌ，也可直接选用ｄＮＴＰ ＭｉＸ［３，１９３。 ＰＣＲ检测出沙门氏菌不同的Ｈ２相抗原。 ２．３．２ ＰＣＲ参数 模板充分变性是ＰＣＲ扩增的前 （３）ｖｉａ基因——编码ｖｉ抗原。伤寒沙门氏菌、丙 提，但变性温度过高、时间过长，直接影响Ｔａｑ酶活性。 型副伤寒沙门氏菌等少数沙门氏菌具有表面抗原（Ｖｉ 可采取热启动ＰＣＲ或直接应用ＨＳ－Ｔａｑ酶。复性（退 抗原），功能与大肠杆菌的Ｋ抗原相似，与沙门氏菌的 火）温度和时间，也与ＰＣＲ成败密切相关，通常选低于 致病性有关。Ｖｉ抗原不稳定，易丢失，只可作为辅助检 引物Ｔｍ值３～５℃并结合降落ＰＣＲ或梯度ＰＣＲ试验 验。也可将沙门氏菌几种抗原结合起来，从而直接确定 沙门氏菌特定的血清型。Ｈｉｒｏｓｅ Ｋ等［２４］利用多重 ＰＣＲ选择性扩增ｒｆｂＥ、ｒｆｂＳ、ｖｉａＢ、ｆｌｉＣ基因，特异性检 测出伤寒沙门氏菌和甲型副伤寒沙门氏菌。Ｌｉｍ Ｙ Ｈ 等［２印利用多重ＰＣＲ同时扩增ｒｆｂＪ、ｆｌｉＣ、ｆＩｊＢ基因也特 异性检测到鼠伤寒沙门氏菌。 （４）１６ Ｓ～２３ Ｓ ｒＲＮＡ基因间序列。Ｌａｇａｔｏｌｌａ Ｃ 等［ 阳利用ＰＣＲ扩增１６ Ｓ～２３ Ｓ ｒＲＮＡ基因间序列 （ＲＮＡ指纹图谱），也区分出沙门氏菌不同的血清型。 （５）ＰＣＲ—ＲＦＬＰ图谱。Ｄａｕｇａ Ｃ等口＂、Ｈｏｎｇ Ｙ 等［２胡将ＰＣＲ扩增产物进行不同的性内切酶酶切， 利用性片断长度多态性（ＲＦＬＰ）也可区分沙门氏 菌不同的血清型。随着沙门氏菌基因组研究的不断深 入，用来设计ＰＣＲ引物的候选基因将会更多，具体应根 据检测目的的不同来筛选候选基因，设计ＰＣＲ引物。 ２．３ ＰＣＲ扩增 ２．３．１ ＰＣＲ体系 （１）ＤＮＡ模板。由于常规ＰＣＲ检测，对模板要求 不严格，因此使用简便、快速的热裂解法提取模板ＤＮＡ 即可。但是热裂解法并不能完全取代经典的碱裂解法， 而且并非所有细菌都适合用热裂解法来提取模板 ＤＮＡ［３．１９＂１。 （２）Ｔａｑ酶。Ｔａｑ酶的含量直接影响ＰＣＲ结果，若 酶量偏少ＰＣＲ产物相应减少，反之酶量过高则易增加 非特异性扩增产物。目前已开发出具有不同特性的聚 合酶体系，具体应根据实验要求而定。如Ｔａｋａｒａ公司 的系列Ｔａｑ酶：为了提高灵敏度可选Ｅｘ Ｔａｑ酶，为了 提高产物特异性可选ＥＸ Ｔａｑ ＨＳ酶等。通常对于５ｏ Ｌ常规ＰＣＲ反应体系Ｔａｑ酶用量为０．５～２．５ Ｕｔ３，１９３。 （３）Ｍｇｚ＋浓度。Ｍｇ２＋浓度会直接影响Ｔａｑ酶活 性、模板与ＰＣＲ产物的变性温度、产物的特异性及引物 二聚体形成。Ｍｇ２＋浓度过低，Ｔａｑ酶活力降低导致 ＰＣＲ产物量少，易造成假阴性；Ｍｇ２＋浓度过高易产生 非特异性扩增。如果模板中含有ＥＤＴＡ等螯合剂，应 适当增加Ｍｇ２＋浓度。常规ＰＣＲ反应体系中Ｍｇ２＋终 浓度范围为０．５～５．０ ｍｍｏｌ／ＬＥ３，１９３。 （４）引物浓度。引物浓度也会影响ＰＣＲ的结果，引 物浓度过低，ＰＣＲ产物量少甚至出现假阴性，引物浓度 过高，易产生引物二聚体和非特异性扩增，常规ＰＣＲ体 系引物终浓度为０．１～１．０ ｔｔｍｏｌ／ＬＥ ¨］。 进行摸索。另外循环次数过少，ＰＣＲ扩增条带较暗，循 环次数过多则易产生非特异性扩增，通常为２５～３５个 循环 。 ２。４ ＰＣＲ结果分析 ＰＣＲ扩增结果进行琼脂糖电泳分离，通常用 ０．５ ｔｔｇ／ｍＬ ＥＢ（溴化乙锭）染色。由于ＥＢ是强诱变 剂，因此制胶和观察结果时应戴上一次性手套，严防ＥＢ 交叉污染危害他人。ＳＹＢＲ染料是一种新型的极为敏 感的荧光染料，信号强，背景值低，核酸亲和力高， ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｉ主要用于溶液中双链ＤＮＡ的定量分 析，如实时荧光ＰＣＲ中双链ＤＮＡ的检测。ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ ＩＩ主要用于单链ＤＮＡ、ＲＮＡ的染色和溶液中 ＲＮＡ的定量分析。ＳＹＢＲ Ｇｏｌｄ用于ＤＮＡ和ＲＮＡ的 染色，可用于琼脂糖凝胶、聚丙烯酰胺凝胶的染色，也可 用于含有变性剂的凝胶染色，可检出琼脂糖凝胶中小于 ２Ｏ ｐｇ的双链ＤＮＡ，是ＥＢ极限的１／２５。染色的核酸可 直接转移到膜上进行Ｎｏｒｔｈｅｒｎ杂交或Ｓｏｕｔｈｅｒｎ杂 交 引。 ２．５ ＰＣＲ中的常见疑难问题 ２．５．１假阴性造成假阴性通常有以下原因：①Ｍｇ＇＋ 浓度过低或选用的１Ｏ×ｂｕｆｆｅｒ中不含Ｍｇ＇＋・；②变性 不完全；③复性条件不合适；④ＤＮＡ模板中含有蛋白质 （尤其是组蛋白）、Ｔａｑ酶抑制剂；⑤Ｔａｑ酶失活｝⑥引物 合成质量低、引物特异性差等。 ２．５．２假阳性造成假阳性通常有以下原因：①引物 特异性不高；②预变性温度过高、时间过长｝③样品污 染、扩增试剂污染、扩增产物交叉污染等。 ２．５．３ 出现非特异性扩增带 出现非特异性扩增带通 常有以下原因：①Ｍｇ２＋离子浓度过高；②退火温度过 低；③ＰＣＲ循环次数过多；④发生错配或产生引物二聚 体；⑤Ｔａｑ酶量过多或质量较差等。 ２．５．４出现片状拖带 出现片状拖带通常有以下原 因：①Ｔａｑ酶量过多或酶质量较差｝②Ｍｇ２＋浓度过高｝ ③退火温度过低；④循环次数过多｝⑤模板ＤＮＡ过量 等。 ３ ＰＣＲ技术研究进展及发展前景 近年来，ＰＣＲ及其相关技术得到了较大的发展，产 生了多种新的ＰＣＲ方法。如反相ＰＣＲ（Ｉｎｖｅｒｓｅ ＰＣＲ）、反转录（ＲＴ—ＰＣＲ）、长距离ＰＣＲ（Ｌｏｎｇ ＰＥＲ）、随 机扩增多态性ＤＮＡ技术（ＲＡＰＤ）、套式ＰＣＲ（Ｎｅｓｔｅｄ ＰＣＲ）、免疫ＰＣＲ（Ｉｍｍｕｎｏ ＰＣＲ）、不对称ＰＣＲ（Ａｓｙｍ－ 维普资讯 http://www.cqvip.com ５８ 动物医学进展２００４年第２５卷第６期（总第１３４期） ｆｏｒ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｓｐｐ［Ｊ］．Ａｐｐｆｉｄ ａｅｎｄ Ｅｎｖｉｖｏｍｅｎｎｔｌ ａｍｅｔｒｉｃ ＰＣＲ）、差异显示ＰＣＲ（ＤＤ－ＰＣＲ）、多重ＰＣＲ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，１９９６，６２（１２）：４３０３—４３０８． （Ｍｕｔｉｐｌｅｘ ＰＣＲ）、固相ＰＣＲ（Ｓｕｌｉｄｕｓ ＰＣＲ）、实时荧光 ［１２］ ＪｏｎｅｓＤＤ，ＬａｗＲ，Ｂｅｊ ＡＩＣＤｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｓｐｐ．ｉｎ ｃｏｎ－ ＰＣＲ（Ｒｅａｌ ｔｉｍｅ ＰＣＲ）等。另外将ＰＣＲ技术与微孔板 检测技术、ＥＬＩＳＡ技术、探针杂交技术等有机结合起 来，国内外都有不少报导。李君文等［１ 将常规ＰＣＲ与 半套式ＰＣＲ相结合，提高了检测的灵敏度。马立人 等 。 将ＰＣＲ与核酸探针技术相结合，已制成生物芯片 ｔａｍｉｎａｔｅｄ ｏｙｓｔｅｒｓ ｕｓｉｎｇ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｇｅｎｅ ｐｒｏｂｅｓ ［刀．Ｊ Ｆｏｏｄ Ｓｃｌ，１９９３，５８（６）：１１９１－１１９７． ［１３］ Ｍａｈｏｎ Ｊ，Ｌａｘ Ａ Ｊ．Ａ ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ ｍｅｔｈ— ｄ ｆｏｒ ｔｈｅ ｄｅｔｅｃｔｏｉｏｎ ｉｎ ａｖｉａｎ ｆａｅｃｅｓ ｏｆ Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａｓ ｃａｒｒｙ￣ｔｈｅ 检测沙门氏菌。 ｏｆ ａｂｅｑｕｏｓｅ ａｎｄ ｐａｒａｔｏｓｅ ｓｙｎｔｈａｓｅ ｇｅｎｅｓ（ｒｆｂ）ｂｙ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ 目前国内外已开发出多种具有不同特性的ＤＮＡ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ ｆｏｒ ｉｄｅｎｔｉｉｆａｔｃｉｏｎ ｏｆ Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｍａｊｏｒ ｓｅｒｏｖａｒｓ（Ａ， 聚合酶体系，也开发出了多种ＰＣＲ试剂盒，简化了 Ｂ，Ｃ２，ａｎｄ Ｄ）［刀．Ｊ Ｃｌｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ，１９９３，３１（８）：２１１８—２１２３． ｌｅｓｐｉｅ Ｂ Ｅ，Ｍａｔｈｅｗ Ａ Ｇ，Ｄｒａｕｇｈｏｎ Ｆ Ａ，ｅｔ ａ１．Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ＰＣＲ操作，提高了实验的重现性。随着机械手技术的 ｒ１６］ Ｇｉ不断发展，结合ＰＣＲ仪在质量和技术上的不断发展，实 现了ＰＣＲ全过程的自动化，如Ｂｅｃｋｍａｎ公司开发成功 ［１７］的ＣＥ 系列遗传分析系统。提高检测灵敏度、缩短 检测时间、简化检测程序，实现检测的自动化、快速化、 Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｅｎｔｅｒｉａ ｓｏｍａｔｉｃｃ ｇｒｏｕｐｓ Ｃ１ ａｎｄ Ｅ１ ｂｙ ＰＣＲ一曲工ｙｍｅ． ２３７０． ｓｐｖＲ ｇｅｎｅ［Ｊ］．Ｅｐｉｄｅｍｏｉｌ Ｉｎｆｅｃｔ。１９９３・１１１（３）：４５５‘４６４． ［１４］李君文，史秀全，晁福寰，等．肠道致病菌ＰＣＲ检测与鉴定研究 ［刀．中华微生物学和免疫学杂志，２０００，２０（３）：２６９・２７２． ｒ１５］Ｊｏｈｎ Ｍ Ｃ Ｌｕｋ，Ｕｒｉｒａｔ Ｋ，Ｐｅｔｅｒ Ｒ Ｒ，ｅｔ ａＬ Ｓｅｌｅｃｉｔｖｅ ａｍｐｌｉｆｉａｔｃｉｏｎ １ｉｎｋｅｄｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ ａｓｓａｙ．［刀．Ｊ ＦｏｏｄＰｒｏｔ，２００３。６６（１２）ｉ２３６７— Ｌｅｅ Ｓ Ｊ，ＲｏｍａｎａＬＫ，ＲｅｅｖｅｓＰＩ乙Ｓｅｑｕｅｎｃｅａｎｄ ｓｔｒｕｃｔｕｒｌａａｎａｌｙ－ ８ｉ８ ｏｆｔｈｅ ｒｉｂ（Ｏａｎｔｉｇｅｎ）ｇｅｎｅｄｕｓｔｅｒｆｒｏｍ ａ ｇｒｏｕｐＣ１ Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｅｎｔｅｒｉａ ｃｓｔｒｉａｎ［Ｊ］．Ｊ Ｇｅｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ，１９９２，１３８（９）：１８４３—１８５５． Ｌ Ｎ，Ｊｏｙｓ Ｔ Ｍ．Ｃｏｖａｌｅａｔ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｏｆ ｔｈｒｅｅ ｐｈａｓｅ－１ ｎａｇｅｌｌａｒ 特异化已成为包括沙门氏菌在内微生物检测的发展方 ［１８］Ｗｅｉｍａｍｅｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｓａｌｍｏｎｅ１１ａ［Ｊ］．Ｊ Ｍｏｉ Ｂｉｏｌ。１９８５，１８６：７９１－８０３． 向。 ［１９］ 李景鹏，李成梅，丁乃峥，等．应用聚合酶链反应快速检测沙门氏 菌［刀．东北农业大学学报，１９９７，２８（１）Ｉ７９－８３． 参考文献： Ｓｏｎｇ Ｊ Ｈ，Ｃｈｏ Ｈ，Ｐａｒｋ Ｍ Ｙ，ｅｔ １．Ｄａｅｔｃｔｅｉｏｎ ｏｆ Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ Ｔｙｐｈｉ ［１３ Ｐｏｐｏｆｆ Ｍ Ｙ，Ｂｏｃｋｅｍｕｈｌ Ｊ，Ｂｒｅｎｎｅｒ Ｆ Ｗ．Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ ２００１（ｎｏ．４４） ［２ｏ３ｔｏ ｔｈｅ Ｋａｕｆｆｍａｎｎ－Ｗｈｌｔｅ ｓｃｈｅｍｅ．［Ｊ］．Ｒｅｓ ＭＪｃｒｏｂｉｏｌ，２００１，１５２ （１Ｏ）：９０７－９０９． ｉｎ ｔｈｅ ｂｌｏｄ ｏｆ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ Ｔｙｐｈｏｉｄ Ｆｅｖｅｒ ｂｙ ｐｏｌｙｍｅｒ．ｅ ｃ．．ｈ．．．ａ．．—ｉ—ｎ ｒｅａｃｔｌｏｎ［Ｊ］．Ｊ Ｃｌｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ。１９９３，３１（６）：１４３９－１４４３． 杨学文，王仕忠．巢式聚合酶链反应检测伤寒沙门氏菌Ｈ ［２］ＣｏＨｅｒｅ Ｆ，Ｒａｃｈｅｌ Ｓ，Ｌｉｎｄａ Ｌ Ｇ，ｅｔ １ａ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｔｈｅ ｒｉｂ ［２１］王礼文，及Ｖｉ抗原基因的应用研究［Ｊ］．中国卫生检验杂志，１９９８，８（４）： Ｏ ａｎｔｉｇｅｎ ｇｅｎｅ ｄｕｓｔｅｒ ｏｆ Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｅｎｔｅｒｉｃａ ｓｅｒｏｇｒｏｕｐ Ｏ：６，１４ ａｎｄ ２０１－２０５． ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ ａ ｓｅｒｏｇｒｏｕｐ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ ＰＣＲ ａｓｓａｙ［Ｊ］．Ａｐｐｌｉｅｄ ａｎｄ ［２２］Ｅｃｈｄｔａ Ｍ Ａ，Ｕｓｅｒａ Ｍ Ｒａｐｉｄ ｉｄｅｎｔｉｆｉａｔｃｉｏｎ ｏｆ Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｓｐｐ． Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，２００３，６９（１Ｏ）：６０９９—６１０５． ［３］Ｊｏｓｅｐｈ ｅｍｂｒｏｏｋ，ＳＤａｖｉｄ Ｗ Ｒｕｓｓｅｌ１．分子克隆实验指南（第３版） ＰＣＲ ［刀．Ｒｅｓ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ，１９９８，１４９：７５７－７６１． ［Ｍ］．黄墙堂，等，译．北京：科学出版社，２００２． ａＭＡ，Ｈｅｒｒｅｒａ ｔＳ，Ｇａｒａｉｚａｒ Ｊ，ｅｔ ａＬＭｕｌｔｉｐｌｅｘＰＣＲ．ｂａｓｅｄｄｅ． ［４］Ｃｏｈｅｎ Ｎ Ｄ，Ｎｅｉｂｅｒｇｓ Ｈ Ｌ，ＭｃＧｒｕｄｅｒ Ｅ Ｄ，ｅｔ １ａ．Ｇｅｎｕｓ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ ［２３］Ｅｃｈｅｉｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａｅ ｕｓｉｎｇ ｔｈｅ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ（ＰＣＲ） ｔｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｉｄｅｎｔｉｆｉａｔｃｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｍｏｓｔ ｃｏｌｎｌｎｏｎ Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｓｅｃｏｎｄ－ ｐｈａｓｅ ２ ａｎｔｉｇｅｎｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｈ１ ａｎｔｉｇｅｎｉｃ ｃｏｍｐｌｅｘ ｕｓｉｎｇ。ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ ｐｈａｓｅ ｌｆａｇｅｌｌａｒ ｎｔａｉｇｅｎｓ［刀．Ｒｅｓ Ｍｉｃｒｉｏｂｉｏｌ，２００２，１５３：１０７—１１３． ［刀．Ｊ Ｖｅｔ Ｄｉａｇｎ Ｉｎｖｅｓｔ，１９９３，５（３）：３６８—３７１． ｒｏｓｅ Ｋ，Ｉｔｏｈ Ｋ Ｉ，Ｎａｋａｊｉｍａ Ｈ，ｅｔ ａ１．Ｓｄｅｃｔｉｖｅ ａｍｐｌｉｔｃｆａｔｉｏｎ ｏｆ ［５］章新生，藏富妍．应用ＰＣＲ技术检测沙门氏菌［Ｊ］．中国兽医学报， ［２４］Ｈｉ１９９９，１９（２）Ｉ １４７—１５１． ［６］ＲａｈｎＫ，ＤｅＯｒａｎｄｌｓ ＳＡ，ＣｌｒｋｅＲＣ，ａｅｔａ１．Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ａｎｉｎ— ｖＡ ｇｅｎｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｏｆ Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ Ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ ｂｙ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｔｙｖ（ｒｆｂＳ）。ｐｒｔ（ｒｆｂＳ）ｖｉａＢ。ａｎｄ ｆｌｉＣ ｇｅｎｅｓ ｂｙ ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ ＰｃＲ ｆｏｒ ｉ－ ｄｅｎｔｉｆｉａｔｉｏｎ ｏｆ Ｓａｌｍｏｎｅｌｃｌａ ｅｎｔｅｒｉａ ｓｅｒｏｖａｃｒｓ Ｔｙｐｈｉ ａｎｄ Ｐａｒａｔｙｐｈｉ Ａ［刀．Ｊ Ｃｌｉｉｎｃａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，２００２，４０（２）Ｉ６３３－６３６． ［２５］Ｌｉｍ Ｙ Ｈ，Ｈｉｒｏｓｅ Ｋ，Ｉｚｕｍｉｙａ Ｈ，ｅｔ ａＬ Ｍｕｌｉｔｐｌｅｘ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃ—ｈａ—ｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ ａｓ ａ ｓｐｅｄｆｉｃ ｍｅｔｈｏｄ ｏｆ ｄｅｔｃｔｅｉｏｎ ｏｆ Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ［Ｊ］．Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｐｒｏｂｅｓ，１９９２，６（４）：２７１—２７９． ｒｅａｃｔｉｏｎ ａｓｓａｙ ｆｏｒ ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｅｎｔｅｒｉａ ｃｓｅｒｏｖａｒ ［７］Ｓｔｏｎｅ Ｇ Ｇ，Ｏｂｅｒｓｔ Ｒ Ｄ，Ｈａｙｓ Ｍ Ｐ，ｅｔ ａ１．Ｄｅｔｅｃｉｔｏｎ ｏｆ Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ Ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ［Ｊ］．Ｊｐｎ Ｊ Ｉｎｆｅｃｔ Ｄｉｓ，２００３，５６：１５１－１５５． ｔｏｌｌａ Ｃ，Ｄｏｌｚａｎｉ Ｌ，Ｔｏｎｉｎｅ Ｅ，ｅｔ １ａ．ＰＣＲ ｉｒｂｏｔｙｐｉｎｇ ｆｏｒ ｃｈａｒａ￣ ｓｅｒｏｖａｒｓ ｆｒｏｍ ｃｌｉｎｉｃａｌ ｓａｍｐｌｅｓ ｂｙ ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ ｂｒｏｔｈ ｃｕｌｔｉｖａｔｉｏｎ－ＰＣＲ ［２６］Ｌａｇａｔｅｒｉｚｉｇ ｎＳａｌｍｏｎｅｌｌａ ｉｓｏｌａｔｅｓ ｏｆ ｃｌｉｆｆｅｒｅｎｔ ｓｅｒｏｔｙｐｅｓ［Ｊ］．Ｊ Ｃｌｉｎ ｉｃＭｒｏ－ ｐｒｏｃｅｄｕｒｅ［Ｊ］．Ｊ Ｃｌｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ，１９９４，３２（７）：１４７２—１４７９． ｂｉｏｌ，１９９６，３４（１０）：２４４０－２４４３． ［８］卢强，陈贵连，林万明．应用ＰＣＲ—ＥＣＬ技术检测食品中的沙门氏 ［２７］Ｄａｕｇａ Ｃ，ｇａｂｒｏｖｓｋａｉａ Ａ，Ｇｒｉｒｎｏｎｔ Ｐ Ａ Ｄ．Ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ ｆｒａｇｍｅｎｔ 菌［刀．中国公共卫生，１９９５，１１（４）：１８９． ｌｅｎｇｔｈ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｓｏｍｅ ｌｆａｇｅｌｌｍ ｇｅｎｅｓ ｏｆ Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ［９］王军，张为国，虞爱华，等．聚合酶链反应对沙门氏菌肠炎快速诊 ｅｎｔｅｒｉａ［Ｊｃ］．Ｊ Ｃｌｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ，１９９８，３６（１０）Ｉ２８３５－２８４３． 断的初步应用［Ｊ］．中国人畜共患病杂志，１９９９，１５（１）：４５—４６． ｇ Ｙ，Ｌｉｕ Ｔ Ｒ，Ｈｏｆａｃｒｅ Ｃ，ｅｔ １．Ａ ａｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ ｆｒａｇｍｅｎｔ ｌｅｎｇｔｈ ［１Ｏ］Ｏｕｏ Ｘｕａｎ，Ｃｈｅｎ Ｊｉｒ￣ｒｕ，Ｂｅｕｃｈａｔ Ｌ Ｒ，ｅｔ １ａ．ＰＣＲ Ｄｅｃｔｅｃｉｔｏｎ ｏｆ Ｓａｌ— ［２８］Ｈｏｎｍｏｎｅｌｌａ ｅｎｔｅｒｉｃａ ｓｅｒｏｔｙｐｅ Ｍｏｎｔｅｖｉｄｅｏ ｉｎ ａｎｄ ｏｎ ｒａｗ ｔｏｍａｔｏｅｓ ｕ— ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ ｂａｓｅｄ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ ａ８ ａｎ ｌｔｅｒｎａｔａｉｖｅ ｔｏ ｓｉｎｇ ｐｒｉｍｅｓ ｄｅｉｔｖｅｄ ｆｒｏｍ ｍｔＡＥＪ］．Ａｐｐｌ Ｅｎｖｉｒｏｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ，２０００， ６６（１２）：５２４８—５２５２． ｉｆｍＡ ｇｅｎｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｏｆ Ｓ４￣ｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ，ａ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｍｅｔｈｏｄ ｓｅｒｏｔｐｉｙｎｇ ｆｏｒ ｉｄｅｎｔｉｆｙｉｎｇ Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｓｅｒｏｔｐｅｓ［Ｊ］．Ａｖｉｙａｎ Ｄｉｓｅａ－ ｓｅｓ，２００３，４７（２）：３８７－３９５． ２００２． 马立人，蒋中华．生物芯片（第２舨）［Ｍ］．北京：化学工业出版社， ［１１］ Ｃｏｈｅｎ Ｈ Ｊ，Ｍｅｃｈａｎｄａ Ｓ Ｍ，Ｌｉｎ Ｗ，ｅｔ １ａ．ＰＣＲ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ［２９］Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ０ｆ ＰＣＲ ｉｎ ｔｈｅ Ｒａｐｉｄ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ＬＩＵ Ｈｕａ－ｗｅｉ １，２，ＧＵＯ Ａｉ－ｇｕａｎｇ ，ＭＡ Ｌｉ—ｎｏｎｇ￣，ＱＩＵ Ｌｉ （１．Ｎｏｒｔｈｗｅｓｔ Ｓｃｉ－Ｔｅｃｈ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ ａｎｄ Ｆｏｒｅｓｔｒｙ，Ｙａｎｇｌｉｎｇ，Ｓｈａａｎｘｉ，７１２１００，Ｃｈｉｎａ， ２．Ｓｈｅｎｚｈｅｎ Ｐｏｌｙｔｅｃｈｎｉｃ，Ｓｈｅｎｚｈｅｎ，Ｇｕａｎｇｄｏｎｇ，５１８０５５，Ｃｈｉａ） ｎＡｂｓｔｒａｃｔ：Ａｓ ａ ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ ｆｏｒ ａｍｐｌｉｆｙｉｎｇ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｗｉｔｈ ｈｉｇｈ ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ，ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ，ｓｗｉｆｔｎｅｓｓ ａｎｄ ｃｏｎ— ｖｅｎｉｅｎｃｅ，ＰＣＲ ｈａｓ ｂｅｅｎ ａｐｐｌｉｅｄ ｗｉｄｅｌｙ ｉｎ ｔｈｅ ａｓｐｅｃｔｓ ｏｆ ｍｅｄｉｃｉｎｅ ａｎｄ ｂｉｏｌｏｇｙ ｎｏｗａｄａｙｓ．Ｔｈｅ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ＰＣＲ ｉｎ ｔｈｅ ｒａｐｉｄ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｓａｌｍｏｎｒｅｌｌａ ｈａｓ ｂｅｅｎ ｅｘｐａｔｉａｔｅｄ ｉｎ ｄｅｔａｉｌ。ｔｈｅ ｇｅｎｅｓ，ｐａｒａｍｅｔｅｒｓ ａｎｄ ｑｕｅｓｔｉｏｎｓ ｏｆ ｔｈｅ ＰＣＲ ｆｏｒ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ａｌｓｏ ｈａｖｅ ｂｅｅｎ ｓｕｍｍａｒｉｚｅｄ ｉｎ ｔｈｉｓ ｐａｐｅｒ．Ａｔ ｔｈｅ ｓａｍｅ ｔｉｍｅ ｔｈｅ ｐｒｏｇｒｅｓｓ ｏｆ ＰＣＲ ａｎｄ ｔｈｅ ｐｒｏｓｐｅｃｔ ｏｆ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｍｉｃｒｏｂｅ ａｌｓｏ ｈａｖｅ ｂｅｅｎ ｉｎｔｒｏｄｕｃｅｄ ｉｎ ｂｒｉｅｆ． Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ：ＰＣＲ；Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ Ｉ ｒａｐｉｄ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ；ｄｅｓｉｇｎ ｐｒｉｍｅｒ；ｓｅｒｏｔｙｐｅ
