2016年秋生物化学实验学生实验讲义2015090901汇总

生物化学实验讲义

三峡大学化学与生命科学学院

生物化学实验须知

1．实验室规则

(1) 实验课必须提前5分钟到实验室,不迟到,不早退，应自觉遵守课堂纪律。 (2) 使用仪器、药品、试剂和各种物品必须注意节约, 应特别注意保持药品和试剂的纯(3) 实验台、试剂药品架必须保持整洁, 仪器药品摆放井然有序。实验完毕,需将药品、试剂排列整齐, 仪器洗净倒置放好, 实验台面抹拭干净, 经教师验收仪器后, 方可离开实验室。

(4) 使用和洗涤仪器时, 应小心谨慎, 防止损坏仪器。使用精密仪器时, 应严格遵守操作规程, 发现故障应立即报告教师, 不要自己动手检修。

(5) 在实验过程中要听从教师的指导, 严肃认真地按操作规程进行实验, 并简要、准确地将实验结果和数据记录在实验记录本上。课后写出实验报告, 由课代表收齐交给指导教师。

(6)仪器损坏时, 应如实向教师报告, 认真填写损坏仪器登记表, 然后补偿一定金额。 (7)每次实验课安排同学轮流值日, 值日生要负责当天实验的卫生和安全检查。

净, 严防混杂污染。

2．实验记录

实验课前应认真预习实验内容，将实验名称、实验原理、实验内容和步骤等简单扼要写在记录本上。实验记录本要标明页码，不能随意撕掉任何一页。

实验中使用的试剂纯度和终浓度以及使用的仪器类型等都要记录清楚。实验中观察到的现象、结果和得出的数据，应及时直接记在记录本上，绝对不可以随意记在单片纸上。原始记录必须准确、简练、清楚。

3．实验报告的书写

实验结束后,应及时整理和总结实验结果, 写出实验报告。 （1） 标题

标题应包括实验名称、实验时间、实验室名称、实验组号、实验者及同组者姓名、实验室条件。 （2） 实验目的 （3） 实验原理

应简述基本原理，不要完全照抄实验指导书。 （4）操作步骤

操作步骤 (或方法)可以采用流程图的方式或自行设计的表格来表达。

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（5） 实验结果

将实验中的现象、数据进行整理、分析，得出相应的结论。建议尽量使用图表法来表示实验结果，这样可以使实验结果清楚明了。 （6） 讨论

包括对实验结果及观察现象的小结、对实验中遇到的问题和思考题的探讨以及对实验的改进意见等。

4．生物化学实验课评分标准

 实验预习情况（10%）  实验操作情况（20%）  实验报告情况（20%）  实验考试成绩（50%）

实验室一些常用知识介绍

一．玻璃仪器的洗涤及一些常用的洗涤剂 1. 玻璃仪器的洗涤

（1）新购买的玻璃仪器, 首先用自来水洗去表面灰垢, 然后用洗衣粉刷洗, 自来水冲净后, 浸泡在 1%~2% 盐酸溶液中过夜以除去玻璃表面的碱性物质。最后, 用自来水冲洗干净, 并用蒸馏水冲洗 2 次。

（2）对于使用过的玻璃仪器, 应先用自来水冲洗, 再用毛刷蘸取洗衣粉刷洗。用自来水充分冲洗后再用蒸馏水冲洗 2 次。凡洗净的玻璃仪器壁上都不应带有水珠, 否则表示尚未洗净, 需重新洗涤。

（3）比较脏的仪器或不便刷洗的仪器, 使用前应用流水冲洗, 以除去粘附物, 如果仪器上有凡士林或其他油污, 应先用软纸擦除, 再用有机溶剂擦净，最后用自来水冲洗。待仪器晾干后, 放入铬酸洗液中浸泡过夜。取出后用自来水充分冲洗, 再用蒸馏水冲洗 2 次。 （4）普通玻璃仪器可在烘箱内烘干, 但定量的玻璃仪器如吸管、滴定管、量筒、容量瓶等不能加热, 应晾干备用。另外, 分光光度计中的比色杯的四壁是用特殊胶水粘合而成, 受热后会散架, 所以也不能烘干。

对疑有传染性的样品 ( 如肝炎病人的血清 ), 其容器应先消毒再清洗。盛过剧毒药物或放射性同位素物质的容器, 应先经过专门处理后再清洗。

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2. 一些常用的洗涤剂

a. 肥皂水或洗衣粉溶液

这是最常用的洗涤剂, 主要是利用其乳化作用以除去污垢, 一般玻璃仪器均可用其刷洗。 b. 铬酸洗液 ( 重铬酸钾一硫酸洗液 )

铬酸洗液广泛用于玻璃仪器的洗涤, 其清洁效力来自于它的强氧化性 (6 价铬) 和强酸性。铬酸洗液具有强腐蚀性, 使用时应注意安全。铬酸洗液可反复使用多次, 如洗液由红棕色变为绿色或过于稀释则不宜再用。

c. 5%~10% 乙二胺四乙酸二钠 (EDTA-Na2) 溶液: 加热煮沸, 利用 ED-TA 和金属离子的强配位效应, 可去除玻璃器皿内部钙镁盐类的白色沉淀和不易 溶解的重金属盐类。 d. 45% 的尿素洗液: 是蛋白质的良好溶剂, 适用于洗涤盛蛋白质制剂血样的容器。 e.乙醇一混合液

用于清洗一般方法难于洗净的有机物, 最适合于洗涤滴定管。

二．生物化学常用缓冲液 1. 磷酸盐缓冲液

磷酸盐是生物化学研究中使用最广泛的一种缓冲剂, 由于它们是二级解离, 有 2 个pka 值, 所以用它们配制的缓冲液, pH 范围最宽： NaH2P04：pKa1=2.12, pKa2=7.21 Na2HP04：pKa1=7.21, pKa2=12.32

配酸性缓冲液：用 NaH2P04, pH 值为 1~4 。 配中性缓冲液：用混合的两种磷酸盐, pH 值为 6~8。 配碱性缓冲液：用 Na2HP04, pH 值为 10~12 。

磷酸盐缓冲液的优点为： ① 容易配制成各种浓度的缓冲液; ② 适用的 pH 范围宽; ③ pH 受温度的影响小;

④ 缓冲液稀释后 pH 变化小, 如稀释 10 倍后 pH 的变化小于 0.1 。

其缺点为：

2+

2+

①易与常见的Ca、 Mg以及重金属离子缔合生成沉淀;

②会抑制某些生物化学过程, 如对某些酶的催化作用会产生某种程度的抑制作用。

2.Tris缓冲液( 三羟甲基氨基甲烷)

Tris 缓冲液在生物化学研究中使用的越来越多, 有超过磷酸盐缓冲液的趋势, 如在SDS- 聚丙烯酷胶凝胶电泳中己都使用 Tris 缓冲液, 而很少再用磷酸盐。 Tris 缓冲液的常用有效 pH 范围是在 \" 中性 \" 范围 , 例如：

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Tris-HCl 缓冲液pH 值为 7.5~8.5。 Tris- 磷酸盐缓冲液 pH 值为 5.0~9.0。 Tris-HCl 缓冲液的优点是：

① 因为 Tris 碱的碱性较强 , 所以可以只用这一种缓冲体系, 配制 pH 范围由酸性到碱性的大范围 pH 值的缓冲液; ② 对生物化学过程干扰很小, 不与钙离子及重金属离子发生沉淀。

其缺点是：①缓冲液的 pH 值受溶液浓度影响较大, 缓冲液稀释 10 倍 , pH 值的变化大于 0.1; ②温度效应大, 温度变化对缓冲液 pH 值的影响很大, 例如 4℃时缓冲液的 pH 值为 8.4, 则 37 ℃时的 pH 值为 7.4, 所以一定要在使用温度下进行配制, 室温下配制的 Tris-HCl 缓冲液不能用于 0~4℃; ③易吸收空气中的 C02, 所以配制的缓冲液要盖严密封;④此缓冲液对某些 pH 电极发生一定的干扰作用, 所以要使用与 Tris 溶液具有兼容性的电极。

3. 硼酸盐缓冲液

常用的有效 pH 范围是：pH 值为 8.5~10.0, 因而它是碱性范围内最常用的缓冲液, 其优点是配制方便, 只使用一种试剂, 缺点是能与很多代谢产物形成络合物, 尤其是能与糖类的短基反应生成稳定的复合物而使缓冲液受到干扰。

4. 氨基酸缓冲液

此缓冲液使用的范围宽, 可用于 pH 值为 2.0~11.0, 例如最常用的有： 甘氨酸 -HCl 缓冲液：pH 值为 2.0~5.0 。 甘氨酸 -NaOH 缓冲液：pH 值为 8.0~11.0 。

甘氨酸 -Tris 缓冲液：pH 值为 8.0~11.0( 此缓冲液用于广泛使用的 SDS 聚丙烯酰胺凝胶电泳的电极缓冲液 ) 。

组氨酸缓冲液：pH 值为 5.5~6.5 。

甘氨酰胺(glycine amide) 缓冲液：pH 值为 7.8~8.8 。 甘氨酰甘氨酸 (glycylglycine 〉缓冲液：pH 值为 8.0~9.0 。

此类缓冲体系的优点是：为细胞组分和各种提取液提供更接近的天然环境。

其缺点是：①与羧酸盐和磷酸盐缓冲体系相似, 也会干扰某些生物化学反应过程, 如代谢过程等; ②试剂的价格较高。

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实验一 生物大分子特征反应

一、 实验目的

1.了解糖类的某些颜色反应的原理 2.学习应用糖的颜色反应鉴别糖类的方法 3.如何鉴别还原糖和非还原糖

4.掌握蛋白质的变性、凝固及沉淀的基本原理和实验方法。 5.熟悉蛋白质的颜色反应

二、 实验原理 （一）糖的化学性质 1、莫氏（Molisch）试验

糖在浓无机酸（硫酸、盐酸）作用下，脱水生产糠醛或糠醛衍生物，后者能与a-萘酚生成紫红色缩合物。因为糠醛及糠醛衍生物对此反应均呈阳性，故此反应不是糖类的特异反应。 2、塞氏（Seliwanoff）试验

在浓酸作用下，酮糖脱水生成羟甲基糠醛，后者再与间苯二酚作用生成红色物质。此反应是酮糖的特异反应。醛糖在同样条件下呈色反应缓慢，只有在糖浓度较高或加热时间较长时，才呈微弱的阳性反应。在实验条件下蔗糖有可能水解而呈阳性反应。 3、杜氏（Tollen）试验

戊糖在浓酸溶液中脱水生产糠醛，后者再与间苯三酚结合生成深红色物质。本实验不是戊糖的特异反应，果糖、半乳糖和糖醛酸等都呈阳性反应，但戊糖反应最快。

4.费林试剂反应：还原糖是指含有自由基醛基或酮基、具有还原性的糖类，在加热条件下，直接滴定已标定过的费林氏液，费林氏液被还原析出氧化亚铜后，过量的还原糖立即将次甲基蓝还原，使蓝色褪色。

5.班乃德（Benedict）试剂为含Cu的碱性溶液，能使具有自由醛基或酮基的糖氧化，其本身则被还原成红色的Cu2O。 （二）蛋白质的化学性质 1、蛋白质的加热变性凝固

原理：蛋白质受热作用后，其分子内部结构发生变化，常使疏水基暴露于表面，因而失去原有的亲水性质，成为溶解度很低的变性蛋白。蛋白质在其等电点或等电点附近受热作用，则凝固而沉淀。若在稀酸稀碱中加热，由于变性蛋白质带正电荷或负电荷，故不易析出，此时如调节到等电点或等电点附近则沉淀析出，称为结絮。结絮的变性蛋白尚可溶于稀酸或稀碱中。结絮蛋白继续加热，则成较大的块状凝固蛋白，此时即不再溶于稀酸或稀碱中。 2、蛋白质的盐析

原理： 蛋白质属亲水胶体，向蛋白质溶液中加入一定浓度的各种中性盐类，既能除去蛋白质颗粒的电荷，又能除去其水化层，因此蛋白质容易从溶液中沉淀下来。由于大量盐类存

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2+

在而使蛋白质从溶液中沉淀出来的方法叫做盐析。不同蛋白质盐析时所需盐的浓度各异，因而可用不同浓度盐溶液分离不同的蛋白质，这种方法称为分段盐析。常用作盐析的中性盐有：(NH4)2S04、Na2S04、Na3P04、NaCl、MgS04等。几乎所有的蛋白质都可用饱和硫酸铵溶液盐析出来，而某些蛋白质(如球蛋白)在半饱和(NH4)2S04中析出。由盐析获得的蛋白质沉淀，经透析或水稀释降低盐浓度时，沉淀又能溶解，故蛋白质的盐析是可逆过程，常用于提纯各种蛋白质及酶类。

3.重金属盐沉淀蛋白质

原理：在等电点的碱侧，蛋白质呈负离子，能与重金属离子(如铜、银、汞等)结合成不溶性蛋白盐而沉淀。

4.生物碱试剂沉淀蛋白质

原理：蛋白质在等电点的酸侧，带有正电荷，能受生物碱试剂的作用而沉淀。常用作沉淀蛋白质的生物碱试剂有：苦味酸、三氯醋酸、钨酸、磷钨酸、鞣酸等。生物碱试剂对蛋白质的沉淀常较完全，故常用来制备无蛋白滤液。 （三）蛋白质的颜色反应 1、 双缩脲反应

将尿素加热到180℃，则两分子的尿素缩合而成一分子双缩脲，并放出一分子氨。双缩脲在碱性溶液中能与硫酸铜反应产生红紫色络合物，此反应称双缩脲反应。蛋白质分子中含有许多与双缩脲结构相似的肽键，因此也能发生双缩脲反应，形成红紫色络合物。通常可用此反应来定性鉴定蛋白质。

2、蛋白质的黄色反应

黄色反应是含有芳香族氨基酸特别是含酪氨酸和色氨酸的蛋白质所特有的呈色反应。蛋白质溶液遇后，先产生白色沉淀，加热则白色沉淀变成黄色，再加碱颜色加深呈橙黄色，这是因为将蛋白质分子中的苯环硝化，产生了黄色硝基苯衍生物。

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3、米伦氏反应

米伦试剂为汞、亚汞、和亚的混合物，蛋白质溶液加入米伦试剂后即产生白色沉淀，加热后沉淀变成红色。酚类化合物有此反应，酪氨酸含有酚基，故酪氨酸及含有酪氨酸的蛋白质都有此反应。

4、茚三酮反应

蛋白质与茚三酮共热，则产生蓝紫色的还原茚三酮、茚三酮和氨的缩合物。此反应为一切蛋白质及a-氨基酸所共有，含有氨基酸的其它物质亦呈此反应。

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三、 实验器材

1、试管及试管架 2、滴管 3、水浴锅 4、棉花、滤纸

四、 试剂

1、 莫氏（Molisch）试剂：5%a-萘酚的酒精溶液，称取a-萘酚5g，溶于95%酒精中，定容

至100ml,贮藏于棕色瓶中。此试剂需新鲜配制

2、 塞氏（Seliwanoff）试剂：称取0.05g间苯二酚溶于30ml浓盐酸中，再用蒸馏水稀释

至100ml,此试剂需新鲜配制。

3、 杜氏（Tollen）试剂：2%间苯三酚乙醇（95%）溶液3ml，缓慢加入浓盐酸15ml及蒸馏

水9ml即得，此试剂需新鲜配制。

4、 费林试剂： 甲液：称取15 g硫酸铜（CuSO4·5H2O），及0.05 g次甲基蓝，溶于水中

并稀释至1 L；乙液：称取50 g酒石酸钾钠与75 g氢氧化钠，溶于水中，再加入4 g亚铁，完全溶解后，用水稀释至500 ml，贮存于橡胶塞玻璃瓶内。

5、 Benedict试剂：称取85g柠檬酸钠和50g无水碳酸钠溶于400ml水中。另称取8.5g硫

酸铜溶于50ml热水中。将硫酸铜溶液缓慢加入柠檬酸钠-碳酸钠溶液中，边加边搅拌，如有沉淀可过滤。

6、 卵清蛋白液：取新鲜鸡蛋清30m1(约2个鸡蛋)，用蒸馏水配制，注意充分搅拌，最后

定容到300ml，用少量脱脂棉过滤。滤液放4℃备用，可保存一周。

7、 pH4.8 NaAc-HAc缓冲液：量取0.2mol/L的醋酸钠溶液590ml与0.2mol/L的醋酸溶液

410ml混合。

8、 饱和硫酸铵溶液1000m1：称取固体(NH4)2S04 850g加于1000m1蒸馏水中，在70～80℃

下搅拌促溶，室温中放置过夜，瓶底析出白色结晶，上清即为饱和硫酸铵溶液。 9、 0.1%茚三酮溶液：0.1g茚三酮溶于95%乙醇并稀释至100mL.

10、 其他试剂：1%葡萄糖溶液， 2%麦芽糖溶液，1%果糖溶液，1%蔗糖溶液，1%淀粉溶液，1%阿拉伯糖溶液，1%半乳糖溶液；1MNaOH溶液，0.1MHCl，Na2CO3；pH4.6 NaAc-HAc缓冲液； 0.1%硫酸铜溶液；饱和硫酸铵；三氯醋酸；卵清蛋白；甘氨酸；尿

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素； 0.1%茚三酮溶液。 四、实验操作 （一）糖的化学性质操作

1、莫氏（Molisch）试验：于4支试管中，分别加入1ml1%葡萄糖溶液、1%蔗糖溶液、1%淀粉溶液和少许纤维素（棉花或滤纸浸在1ml水中），然后各加入莫氏试剂2滴，摇匀，将试管倾斜，沿管壁慢慢加入浓硫酸1ml，直立试管，切勿振摇！硫酸沉于试管底部与糖液分成2层。观察液面交界处有无紫红色环出现。

2、塞氏（Seliwanoff）试验：于3支试管中，分别加入0.5ml1%葡萄糖溶液、1%蔗糖溶液、1%果糖溶液，各加入塞氏试剂2.5ml，摇匀，置沸水浴中，比较各管颜色变化及红色出现的先后次序。

3、杜氏（Tollen）试验：于3支试管中各加入杜氏试剂1ml，再于3支试管中分别加入1滴1%葡萄糖溶液、1%阿拉伯糖溶液、1%半乳糖溶液，混匀。将3支试管同时放入沸水浴中，观察颜色变化，并记录颜色变化的时间。

4、糖的还原性（费林试剂反应）：取5支试管，编号后，各加入费林试剂A和B各1ml，混匀，分别加入1ml的1%葡萄糖、 1%果糖、 1%蔗糖、 1%麦芽糖及1%淀粉，置沸水浴中加热数分钟，取出，冷却，观察各管的变化。

5、糖的还原性（与Benedict试剂反应）：取5支试管，各加1mlBenedict试剂，混合均匀后，分别加1ml的1%葡萄糖、 1%果糖、 1%蔗糖、 1%麦芽糖及1%淀粉溶液，摇动均匀，将各试管同时放入沸水浴中加热2~3分钟，然后取出放在试管架上冷却，注意观察试管中溶液颜色变化，是否有红色沉淀生成。 （二）蛋白质的化学性质操作 6、蛋白质的加热变性凝固

1．取试管3支分别加入(1)10％蛋白液10滴＋pH4.8缓冲溶液10滴；(2)10％蛋白液10滴＋H2O 8滴＋0.1 mol／L HCl 2滴

(3)10％蛋白液10滴＋H2O 8滴＋0.1 mol／L NaOH 2滴

2．将上述三管分别混匀，于酒精灯上加热煮沸，观察有何变化。 3．冷却后向(1)管加0.1 mol／L HCl 2滴观察有何变化?为什么?

4．向(2)管慢慢滴加0.05 mol／L Na2CO3边加边摇，直至呈现浓厚之絮状物为止。（无现象） 5．向(3)管慢慢加0.1 mol／L HAc直至出现浓厚之絮状物为止。

6．将(2)(3)两管分别于酒精灯上煮沸，注意有无凝固现象。冷却后再分别向(2)管滴加 0.1 mol／L HCl 2滴，(3)管滴加0.1 mol／L NaOH 2滴，是否仍能溶解?为什么? 7.蛋白质的盐析

（1）向试管内加入蛋白质溶液3ml及等量的饱和(NH4)2S04液混匀，即为半饱和硫酸铵，微微摇动试管、再静置3 min后，观察及解释所见现象。

（2）上述溶液4500rpm离心10min，分出上清液；在上清液中加(NH4)2S04粉末至不再溶解；

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观察溶液是否出现沉淀；再加水稀释，观察及解释所见现象。 8.重金属盐沉淀蛋白质

操作： 取试管1支，加蛋白液1ml，0.1 mol／L NaOH 2滴，混匀，滴加CuS04溶液，随即摇匀至出现沉淀为止。 9.生物碱试剂沉淀蛋白质

操作：取试管1支加入蛋白液1m1，滴加三氯醋酸6滴，观察并解释。 （三）蛋白质的颜色反应操作 10、双缩脲反应

1）取少许尿素放在干燥试管中，微火加热，尿素溶化形成双缩脲，释放出的氨可用红色石蕊试纸试之。至试管内有白色固体出现，停止加热，冷却。然后加10%氢氧化钠溶液1mL，混匀，观察是否出现紫玫瑰色。

2）另取一支试管，加蛋白质溶液10滴，再加10%氢氧化钠溶液10滴及1%硫酸铜溶液4滴，混匀，观察是否出现紫玫瑰色。 11、茚三酮反应

取1mL蛋白质溶液于试管中，加2滴茚三酮试剂，加热至沸即有蓝色出现。 思考题

1.用何种反应鉴别酮糖？ 2.a-萘酚实验的原理是什么？

3.费林试剂反应和班乃德反应实验糖的原理是什么？ 4.列表比较费林反应和班乃德反应（5个糖反应并解释原因） 5.解释蛋白质各反应的现象。（可以写在相关实验现象后面。）

实验二：DNS法（3，5-二硝基水杨酸法）测定还原糖和总糖

一、 实验目的

1、了解3，5-二硝基水杨酸法测定还原糖的基本实验。 2、区分还原糖和总糖测定过程的异同，

3、掌握分光光度法测定还原糖具体操作方法。

二、实验原理:

还原糖：还原糖就是具有还原性的糖，糖是羟基醛或多羟基酮组成的。因为醛基有还

原性，酮基不具还原性。麦芽糖是多羟基醛，蔗糖是多羟基酮。蔗糖水解时酮基变成了醛基。

总糖：指具有还原性的葡萄糖，果糖，戊糖，乳糖和在测定条件下能水解为还原性的单糖的蔗糖（水解后为1分子葡萄糖和1分子果糖），麦芽糖（水解后为2分子葡萄糖）以及可能部分水解的淀粉（水解后为2分子葡萄糖）。

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在NaOH和丙三醇存在下，3,5－二硝基水杨酸（DNS）与还原糖共热后被还原生成氨基化合物。在过量的NaOH碱性溶液中此化合物呈桔红色，在0nm波长处有最大吸收，在一定的浓度范围内，还原糖的量与光吸收值呈线性关系，利用比色法可测定样品中的含糖量。

三、试剂和器材

1、试剂：3,5－二硝基水杨酸（DNS）试剂，葡萄糖标准溶液（1mg/mL），6 mol/L HCl，6 N NaOH（40 %）。

2、材料：小麦面粉，PH试纸。

3、器材：751型分光光度计，水浴锅，电炉，比色管（25 mL），试管架，滤纸，漏斗。

四、操作方法

1、葡萄糖标准曲线制作 管号 蒸馏水mL 葡萄糖标准 液mL 0 2 0

1 1.9 0.1

2 1.8 0.2

3 1.7 0.3

4 1.6 0.4 5 1.5 0.5

6 1.4 0.6

7 1.3 0.7

8 1.2 0.8

9 1.1 0.9

葡萄糖含量OD0 mg 0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8 0.9 ① 按上表制备10个比色管；

② 向上述比色管中分别加入DNS试剂1.5 mL，充分混合；然后于沸水浴中加热5 min

进行显色；

③ 将各管放入盛有冷水的烧杯冷却，向各管加蒸馏水至各比色管25 mL刻度线，摇匀，

在0 nm波长处测定光吸收值；

④ 用0号比色管空白调零点，以葡萄糖含量（mg）为横坐标，光吸收值为纵坐标，绘

制标准曲线。

2、样品中还原糖的提取

① 准确称取2.0 g小麦面粉，放在100 mL烧杯或锥形瓶中，加入40 mL蒸馏水，混匀； ② 把烧杯放于一个50 ℃ 水浴中保温20 min，不时搅拌。

③ 拿出烧杯，将烧杯内含物转入一个100 mL的容量瓶中，加水定容至刻度。充分混

合，过滤，滤出液用于测定还原糖。

3、样品总糖的水解及提取

① 准确称取1.0g小麦面粉，置于锥形瓶中，溶于15mL 水中并加入6mol/L HCl 10mL

混合；

② 混合后，将锥形瓶放入沸水浴中煮沸30 min，拿出锥形瓶冷却；

③ 加入6N NaOH溶液中和内含物至PH6.8-7.0，将中和后的溶液转入一个100 mL容量

瓶定容到刻度，充分混合；

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④ 将容量瓶中得溶液过滤；

⑤ 取1mL滤出液加水到10mL，即得总糖样品。

4、样品中含糖量的测定 项目 0 样品溶液/ml 蒸馏水 3,5-二硝基水杨酸/ml 0 2.0 1.5 空白 1 1.0 1.0 1.5 还原糖 2 1.0 1.0 1.5 3 1.0 1.0 1.5 4 1.0 1.0 1.5 总糖 5 1.0 1.0 1.5 6 1.0 1.0 1.5 ① 取7支比色管编号，分别按上表加入试剂；

② 向上述比色管中分别加入DNS试剂1.5 mL，充分混合；然后于沸水浴中加热5 min

进行显色；

③ 将各管放入盛有冷水的烧杯冷却，向各管加蒸馏水至各比色管25 mL刻度线，摇匀； ④ 用1号管做空白对照，测定每管在0nm波长处的光吸收值，记录结果；

⑤ 根据还原糖和总糖的OD值，使用葡萄糖的标准工作曲线，计算还原糖和总糖的含

量，即：

计算：

还原糖或总糖%=C Х V ХN Х 100%/ m

N ──稀释倍数； C──还原糖或总糖提取液的浓度，mg/ml； V──还原糖或总糖提取液的总体积，ml；

m──样品重量，g；

1000──mg换算成g的系数。

注意事项：标准曲线制作与样品含糖量测定应同时进行，一起显色和比色

六、思考题

1、糖包括哪些化合物？

2、为保证实验中糖测定的准确性，应注意哪些操作事项？ 3、 比色时为什么要设计空白管？

4、 比色测定的基本原理是什么？操作步骤有哪些？

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实验三：血清蛋白质醋酸纤维薄膜电泳

[目的要求]

1. 了解血清蛋白质醋酸纤维膜电泳的基本原理和操作； 2. 掌握血清蛋白质的分类及其临床意义。 [临床意义]

血清中蛋白质的种类很多，它们大多在肝内合成，但生理功能各不相同。在正常情况下，由肝脏合成的白蛋白（又称清蛋白）、α-球蛋白、β-球蛋白，在血清中的浓度常在一定范围内波动，且A（白蛋白）/G(球蛋白)比值维持在 1.5～2.5 之间。但在某些病理条件下，血清蛋白质的含量常发生改变，如肾病综合症、慢性肾小球肾炎，血清蛋白含量降低，而α2-球蛋白、β-球蛋白则升高；肝硬化病人，血清白蛋白含量显著降低，其球蛋白总量则明显升高，γ-球蛋白可达正常的2～3倍，故A/G比值下降，甚至可出现白蛋白<球蛋白，使A/G比值<1，称为白球倒置。 [实验原理]

当一个带电粒子处于电场中时，可以朝与其所带电荷相反的电极移动，此现象叫电泳。 血清中含有多种蛋白质，其等电点各不相同，一般均低于pH 7.3。它们在pH 8.6的缓冲液中均离解带负电荷，电泳移向正极。

由于血清中各种蛋白质的分子所带的电荷及形状大小各不相同，因此，在电场中泳动的速度也不同，故可用电泳法将其分离。醋酸纤维薄膜电泳系以醋酸纤维薄膜为支持体，分离血清蛋白，分离后的蛋白质用氨基黑10B染色，通常可得到白蛋白和α1、α2 、β及γ球蛋白的电泳区带。区带颜色深浅与蛋白质含量成正比，故可通过比色计算出血清中白蛋白及球蛋白的相对含量。

几种血清蛋白的等电点，平均分子量表。 清蛋白 α1 电 点 4.88 5.06 分子量（万） 其电泳图谱如下

6.9 20 球 蛋 白 α2 5.06 30 β 5.06 9-15 6.85-7.3 15.6-30 γ

清蛋白 α1 α2 β γ 点样 [标本]

人体血清

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[器材]

1． 试管及试管架； 2． 刻度吸管或移液器； 3． 微量加样器（或1×5㎝ 胶片）； 4．培养皿； 5． 染色缸、洗脱缸； 6． 剪刀、镊子； 7． 滤纸； 8． 醋酸纤维素薄膜； 9． 电泳仪； 10. 721 分光光度计。 [试剂]

1. 巴比妥缓冲液(pH 8.6）： 称取巴比妥钠 15.458g和巴比妥 2.768 g，溶于 1000 ml蒸馏水中。

2. 氨基黑10B 染色液：取氨基黑10B 0.5g，加冰醋酸10ml 及甲醇50ml ,混匀，用蒸馏水稀释至100ml。

3. 洗脱液： 取95 % 乙醇 45ml，加冰醋酸 5ml，混匀，用蒸馏水稀释至 100ml。 4. 0.4mol/L NaoH 溶液。 [操作步骤]

1.检查电泳仪：

检查电源是否连好，电泳仪与电泳槽的电极连接是否正确，注意正负极不要接错。 2.点样：

洗净手，从巴比妥缓冲液中取2.5×8㎝ 醋酸纤维薄膜（提前一小时浸入，已编好号）一条，夹于滤纸中，轻轻吸去多余的缓冲液。将薄膜毛面向上，用微量加样器或胶片蘸取适量血清（约2～3微升，过多会影响分离），垂直均匀地点在距膜端1.5㎝ 划线处，待血清全部渗入膜内后，将加样器或胶片拿开。

3．电泳：

将点好样的薄膜毛面向下(以防水份蒸发干燥)，置电泳槽滤纸联桥上(薄膜应放正，否则电泳图谱不整齐)，点样端为阴极端，平衡5分钟。接通电源，调节电压10～15v／cm长，电流0.4～0.6mA／cm宽，通电60分钟。

4．染色：

关闭电源：取出薄膜，浸入氨基黑10B染色液中10分钟。 5．洗脱：

在三个洗脱缸中，依次浸泡，每次约10分钟，直到背景无色，区带清晰为止，取出晾干。然后根据电泳标准图辨认各蛋白质区带。

6．测定：

将各区带剪下，置于相应标记的大试管中，同时在该薄膜上的空白处(应无任何污染)，剪下一条与α1-球蛋白面积形状相近的区带，置于一大试管中，作为空白对照。然后每管加0.4mol／L NaOH 4ml，不断振摇30分钟，使染色的蛋白浸出，用620nm波长进行比色，以空白调零点，测各管吸光度。 [计算]

各蛋白质区带洗脱液的吸光度

×100 =各蛋白质占血清蛋白总量的百分率(%)

各蛋白质区带洗脱液吸光度总和

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[正常值]

白蛋白： 67～73％ α1-球蛋白： 3～4％； α2-球蛋白： 5～9％； β-球蛋白： 6～9％； γ-球蛋白： 11～14％； 附：光密度计法定量：

将干燥的蛋白质醋酸纤维素薄膜电泳图谱放入自动扫描光密度仪(或色谱扫描仪)内，通过反射(用未透明薄膜)或透射(用已透明的薄膜)方式，在记录器上自动绘出蛋白质各组分曲线图，横坐标为膜的长度，纵坐标为光密度，每一个峰代表一种蛋白质组分。然后用求积仪测量出各峰的面积，计算每个峰的面积与它们的总面积的百分比就代表血清中各种蛋白质组分的百分含量。在使用具有电子计算机附件的自动扫描光密度仪时，可以从数字显示部分或打字带上直接获得每条区带蛋白质百分含量。 [思考题]

1．血清蛋白质的电泳分析有何临床意义?

2．一蛋白质等电点为pH 4.88，而另一蛋白质等电点为pH 9.4，它们在pH 8.6的缓冲液中应带什么电荷? 在电场中的电泳方向如何?

实验四：氨基酸的分离鉴定—纸层析法

一、实验目的

通过对氨基酸的分离，学习运用纸层析法分离混合物的基本原理，掌握纸层析的操作方法。

二、实验原理

纸层析（Paper Chromatography，简称PC），是以滤纸作为惰性支持物的分配层析，滤纸纤维上有亲水性的羟基，通过吸附一层水作为固定相，通常把有机溶剂作为流动相。有机溶剂自上而下流动称为下行层析，自下而上流动称为上行层析。流动相流经支持物时，与固定相之间连续抽提，使物质在两相间不断分配而得到分离。物质被分离后在纸层析图谱上的位置用Rf值（比移值）来表示：

Rf值 = 原点到层析点中心的距离/ 原点到溶剂前沿的距离

在一定条件下某种物质的Rf值是常数，其大小受物质的结构、性质、溶剂系统物质组成与比例、pH值、选用滤纸质地和温度等多种因素影响。此外，样品中的盐分、其他杂质以及点样过多均会影响的有效分离。无色物质的纸层析图谱可用光谱法（紫外光照射）或显色法鉴定，氨基酸纸层析图谱常用茚三酮或吲哚醌作为显色剂，本实验采用茚三酮作为显色剂。

三、仪器与试剂 （一）实验器材

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（1）层析缸 （2）毛细管 （3）喷雾器 （4）培养皿 （5）电吹风机

（6）层析滤纸（新华一号） （7）针线、直尺 （二）实验试剂

（1）扩展剂：4份水饱和的正丁醇和1份冰乙酸的混合物。将20毫升正丁醇与5毫升冰乙酸放入分液漏斗中与15毫升水混合，充分振荡，静置后分层，放出下层水层，取漏斗内的扩展剂约5毫升置于小烧杯中做平衡溶剂，其余的倒入培养皿中备用。

（2）氨基酸溶液：5mg/mL的赖氨酸、甘氨酸、脯氨酸、谷氨酸、丙氨酸、亮氨酸溶液以及它们的混合液。

（3）显色剂：0.5%水合茚三酮正丁醇溶液。

四、操作步聚

1.将盛有平衡溶剂的小烧杯置于密闭的层析缸中，取长22厘米，宽14厘米的层析滤纸一张，在滤纸的一端距边缘2-3厘米处用铅笔划一条直线，在此直线上每间隔2厘米作一记号，等待点样。

2.点样：用毛细管将各氨基酸样液分别点在7个位置上，注意一定要每个点用一个毛细管，避免混用污染。样点干燥后再点2-3次，每点在滤纸上的扩散直径范围在3毫米内为最佳。

3.扩展：用针线将滤纸缝成圆筒状，注意纸的两边不能接触，留一定缝隙。将盛有约20毫升扩展剂的培养皿迅速置于密闭的层析缸中，并将滤纸垂直立于培养皿中，点样的一端在下，扩展剂的液面需低于点样线1厘米，待溶剂上升至距离滤纸上端2厘米左右时取出滤纸，用铅笔在溶剂前沿划一边界线，自然干燥或用电吹风机吹干溶剂。

4.显色：用喷雾器均匀喷上0.5%茚三酮正丁醇溶液，然后置100℃烘箱烘烤5分钟或用电热风吹干即可显出各层析斑点。 5.计算各种氨基酸的Rf值。

五、思考题

为什么不同的氨基酸有不同的Rf值，影响本实验Rf值精确性的因素有哪些？

实验五：油脂碘价的测定（韦氏法）

一、实验原理（维伊斯试剂Wijs reagent）（维伊斯试剂有100%～150%的过量）（烯基处于非共轭状

态时，碘值才有真实性）

油脂碘价（IV）：100g油脂所能加成碘的克数。

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根据碘价的定义，化学反应在碘与双键之间进行，将氯化碘溶于冰醋酸中就得到韦氏碘液，过量的氯化碘的冰醋酸可与油脂中的不饱和脂肪酸发生加成反应，而生成饱和的卤素衍生物。反应后多余的氯化碘以碘化钾（KI）还原，析出的碘用硫代硫酸钠标准溶液滴定。

根据硫代硫酸钠的用量并与空白试验，即可求出碘的实际加成量。 二、仪器和试剂

1．仪器

碘量瓶 250或500ml、滴定管50ml、大肚吸管 25ml、容量瓶1000ml、分液漏斗、洗气瓶、烧杯、 玻棒、分析天平（感量0.0001g） 2．试剂

0.1mol/L硫代硫酸钠标准溶液、15%碘化钾、0.5%淀粉指示剂、四氯化碳或三氯甲烷、盐酸、硫酸、碘、高锰酸钾、冰醋酸 、氯化碘、三氯化碘

韦氏碘液其配制方法有三种：

1）．取25克氯化碘溶于1500ml冰醋酸中。

2）．称取纯碘13克溶于1000ml冰醋酸中，从中量出150ml作调节韦氏碘液用，其余碘液通入经过洗涤和干燥的氯气，使之与碘作用生成氯化碘。通入的氯气，使溶液由深褐色变到透明的橙红色为止。氯化过量时，则用碘液调节，或将氯气通至用硫代硫酸钠溶液标定时，其用量比未通入氯气前大一倍为止。标定方法：分别量取碘液和韦氏液各20ml，各加入20ml15%碘化钾溶液和水100ml，分别用0.1mol/L硫代硫酸钠溶液进行滴定。

为使韦氏碘液更加稳定，可在水浴锅上加热20分钟，冷却后注入棕色瓶，置暗处备用。

3）．取三氯化碘7.9g和纯碘8.7g，分别溶于冰醋酸中，合并两液，再用冰醋酸稀释至1000ml储于棕色瓶中备用。 三、油样用量

表1 碘价数值与试样用量

油脂碘价 20以下 20-40 40-60 60-80 80-100 100-120 120-140 160-180 180-200 四、实验步骤

1. 按表1的数量称取经干燥过滤的油样（准确至0.0002g）注入干洁的碘量瓶中。 2. 往碘量瓶中加入20ml氯仿或四氯化碳溶解油样后。加入25ml韦氏碘液，立即加塞（塞和瓶口均涂以碘化钾溶液，以防碘挥发），摇匀后，将瓶子放于黑暗处。

3. 30分钟后（碘值在130以上时需放置60分钟）立即加入15%碘化钾溶液20ml和水100ml，不断摇动，用0.1mol/L硫代硫酸钠滴定至溶液呈浅黄色时，加入1ml淀粉指示剂，

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油样用量范围（g） 1.2000-1.2200 0.7000-0.7200 0.4700-0.4900 0.3500-0.3700 0.2800-0.3000 0.2300-0.2500 0.1900-0.2100 0.1500-0.1700 0.1400-0.1600 继续滴定，直至蓝色消失。

4. 相同条件下，不加油样做两个空白试验，取其平均值作计算用。 五、结果计算

油脂碘值按下列公式计算

碘价（gI/100g油）=（V2—V1）×C×0.1269/W×100

式中 : V1-油样用去硫代硫酸钠溶液体积ml V2-空白试验用去硫代硫酸钠溶液体积ml C-硫代硫酸钠溶液的浓度(mol/L) W-油样质量

0.1269- 1/2碘的毫摩尔质量,g/mmol

双试验结果允许误差，碘值在100以上者不超过1；碘值在100以下者不超过0.6求其平均值即为测定结果。测定结果取小数点后第一位。 六、注意事项

1．配制韦氏碘液的冰醋酸质量必需符合要求，且不能含有还原性物质。鉴定是否含有还原性物质的方法：取冰醋酸2ml，加入10ml蒸馏水稀释，加入1mol/L高锰酸钾0.1ml，所呈现的颜色应在2小时内保持不变。如果红色退去，说明有还原性物质存在。可用下法精制：取冰醋酸800ml放入圆底烧瓶内，加入8-10g高锰酸钾，接上回流冷凝器，加热回流约1小时后，移入蒸馏瓶中进行蒸馏，收集118-119℃间的馏出物。

2．氯气是以盐酸加入高锰酸钾中制得的。

制氯时，浓盐酸要缓缓加入，如果反应太慢，可以微微加热。所产生的氯气应通过水洗及浓硫酸干燥，方可通入碘液内。通氯气应在通风橱内进行，防止中毒。

3．韦氏碘液和硫代硫酸钠溶液稳定性较差，为使实验结果精确、可靠，必需做空白试验。另外，实验前需用重铬酸钾重新标定硫代硫酸钠溶液。

4．韦氏碘液由大肚吸管中流下的时间，各次试验应取得一致。碘液与油样接触的时间，应注意维持恒定，否则易产生误差。

实验六：垂直板聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白质

一、实验目的

学习SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法(SDS—PAGE)测定蛋白质的分子量的原理和基本操作技术。

二、实验原理

蛋白质是两性电解质，在一定的pH条件下解离而带电荷。当溶液的pH大于蛋白

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质的等电点(pI)时，蛋白质本身带负电，在电场中将向正极移动；当溶液的pH小于蛋白质的等电点时，蛋白质带正电，在电场中将向负极移动；蛋白质在特定电场中移动的速度取决于其本身所带的净电荷的多少、蛋白质颗粒的大小和分子形状、电场强度等。

聚丙烯酰胺凝胶是由一定量的丙烯酰胺和双丙烯酰胺聚合而成的三维网状孔结构。本实验采用不连续凝胶系统，调整双丙烯酰胺用量的多少，可制成不同孔径的两层凝胶；这样，当含有不同分子量的蛋白质溶液通过这两层凝胶时，受阻滞的程度不同而表现出不同的迁移率。由于上层胶的孔径较大，不同大小的蛋白质分子在通过大孔胶时，受到的阻滞基本相同，因此以相同的速率移动；当进入小孔胶时，分子量大的蛋白质移动速度减慢，因而在两层凝胶的界面处，样品被压缩成很窄的区带。这就是常说的浓缩效应和分子筛效应。同时，在制备上层胶(浓缩胶)和下层胶(分离胶)时，采用两种缓冲体系；上层胶pH=6.7—6.8，下层胶pH＝8.9；Tris—HCI缓冲液中的Tris用于维持溶液的电中性及pH，是缓冲配对离子；CI是前导离子。在pH6.8时，缓冲液中的Gly为尾随离子，而在pH＝8.9时，Gly的解离度增加；这样浓缩胶和分离胶之间pH的不连续性，控制了慢离子的解离度，进而达到控制其有效迁移率之目的。不同蛋白质具有不同的等电点，在进入分离胶后，各种蛋白质由于所带的静电荷不同，而有不同的迁移率。由于在聚丙烯酰胺凝胶电泳中存在的浓缩效应，分子筛效应及电荷效应，使不同的蛋白质在同一电场中达到有效的分离。

SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法则在聚丙烯酰胺凝胶中加入了一定浓度的十二烷基硫酸钠(SDS)，由于SDS带有大量的负电荷，且这种阴离子表面活性剂能使蛋白质变性，特别是在强还原剂如巯基乙醇存在下，蛋白质分子内的二硫键被还原，肽链完全伸展，使蛋白质分子与SDS充分结合，形成带负电性的蛋白质—SDS复合物；此时，蛋白质分子上所带的负电荷量远远超过蛋白质分子原有的电荷量，掩盖了不同蛋白质间所带电荷上的差异。蛋白质分子量愈小，在电场中移动得愈快；反之，愈慢。蛋白质的分子量与电泳迁移率之间的关系是：

Mr=K(10

logK——截距； b——斜率；

Rm ——相对迁移率。

实验证明，蛋白质分子量在15,000—200,000的范围内，电泳迁移率与分子量的对数之间呈线性关系。蛋白质的相对迁移率Rm＝蛋白质样品的迁移距离／染料(溴酚蓝)迁移距离。这样，在同一电场中进行电泳，把标准蛋白质的相对迁移率与相应的蛋白质分子量对数作图，由未知蛋白的相对迁移率可从标准曲线上求出它的分子量。

SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)法测定蛋白质的分子量具有简便、快速、重复性好的优点，是目前一般实验室常用的测定蛋白质分子量的方法。

三、试剂及主要器材 1．主要试剂

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-b·m

--

) logMr=LogK—b·Rm，

式中 Mr ——蛋白质的分子量；

1)标准蛋白混合液

内含：磷酸化酶(Mw 94,000)，牛血清蛋白(Mw 67,000)，肌动蛋白(Mw 43,000)，磷酸酐酶(Mw 30,000)和溶菌酶(Mw 14,000)

2)30％凝胶贮备液：Acr 30g，Bis 0.8g,加蒸馏水至100mL

3)分离胶缓冲液(1.5mol／L): Tris 18.15g,加水溶解,6mol/L HCl调pH8.9,定容100mL

4)浓缩胶缓冲液(0.5mol／L): Tris 6g,加水溶解，6mol/L HCl调pH6.8，并定容到100mL

5)电极缓冲液(pH8.3)：SDS lg，Tris 6g，Gly 28.8g，加水溶解并定容到1000mL。用时稀释五倍。 6)10％SDS

7)10％过硫酸铵(新鲜配制) 8)1％TEMED

9)上样缓冲液：0.5mol／L Tris-HCl pH6.8 1.25mL，50％甘油4mL，10％SDS 2mL，巯基乙醇0.4mL，0.1％溴酚蓝0.4mL，加蒸馏水定溶至10mL。

10)0.25％考马斯亮蓝R-250染色液：考马斯亮蓝R-250 1.25g，50％甲醇4mL，冰乙酸46mL。

11)脱色液：冰乙酸 35mL，蒸馏水465 mL。 12)未知分子量的蛋白质样品(1mg／mL ) 2．实验器材 1) 2) 3) 4) 5)

四、实验操作 1． 装板

将密封用硅胶框放在平玻璃上，然后将凹型玻璃与平玻璃重叠，将两块玻璃立起来使底端接触桌面，用手将两块玻璃夹住放入电泳槽内，然后插入斜插板到适中程度, 即可灌胶。 2． 凝胶的聚合

分离胶和浓缩胶的制备：按下表中溶液的顺序及比例，配置10％的分离胶和4.8％的浓缩胶。

试剂名称 Acr/Bis 30% 分离胶缓冲液（pH8.9） 浓缩胶缓冲液（pH6.8） 10%SDS 10%过硫酸铵 10%的分离胶/mL 5 3.75 0 0.15 0.1 4.8%的浓缩胶/mL 1.6 0 1.25 0.1 0.1 21

DYCZ-24D垂直板电泳槽(北京市六一仪器厂) 电泳仪

长滴管及微量加样器

烧杯(250mL、500m1)、量筒(500mL、 250m1)、培养皿(15cml5cm) 注射器等

水 TEMED 5 1 4.95 1 按上表各液加入混匀后配制成分离胶后，将凝胶液沿凝胶腔的长玻璃板的内面缓缓用滴管滴入，小心不要产生气泡。将胶液加到距短玻璃板上沿2cm处为止,约5mL。然后用细滴管或注射器仔细注入少量水,约0.5-1mL。室温放置聚合30-40min。

待分离胶聚合后，用滤纸条轻轻吸去分离胶表面的水分，按上表制备浓缩胶。用长滴管小心加到分离胶的上面，插入样品模子(梳子)；待浓缩胶聚合后，小心拔出样品模子。

3．蛋白质样品的处理

若标准蛋白质或欲分离的蛋白质样品是固体，称取lmg的样品溶解于lmL 0.5mol／L pH6.8Tris-盐酸缓冲液或蒸馏水中；若样品是液体，要测定蛋白质浓度，按1.0～1.5mg／mL溶液比例，取蛋白质样液与样品处理液等体积混匀。本实验所用样品为15～20g的标准蛋白样品溶液，放置在0.5mL的离心管中，加入15—20l的样品处理液。在100℃水浴中处理2min，冷却至室温后备用。

吸取未知分子量的蛋白质样品20l，按照标准蛋白的处理方法进行处理。 4． 加样

SDS-聚丙烯酰胺凝胶垂直板型电泳的加样方法

用手夹住两块玻璃板,上提斜插板使其松开,然后取下玻璃胶室去掉密封用硅胶框,注意在上述过程中手始终给玻璃胶室一个夹紧力,再将玻璃胶室凹面朝里置入电泳槽,插入斜板,将缓冲液加至内槽玻璃凹面以上,外槽缓冲液加到距平板玻璃上沿3mm处即可,注意避免在电泳槽内出现气泡。

加样时可用加样器斜靠在提手边缘的凹槽内，以准确定位加样位置，或用微量注射器依次在各样品槽内加样，各加10～15l(含蛋白质10～15g)，稀溶液可加20～30l (还要根据胶的厚度灵活掌握)。 5．电泳

加样完毕，盖好上盖，连接电泳仪，打开电泳仪开关后，样品进胶前电流控制在15～20mA，大约15～20min；样品中的溴酚蓝指示剂到达分离胶之后，电流升到30～45mA，电泳过程保持电流稳定。当溴酚蓝指示剂迁移到距前沿1～2cm处即停止电泳，约1-2小时。如室温高，打开电泳槽循环水，降低电泳温度。 6．染色、脱色

电泳结束后，关掉电源，取出玻璃板，在长短两块玻璃板下角空隙内，用刀轻轻撬动，即将胶面与一块玻璃板分开，然后轻轻将胶片托起，指示剂区带中心插入铜丝作为标志，放入大培养皿中染色，使用0.25％的考马斯亮蓝染液，染色2～4h，必要时可过夜。

弃去染色液，用蒸馏水把胶面漂洗几次，然后加入脱色液，进行扩散脱色，经常换脱色液，直至蛋白质带清晰为止。 7．结果处理

1)测量脱色后凝胶板的长度和每个蛋白质样品移动距离(即蛋白质带中心到加样孔的距离)，测量指示染料迁移的距离。

2)按以下公式计算蛋白质样品的相对迁移率(Rm)

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相对迁移率＝样品迁移距离(cm)／染料迁移距离(cm)

3)标准曲线的制作：以各标准蛋白质相对迁移率为横坐标，蛋白质分子量的对数为 纵坐标在半对数坐标纸上做图，得到一条标准曲线。

4)测定蛋白质样品的分子量：根据待测蛋白质样品的相对迁移率，从标准曲线上查得该蛋白质的分子量。

五、 思考题

1、聚丙烯酰胺盘状凝胶电泳的几个不连续性是什么？ 2、电泳时的三个物理效应是什么？是怎样造成的？ 3、电泳后上下槽缓冲液可否混合后再使用？为什么？ 4、上样缓冲液中加入甘油的作用是什么？ 5、贮液配制及贮存应注意什么？

6、 过硫酸铵、7%乙酸和考马斯亮蓝在实验中有什么作用？

实验七：酵母RNA的提取及组分鉴定

一、目的及要求

了解核酸的组分，并掌握鉴定核酸组分的方法。 二、原理

酵母核酸中RNA含量较多。RNA可溶于碱性溶液，在碱提取液中加入酸性乙醇溶液可以使解聚的核糖核酸沉淀，由此即得到RNA的粗制品。

RNA含有核糖、嘌呤碱、嘧啶碱和磷酸各组分。加硫酸煮沸可使其水解，从水解液中可以测出上述组分的存在。 三、操作：

将15g酵母悬浮于90ml 0.04mol/L氢氧化钠溶液中，并在乳钵中研磨均匀。将悬浮液转移至150ml锥形瓶中。在沸水浴上加热30分钟后，冷却。离心（3000r/min）15分钟将上清液缓缓倾入30ml酸性乙醇溶液中。注意要一边搅拌一边缓缓倾入。待RNA沉淀完全后，离心（3000r/min）3分钟。弃去清夜。用95%乙醇洗涤沉淀2次，乙醚洗涤沉淀一次后，再用乙醚将沉淀转移至布氏漏斗中抽滤。沉淀可在空气中干燥。

取200mg提取的核酸，加入3当量/升硫酸10ml，在沸水浴中加热10分钟制成水解液并进行组分的鉴定。

1．嘌呤碱：取水解液1ml加入过量浓氨水，然后加入约1ml 0.1mol/L银溶液，观察有无嘌呤碱的银化合物沉淀。

2．核糖：取一支试管加入水解液1ml、三氯化铁浓盐酸溶液2ml和苔黑酚乙醇溶液0.2ml。

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放沸水浴中10分钟。注意溶液是否变成绿色，说明核糖的存在。

3．磷酸：取一支试管，加水解液1ml和定磷试剂1ml。在水浴中加热，观察溶液是否变成兰色，说明磷酸是否存在。

实验八 质粒DNA的提取及定性定量测定

一、实验目的

1.学习并掌握用碱裂解法提取质粒DNA的方法；

2.学习并掌握紫外吸收检测DNA浓度和纯度的原理和方法。 二、实验原理

1、质粒DNA的提取与制备 (1)碱裂解法：

质粒DNA与染色体DNA的变性与复性存在差异：

A. 在 pH 12.0～12.6 碱性环境中，细菌的线性大分子量染色体 DNA 变性分开，而共价闭环的质粒 DNA 虽然变性但仍处于拓扑缠绕状态；

B. 将pH调至中性并有高浓度钾盐存在及低温的条件下，去污剂SDS与钾离子反应生成PDS沉淀，大部分染色体DNA交联形成不溶性网状结构和蛋白质一起随着PDS共沉淀，而质粒DNA快速复性且为可溶状态。通过离心，可除去大部分细胞碎片、染色体DNA及蛋白质； C. 上清液中的质粒 DNA用酚、氯仿抽提进一步纯化质粒 DNA 。（可以省略这步，上离心柱） (2)离心层析柱：

A.硅基质膜在高盐、低pH值状态下可选择性地结合溶液中的质粒DNA，而不吸附溶液中的蛋白质和多糖等物质；

B.通过去蛋白液和漂洗液将杂质和其它细菌成分去除；

C.低盐，高pH值的洗脱缓冲液将纯净质粒DNA从硅基质膜上洗脱。

2、 质粒DNA的定量分析（紫外分光光度法）：

A.物质在光的照射下会产生对光的吸收效应，且其对光的吸收是具有选择性； B.各种不同的物质都具有其各自的吸收光谱：

DNA对波长260nm的紫外光有特异的吸收峰；蛋白质对波长280nm的紫外光有特异的吸

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收峰；碳水化合物对230nm的紫外光有特异的吸收峰。 C.A260/A280的比值可以反映DNA的纯度： A260/A280 = 1.8，DNA纯净；

A260/A280 <1.8，表示样品中含蛋白质（芳香族）或酚类物质； A260/A280 >1.8，含RNA杂质，用RNA酶去除。

质粒DNA得率（mg/mL ）：稀释倍数×A260×0.05×50/1.5。 50μg/mL的双链DNA或33μg/mL的单链DNA的A260约为1。 三、实验材料：

1、质粒DNA的提取与制备

仪器：恒温培养箱、台式离心机、离心层析柱、Eppendorf管、微量加样、离心管 材料：溶液 P1（S1）、溶液P2 (S2）、溶液P3（S3）、去蛋白液PE（W1）漂洗液WB（W2）、洗脱液EB（Eluent)、含pUC18或pMD19-T质粒的大肠杆菌DH5α。 1）ＬＢ培养基； 2）ＳＴＥ： 0.1M NaCl

10mM Tris HCl(pH8.0) 1mM EDTA ＡｍＰ 50mg/mL

溶菌酶 10mg/mL (用10mM Tris·HCl pH8.0新鲜配制） 3）溶液 P1（S1） 50mM 葡萄糖

25mM Tris·HCl（pH8.0） 10mM EDTA 4）溶液P2 (S2） 0.2M NaOH 1% SDS 5）溶液P3（S3） 5M KAC 10mL 冰醋酸 11.5mL 水 28.5mL

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6）酚，氯仿，乙醇 RNase

ＴＥ： 10mM Tris-HCl(pH8.0) 1mM EDTA

2、质粒DNA的定量（紫外分光光度法） 仪器：比色杯、紫外分光光度计、微量加样 材料：蒸馏水、质粒DNA 四、实验方法

一）质粒DNA的提取与制备

1. 柱平衡步骤：向吸附柱AC中（吸附柱放入收集管中）加入500μL的平衡液BL，12,000rpm (～13,400×g ) 离心1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。（请使用当天处理过的柱子）。

2. 取1.5～4.5 mL过夜培养的菌液，加入离心管中，使用常规台式离心机，12,000rpm (～13,400×g ) 离心1min，尽量吸除上清（菌液较多时可以通过多次离心将菌体沉淀收集 到一个1.5mL离心管中；用１mL的STE悬浮菌体，再离心回收菌体，并重复一次，弃上清，取沉淀）。

3. 向留有菌体沉淀的离心管中加入250μL溶液P1（请先检查是否已加入RNase A），使用移液器或涡旋振荡器彻底悬浮细菌沉淀。如果有未彻底混匀的菌块，会影响裂解，导致提取量和纯度偏低。

4. 向离心管中加入250μL溶液P2，温和地上下翻转6～8次使菌体充解，室温放置4min。 注意温和地混合，不要剧烈震荡，以免打断基因组DNA，造成提取的质粒中混有基因组DNA片断。此时菌液应变得清亮粘稠，所用时间不应超过5min，以免质粒受到破坏。如果未变得清亮，可能由于菌体过多，裂解不彻底，应减少菌体量。

5. 向离心管中加入350μL溶液P3，立即温和地上下翻转6-8次，充分混匀，此时将出现白色絮状沉淀。12,000rpm (～13,400×g )离心10min。 注意：P3加入后应立即混合，避免产生SDS的局部沉淀。如果上清中还有微小白色沉淀，可再次离心后取上清。

（加入等体积酚/氯仿（１︰１），振荡混匀，12000rpm、 4 ℃离心２min。取上清移至另１个Eppendorf管中。

加入２倍体积无水乙醇，振荡混匀，于室温静置2min。12000rpm、4 ℃离心５min。弃上清，加入１mL、70%乙醇漂洗沉淀，盖严管盖颠倒数次，12000rpm、4 ℃离心２min。

弃上清，室温干燥（5-15min挥干乙醇。加入50μL的TE（含20μg/ml RNA 酶，不含

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DNA酶）溶解DNA。取10μL的DNA溶解液用ＴＥ稀释至1000uL测定A260和A280；计算A260/A280之比；同时按以下公式计算得率。质粒DNA得率（mg/mL ）：稀释倍数×A260×0.05×50/1.5。） 6. 将上一步收集的上清液用移液器转移到吸附柱AC中 （吸附柱放入收集管中），注意尽量不要吸出沉淀。12,000rpm (～13,400×g)离心30～60sec，倒掉收集管中的废液，将吸附柱AC放入收集管中。

7. 可选步骤：向吸附柱AC中加入500μL去蛋白液PD，12,000rpm (～13,400×g )离心30～ 60sec，倒掉收集管中的废液，将吸附柱AC重新放回收集管中。 如果宿主菌是end A+ 宿主菌（TG1，BL21， HB101，JM系列， ET12567等），这些宿主菌含有大量的核酸酶，易降解质粒DNA，推荐采用此步。 如果宿主菌是endA- 宿主菌（DH5α，TOP10等），这步可省略。

8. 向吸附柱AC中加入600μL漂洗液PW（请先检查是否已加入无水乙醇），12,000rpm (～13,400×g )离心30～60sec，倒掉收集管中的废液，将吸附柱AC放入收集管中。 9. 重复操作步骤8。

10. 将吸附柱AC放入收集管中, 12,000rpm (～13,400×g) 离心2min，目的是将吸附柱中残余的漂洗液去除。注意：漂洗液中乙醇的残留会影响后续的酶反应（酶切、PCR等）实验。为确保下游实验不受残留乙醇的影响，建议将吸附柱AC开盖，置于室温放置数min，以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液。

11. 将吸附柱AC置于一个干净的离心管中，向吸附膜的中间部位滴加50～100μL洗脱缓冲液 EB，室温放置2min，12,000rpm (～13,400×g) 离心2 min将质粒溶液收集到离心管中。注意：洗脱缓冲液体积不应少于50μL，体积过小影响回收效率。洗脱液的pH值对于洗脱效率有很大影响。若后续做测序，需使用ddH2O做洗脱液，并保证其pH值在7.0～8.5范 围内，pH值低于7.0会降低洗脱效率。且DNA产物应保存在-20℃，以防DNA降解。为了增加质粒的回收率，可将得到的溶液重新加入吸附柱中，室温放置2min，12,000rpm (～13,400×g) 离心2min，将质粒溶液收集到离心管中。

二）质粒DNA的定量（紫外分光光度法）

离心管中收集到的质粒溶液50μL用蒸馏水稀释约100倍，以蒸馏水为参比溶液，测定A260和A280；计算A260/A280之比；同时按以下公式计算得率。质粒DNA得率（mg/mL ）：稀释倍数×A260×0.05×50/1.5）

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四、结果与讨论： （一）实验现象

1.加入溶液P1，出现悬浮现象；

2.加入溶液P2,温和混匀，溶液会变得清亮； 3.加入溶液P3,有白色絮状沉淀生成；

（二）实验结果

原始实验数据：菌液体积；质粒DNA溶液体积及稀释倍数；A260和A280。 计算A260/A280之比；同时计算质粒DNA得率（mg/mL ）。

五、思考题：

1、碱裂解法提取质粒时，溶液P1、P2、P3的作用分别是什么？ 2、分析实验结果A260/A280 ＜1.8的可能原因。

实验九：用正交法测定几种因素对蔗糖酶活力的影响

一、目的要求

1.初步掌握正交实验设计方法的使用 2.求出蔗糖酶的最适温度和最适pH值 二、实验原理

酶的催化作用是在一定条件下进行的，它受多种因素的影响，如：底物浓度、酶浓度、溶液的pH值和离子浓度、温度、抑制剂和激活剂等都能影响催化反应的速度。通常是在其他因素恒定的条件下，通过对某因素在一系列变化条件下的酶活性测定，求得该因素对酶活力的影响，这是单因素的简单比较法。

本实验用正交法测定温度、pH值、底物浓度和酶浓度四种因素对蔗糖酶活性的影响，这是多因素（≥3）的实验方法。

正交法是通过正交表安排多因素实验，利用统计数学原理进行数据分析的一种科学方法，它符合“以尽量少的试验，获得足够的、有效的信息”的实验设计原则。正交试验法的程序为下列八个步骤：

（1）确定试验目的。实验目的是多种多样的，如找出产品质量指标的最佳组合、确定最佳工艺条件等。本实验的目的是为了提高酶的反应速度，提高酶的活力。

（2）选择质量特性指标。应选择能提高或改进的质量特性及因素效应。对于本实验来说就是产物（葡萄糖）生成量的多少。

（3）选定相关因素。即选择和确定可能对实验结果或质量特性值有影响的那些因素，可人为控制与调节的因素，如温度、pH等。这些因素之间有相互性。

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（4）确定水平。水平，又称位级，是因素的一个给定值或一种特定的措施，或一种特定的状态。水平也就是因素变化的各种状态。在确定水平时，应考虑选择范围、水平数和水平位置。如本实验的温度水平可以选择20℃、30 ℃、50 ℃三个水平。

（5）选用正交表。应从因素数、水平数以及有无重点因素需要强化考察等各方面综合考虑选用正交表。一般情况下，首先根据水平数选用2或3系列表，然后，以容纳试验因素数，选用实验次数最少的正交表。如有重点考察的因素，则根据其多考察的水平数，选混合型正交表。

（6）配列因素水平，制定实验方案。按随机原则，把因素配列于选用的正交表中，制定实验的顺序、时间等，即制定实验具体方案。

（7）实施实验方案。按实验方案，认真、正确地试验，如实记录各种实验数据。 （8）实验结果分析。对实验中取得的各种数据进行分析。如从数据中直接选出符合或接近质量特性期望值的实验条件组。如不能采用直观分析方法，则应采用其他分析方法，确定各因素主次地位可用极差分析方法，定量分析各个因素对实验结果的影响程度，则用方差分析方法。

三、 操作方法 1.实验设计：

1）确定指标：即实验的结果。本实验的指标是酶活力。这里，用A520值表示。 2）制定因素水平表：考察四个因素（温度、pH值、底物浓度和酶浓度），每个因素取三个水平（如温度选择20℃、35 ℃ 和50 ℃ 三个水平）。水平是因素变化的范围（通常是根据专业知识确定。如无资料可借鉴，应先加宽范围再逐步缩小）及要进行实验的具体条件，如表1。

表1 因素水平表 水平 因素 底物浓度 [S] 1 2 3 0.2ml 0.5ml 0.8ml 酶浓度 [E] 0.2ml 0.5ml 0.8ml 温度 20℃ 35℃ 50℃ pH 值 7 8 9

3）选择正交表：可容纳三因素三水平的正交表有L9（34）、L27（313）、L18（36×6）和L27（38×9）。本实验不考察各因素间的交互作用，也没设计混合水平，只有水平数均为3的的四个因素，故选用L9（34）表，见表2。

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实验安排表L9（3） 实验号 1 2 3 4 5 6 7 8 1 1 1 1 2 2 2 3 3 2 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 2 3 1 3 1 4 1 2 3 3 1 2 2 3 29

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分析：

3 3 2 1 A. 判断各因素的水平范围是否选偏； B. 判断各因素显著性大小的顺序； C. 判断实验结果的置信度。 四、具体操作步骤：

1、将已配制好的三种不同pH的0.2mol/L的缓冲液于试管中。 2、将酶粉用蒸馏水溶解（适当体积10-30ml不等），离心去除不溶物，10,000rpm/min,10min,4℃。

3、酶活预示实验，确定酶的稀释倍数。（可根据产物稀释的倍数来确定酶的稀释倍数）A520在0.4-2.0之间即可。

表3 实验操作表

实验号 试剂（ ml ） 2% 蔗糖溶液液 缓冲液 酶液 7 8 9 8 9 7 9 7 8 1 6 8 2 4 9 3 5 7 20℃ 预温 5min 35℃ 预温 5min 50℃ 预温 5min 0.2 0.8 0.5 0.5 0.2 0.8 0.8 0.5 0.2 20℃ 反应 10min 35℃ 反应 10min 50℃ 反应 10min

4、准备10支试管。其中一支为“0”号管，作为测量时的参比溶液。其他九支试管根据前面的图表3加入相关的溶液，分别在不同的条件下进行酶反应。利用二硝基水杨酸的方法测定不同管在A520下的光密度值。

5、计算同一因素不同水平的级差，级差小代表离散度小，表示该水平为酶反应的最适条件。

1）数据记录：将上述两组平行实验的结果取平均值后的9个数据，填入表4中的Yi项内。

2）数据整理及分析：对于一般的实验，可用极差分析，该分析方法简单、直观。对要求精细的实验，则要用方差分析，该方法可给出误差的大小估计，但有一定的计算量。对于有混合水平的正交实验，只能用方差分析。 表4

列号 实验号 1 1 2 3 4 pH 值 1 7 实验结果 A520 30

[S] （ ml ） [E] （ ml ） 温度（ ℃ ） 1 0.2 1 0.2 1 20 2 3 4 5 6 7 8 9 K1（一水平实验结果总和） K2（一水平实验结果总和） K3（一水平实验结果总和） K1/3 K2/3 K3/3 极差R 1 0.2 1 0.2 2 0.5 2 0.5 2 0.5 3 0.8 3 0.8 3 0.8 2 0.5 3 0.8 1 0.2 2 0.5 3 0.8 1 0.2 2 0.5 3 0.8 2 35 3 50 2 35 3 50 1 20 3 50 1 20 2 35 2 8 3 9 3 9 1 7 2 8 2 8 3 9 1 7 本实验，只使用极差分析：极差是指这一列中最好与最坏的之差，从极差的大小就可以看出哪个因素对酶活力影响最大，哪个影响最小。

A. 计算出各水平实验结果总和，即第1、2、3、4列上的k1、k2、k3，并求出k1、k2、k3和k的R值（极差）。

B. 选出优水平组合：据R值的大小，排出因素显著性的顺序，并比较k值选出优水平组合（即好的实验条件）。

由上述数据分析及验证实验，讨论在本实验条件下，温度、pH值、底物浓度和酶浓度对蔗糖酶活性的影响；求出蔗糖酶的最适温度和最适pH值。

最后作一直观分析的结论，以 A 值（ I/3 ， II/3 ， III/3 ）为纵坐标，因素的水平数为横坐标作图。

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