植物转录因子功能分析方法

植物转录因子功能分析方法!

黄泽军

黄荣峰!!====黄大日方#中国农业科学院生物技术研究所，北京%’’’L%*

摘要1==植物转录因子在植物的生长发育及其对外界环境的反应中起着重要的作用。通过各种途径已经分离出大量经序列分析推断为转录因子的基因，但由于方法的局限性，其功能特征还研究得很不够。综述概述了当前常用的研究植物转录因子功能的分子生物学方法，同时介绍了一些研究植物转录因子功能的新方法，如双链MNF和基于糖皮质激素受体的基因诱导表达。

关键词1\"\"植物转录因子；功能分析；双链MNF；糖皮质激素受体；基因诱导表达

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转录因子也称反式作用因子，是指能够与基因启动子区域中顺式作用元件发生特异性相互作用的通过它们之间以及与其它相关蛋白UNF结合蛋白，

之间的相互作用激活或抑制转录b%c。典型的植物转录因子具有UNF结合域、转录域V激活域或抑制域*、寡聚化位点和核定位信号等)个功能区域。转录因子通过这些功能区域在特定的时间进入细胞核内，与特定基因启动子区域中的顺式作用元件相互作用或与其它转录因子的功能区域相互作用来基因的表达b%IBc。近年来，相继分离了一系列植物转录因子，并证明它们在调节植物的生长发育及其对外界环境的反应等方面起着重要的作用b%ICI)c。不仅如此，还发现一个逆境相关转录因子可以多个逆

境相关功能基因的表达，利用转录因子来改良植物抗逆性，能获得较为理想的综合效果b)IJc。拟南芥基因组测序的完成，已推断至少有%JCC个编码转录因子的基因，约占其估计总基因数的J:&d，而果蝇、线虫、酵母的转录因子基因各为eCJ、分ee&和B’&个，别占):Jf、另外拟南芥中植物特有的C:Jf和C:Jf，转录因子占)Jf。拟南芥中转录因子基因数量如此之大、种类如此之多，表明植物转录的复杂性，也表明了植物转录因子研究的重要性，而现在拟南芥中总体上已描述其特征的转录因子只约占其总数的Jfbec。植物转录因子已成为现在生物学研究领域的热点，其功能分析是重要的研究内容之一。相对功植物转录因子功能分析能基因的研究方法b(c而言，

国家重点基础研究发展规划项目#$%&&&’%%(’)*和留学回国人员基金的资助。!\"基金项目：

黄泽军：男，硕士研究生。+,-./01〈23.4567()/4.:;<-:;4=〉%&()年生，:\"\"\"

!!联系作者，><44?;@?A:=====收稿日期：B’’%,%B,C%

!/K农业生物技术学报!\"\"!年

方法只是在一些相关文献中零散报道。本综述概述了当前研究植物转录因子功能常用的方法，如瞬间表达分析方法、突变体或转基因植株功能分析方法，同时也介绍了一些较新的方法，如双链#$%和基于糖皮质激素受体的基因诱导表达。

广泛应用。

针对上述方法的局限性，EB9F等+&G.发明了一种便捷高效的瞬间表达分析方法，该方法不需要昂贵的设备，也不需要准备原生质体，而是利用农杆菌渗透法直接转化烟草植株上的叶片。利用带有适当质粒结构的农杆菌渗透烟草叶片，体内瞬间表达分析转录因子和启动子的相互作用以及转录因子的调节功能只需!-G8H。

&’’’’’植物转录因子瞬间表达分析

植物转录因子瞬间表达分析可以快速提供转录因子的($%结合特性和转录特性)激活或抑制转录*等信息。根据所用的材料，它可以分为植物细胞瞬间转化分析+,-&\".、酵母细胞瞬间转化分析+/-&&.和动物细胞瞬间转化分析+/.等。

&0!88888酵母细胞瞬间转化分析

酵母细胞瞬间转化分析也可提供植物转录因子其可($%结合特性及其转录特性的重要信息，行性在于某些类型的转录域在植物体内和酵母体内都能介导转录活性+/-&&.。

酵母细胞瞬间转化分析与植物细胞瞬间转化分析一样，也需构建效应载体和报告载体，而且具体做法也类似。不过，酵母细胞瞬间转化分析通常主要用来研究植物转录因子的($%结合特性或转录特性，因而具体做法因其研究的侧重点不同而有所差异。

当着重分析植物转录因子的($%结合特性时，效应载体中，该转录因子全长编码序列或仅其推断的($%结合域编码序列，与一个在酵母中能激活转录的转录因子的全长序列或仅其转录激活域编码序列融合，报告载体中目标启动子与报告基因融合。两个载体共转化酵母细胞后，通过检测报告基因的表达情况，可以分析该转录因子的($%结合特性。突变目的转录因子编码序列的碱基或目标启动子的碱基，还可以分析其($%结合域或其所结合的($%序列的特异性+&\".。

当着重分析植物转录因子的转录特性时，效应载体中，该转录因子全长编码序列或仅其推断的转录域编码序列，与一个在酵母中能结合特定顺式作用元件的转录因子的全长编码序列或仅其报告载体中含该特定顺($%结合域编码序列融合。

式作用元件的启动子与报告基因融合。两个载体共转化酵母细胞后，通过检测报告基因的表达情况，可以分析该转录因子的转录特性。突变目的转录因子编码序列中的碱基，还可以分析其激活域+/D&&.。

相对植物细胞瞬间转化分析而言，酵母细胞瞬间转化分析更简便、快速。但有些类型的转录激活域，如富含谷氨酸类，在酵母细胞中无活性+&I.。另外也发现某些植物转录因子与酵母内源转录因子之间存在相互干扰作用+&J.。

总的来说，瞬间表达分析虽然能快速分析转录

&0&’’’’植物细胞瞬间转化分析

植物细胞瞬间转化分析的通常做法是：构建两个载体，一个是指导所研究的转录因子1注：后面将之简称为目的转录因子，其编码基因简称为目的基一个因*高水平表达的效应载体1233245678469:57;45*；是目标启动子与报告基因融合的报告载体172<67527’这两个载体共转化合适的植物细胞。所表469:57;45*，

达的转录因子将与目标启动子相互作用，激活或抑制报告基因的表达，报告基因的活性可在转化后几小时或几天内测定。为了说明转录因子与目标启动子相互作用的特异性，通常都设一个对照。对照设置的方法有两种，一种是用与效应载体相同仅不含目的基因序列的空载体与报告载体共转化；一种是用与报告载体相同仅其启动子被已证明与目的转录因子无关的($%序列代替的载体与效应载体共转化。瞬间转化的方法有：植物组织的基因转化+,.、原生质体的电转化+/.和=>?@ABAC!介导的瞬间转化

+,D&\".

等。

上述方法都能快速地分析转录因子的有关特

性，不过它们在研究那些能与胁迫或伤害诱导的启动子相互作用的转录因子时，均具有一定的局限性。因为当目的转录因子是激活因子时，目标启动子在其等位基因存在的情况下必须保持沉默或低活性。而在上述瞬间转化分析中，目标启动子如果是胁迫或伤害诱导的启动子，则会在组织准备过程中，报告基因因相应内源转录因子的作用而被激活+&!.。因此，对于这些方法，理想的检测组织应该来自于不表达该转录因子的突变株。除了这一共同的局限性外，它们各自还有一些缺点。基因瞬间转化需要非常昂贵的设备，而且所获得的样品差异较大。原生质体瞬间转化所需的原生质体较难获得。电转化也需较昂贵的设备。这些局限性在一定程度上阻碍了它们的

第!期黄泽军等：植物转录因子功能分析方法

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因子的\"#$结合特性和转录特性，但在综合分析其功能方面具有一定的局限性，因此需要与植株体内功能分析相配合。

基因植株，这样由于其高劳动强度，在应用于大量的转录因子研究时，具有一定的局限性。反义抑制的抑制作用只需KG+E9的同源序列就足以产生，特异性较低。这使得利用该方法研究那些高度保守的基因家族的转录因子时，很难产生只抑制目的转录因子表达的突变植株<%6>。

玉米和矮%565%++++插入突变拟南芥’C:4E1D)9*1*+2、牵牛都有大量可用的插入突变体群体，其它植物’如水稻2的插入突变体群体也逐渐在扩充完善。根据目标基因序列和插入序列设计的特异引物对这些突变体基因组\"#C进行LMB扩增，可以筛选到任何一个插入失活的基因。目标基因中插入序列的存在可由LMB产物来确定。这样只需较小的精力就可以筛选大量的株系，从中分离出相应的突变植株。

该方法已成功用于分离鉴定拟南芥转录因子该家族包括FG多个成NOP基因家族的突变体<6Q>，

员。用不同的转座子标记群体和R;\"#$标记群体反向筛选了其中的ST个基因，结果得到了TU个基因的V?个插入突变体。这些确定的突变体株系将可用于B%BT&NOP基因家族中各个成员特殊功能的详细分析。

用插入突变体分析转录因子的功能，主要的局限性在于植物中有一定数量的基因是多拷贝的，有的甚至紧密地串联在一起，通常不易得到目标基因的纯合突变体。

%&&&&&突变体或转基因植株功能分析

植物转录因子的功能需从植株表型、生理代谢、基因表达等方面进行综合分析，而植株表型、生理代谢变化往往是基因表达的改变而引起的，因此分离确定植物转录因子的目标基因是转录因子研究中最需要解决的任务之一。只要有合适的突变体，就可以从植株表型、生理代谢、基因表达等方面的差异，分析该基因的功能，并用遗传方法和差异显示或其它相关技术分离出其下游基因。

植株体内研究转录因子的功能总体上有两大策略：一是基因功能缺失’()**+),&,-./01).2，即筛选目的基因功能部分或全部丧失的植株，比较其与野生型植株在表型、生理代谢和基因表达上的差异，分析该即基因的功能。二是基因功能增加’341.+),+,-./01).2，筛选目的基因高水平表达的植株，比较其与相应对照植株’野生型植株、基因功能缺失突变体或模式植物植株2在表型、生理代谢和基因表达上的差异，分析该基因的功能。

%56&&&&基因功能缺失方法

以往通常是通过筛选自然突变体来获得基因功能部分或全部丧失的植株，但概率很低，现一般通过各种方法人工产生合适的突变体。现在人工产生功能缺失突变体的方法有反义抑制74.01*8.*8&*-99:8*;共抑制7/)*-99:8**1).2<6?>、插入突变和双*1).2<6=>、

链B#C7D)-E(8;*0:4.D8D+B#C@+D*B#C2<6F@%G>等。

也称反义技%5656++++反义抑制和共抑制反义抑制，

术’4.01*8.*8+08/H.)()3I2、反义B#C技术，是指反向的基因全长或部分序列与高活性的组成型启动子或组织特异性启动子融合，通过转化，获得转基因植株。转基因植株中该序列所表达的B#C与其靶从而抑制相应内源基因表达<6=>。共JB#C相互作用，

抑制是指正向的基因全长序列与高活性的组成型启动子或组织特异性启动子融合，通过转化，获得转基因植株。转基因植株中该序列所表达的B#C抑制了相应内源基因的表达<6?>。

反义抑制和共抑制已成功地鉴定了一系列转录因子的功能<6=@6?>。然而这两种方法都有可能导致转基因植株的致死效应或强烈的多重效应，很难从表型鉴定出所需的转基因植株。抑制作用只发生在某些转基因植株中，研究一个转录因子需培育大量的转

%565T&&&&双链B#C&&&&双链B#C是指同时表达的同

一基因序列的*8.*8&B#C和4.01*8.*8&B#C所形成的双链B#C结构，它能强有力地抑制相应内源基

因的表达。其抑制机理目前还不是很清楚，但现已有证据表明植物中D*B#C能引起细胞质中同源B#C降解以及细胞核中同源基因组\"#C甲基化，从而使目标基因沉默<%%>。双链B#C使用的载体可以与反义抑制和共抑制中的一样，只是以正向和反向的同一基因全长序列或部分序列串联在一起与高活性的组成型启动子或组织特异性的启动子融合，也可以利用特殊的植物病毒载体<%T>。

W408:H)-*8&等<6F>证明同时表达!XYZ7缺失了%T6&E9的XYZ基因序列2的*8.*8&B#C和4.01*8.*8&B#C比单独表达其*8.*8&B#C或4.01*8.*8&B#C&能更有效地抑制内源XYZ基因的表达。MH-4.3和N8I8:)[10\\<%G>利用V个功能较清楚的拟南芥基因，成功证明D*B#C在拟南芥中可以有效地抑制含特

异序列基因的功能，是产生参与拟南芥发育分化基因的功能缺失突变体的有效工具。这V个基因中有

!RP农业生物技术学报!\"\"!年

具$%&’盒的基#个编码参与花发育的转录因子：

因%()*和%+%$,-’.%+/以及012(的基因(342%5672%.(%5/。用这种方法获得了特异性强且可遗传的和8:;功能缺失突变体。

随着其抑制相应内源基因表达机理研究的深入，<=45%将可能成为产生基因功能缺失型突变体的强有力的方法。

利用基因功能缺失型突变体分析转录因子功能，虽然有很多成功的例子，但它们都面临着一个共同的问题，许多转录因子只是其基因家族的成员之一，而家族成员存在功能富余，一个基因的纯合突变体由于其它成员的功能补偿而很难确定其功能特征

>!?@

利用鼠的糖皮质激素受体.9MKLBLBEQGLBG<*EDLD:QBEI*

!JO!P@

。其基本原理是：所研究+4/进行翻译后诱导>)!，

的植物转录因子编码序列与+4的类固醇结合结构

域编码序列融合。该转录因子能正常翻译成蛋白质，但在没有活性配体结合的情况下仅在细胞质中积累

>!R@

。其原因认为是无配体结合的类固醇结合域抑制

了该转录因子的核定位、&5%结合和其它可能的活性。使用糖皮质激素诱导后，抑制作用被消除，该转录因子能迅速进入细胞核并表现出其功能。利用瞬间转化的烟草原生质体首次测试了植物中使用+4融合蛋白的可行性，结果利用糖皮质激素的衍生物地塞米松.#U@。用含有地塞米松的营养琼脂培养植株或用诱导性混合物喷洒植株，一个糖皮质激素应答+%V?WX(;J融合蛋白已用于诱导转基因拟南芥和烟草中荧光素酶报告基因的表达。使用化学试剂后;*T观察到了转录因子的目标基因的诱导表达，且其表达量是剂量依赖的>!J@。在此研究中，糖皮质激素对野生型植株没有明显的影响。

基于+4的诱导表达系统已成功地应用于植株体内研究转录因子的功能，并逐步发展完善，已基本实现了从表型、生理代谢、基因表达等方面综合分析转录因子功能的目标。下面用#个典型的例子来说明。

利用基于+4的诱导表达系统，玉米蛋白质4在拟南芥半透明种皮突变体.QQ9/中超表达，通过地塞米松诱导，从表型变化鉴定了其功能>!Y@。拟南芥QQ9突变植株缺乏叶片表皮毛、花青苷和种皮色素，但产生大量的根毛。叶片表皮毛或花青苷的产生可在玉米转录因子4的超表达下得以恢复。4的超表达可以组成型或诱导型方式实现。植株浸泡在含地塞米松的诱导溶液中!?*T后，叶片表皮毛开始形成。叶片上表皮毛的形成的数量以及植株中花青苷累积的数量依赖于糖皮质激素的浓度。

拟南芥Z,基因与+4融合在LB突变体中表达，通过地塞米松诱导，从植株表型、生理代谢、基因表达等方面鉴定了Z,基因的功能>!P@。Z,是一个与类+%6%转录因子有同源序列的蛋白质，Z,发生突变时在长日照情况下推迟开花，而在短日照的条件下没有影响。开花的起始是Z,剂量依赖型的。用地塞米松诱导后，Z,[[+4转基因的拟南芥植株开花时间比未转化的植株早，而且从发芽到形成花的任何发育阶段都可以观测到这一促进作用。地塞米松诱导后!?*T，用原位杂交技术可检测到花分生组

。因此需要与基因功能增加型突变体分析相结合。自然界存在着各式各样的基因功能增加突变

!A!****基因功能增加方法

体，但适合各自研究目的的很少，筛选难度较大。大部分都是利用各种方法人工产生合适的基因功能增加植株。常用的方法有超表达.BCDEDF:ED==GBH/>))I;J@和

!NO!P@

基因诱导表达.GH;!，。

!A!A)****超表达超表达是指目的基因全长序列与

高活性的组成型启动子或组织特异性启动子融合，通过转化，获得该基因产物大量积累的植株。该方法但与已成功鉴定了一系列植物转录因子的功能>))I)J@，反义抑制和共抑制类似，它也会导致转基因植株的致死效应或强烈的多重效应，很难从表型中鉴定出所需的转基因植株。即使得到转基因植株，也很难评价其超表达的程度。植物细胞内转录因子的超表达可能使转录因子与不相关启动子中亲和力较低的结合位点结合，从而激活一些不相关基因的表达，因此很难估计在超表达链中是哪些基因受到。另外，也很难估计哪些基因是受目的转录因子的直接，哪些基因是受其间接。

!A!A!****基因诱导表达在转基因的突变体、异源受

体植株或组织中，基因诱导表达可以实现基因表达的时间控制、空间控制和数量控制，从而避免了超表达所带来的麻烦>!N@。为了避免内源基因的干扰作用，可诱导系统是以非植物成分为基础构建的。在非诱导条件下，所转基因不表达或表达但其产物没有活性，不会干扰植物的正常发育，也不会导致多重效应。一旦给予诱导，基因将迅速表达或其产物迅速被激活，并在一定时间内保持稳定。在植株体内，诱导信号易于被察觉、接受、散布，而且以一种剂量依赖的方式在整个植株或组织中起作用。

植物转录因子研究中，常用的诱导表达系统是

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织同一性基因\"#$%&’\"()*和+#,-./$0(023#,4+(\"*的转录表达，从而确定这些基因是56的下游基因。但尚不能确定它们是否为56的直接下游基因。

拟南芥基因7+7\"7!478!*与:;融合，与基因8<=+<\"\"7+748<*同时在$>!?!1突变体超表达，使用地塞米松诱导，从$>!?!的表型变化鉴定了同时利用蛋白质合成抑制剂放线菌酮78!的功能，

结合差异显示’C.%%#,#/E.$01C.F>0$&D，’@&@02A#B.-.C#D，

分离出一个受同源异型蛋白质异二聚体78!G8<直接的下游基因H781IJKL。该例子中所使用的结合使用蛋白质合成抑制剂放线菌酮的基于:;的诱导表达系统的机理是：在使用诱导剂时或之前，使用放线菌酮，对转录因子的翻译没有影响。使用诱导剂后，可以诱导该转录因子直接的目标基因的转录，但由于放线菌酮的作用，所转录的目标基因不能翻译成蛋白质，从而阻断了该基因的功能。因此，与对照相比，;H7水平发生变化的基因便为该转录因子直接的基因。在花发育的7M5模型中，拟南芥78!和8<是两个已知的M类基因，它们均属于具N7O=盒的转录因子家族。已有实验证明同源异型蛋白质异二聚体78!G8<是花瓣和雄蕊形成所必需的，它们中任一个发生突变均产生同样的表型：花瓣被花萼状的器官代替，而雄蕊被心皮状的器官代替。!P=QQ8<与!P=QQ78!?:;共转入$>!?!，$R!突变体，未使用诱导剂地塞米松时，78!的功能不能恢复。使用地塞米松后，$>!?!突变体的转基因植株的表型恢复正常。利用放线菌酮的抑制作用，结合差异显示，分离出一个受78!G8<直接的目的基因实验证明H78在雄蕊和花瓣细胞分化向细胞H78。

增大转变起作用。

基因的表达，避免现在转基因植株的种种缺陷，因此在功能分析和生产实践等方面，它都不失为一种非常有潜力的方法。

以往常用差异显示分离转录因子的下游基因，速度慢、效率低。目前微阵列T-.@,2$,,$&D已大量用于研究植物基因的组织特异性表达和诱导表达I!JU

!KL

。利用该方法，可以比较快速全面地检测植物转录

因子的表达特性并确定其所的下游基因，更好地分析转录因子的功能。

由酵母、线虫、果蝇和拟南芥的测序结果可知，不同生物的大部分转录因子的功能区域具有相似性

IVL

。因此，借鉴其它生物转录因子的研究方法及所得

结果，必将极大地推动植物转录因子的功能分析研究。

参考文献

张贵友，陈受宜W1植物转录因子的结构与作用W1J11刘强，

科学通报，KXXX，YPQJYVPZJY[Y

K11\".\\1\"U1]A.E#1N1^USN$@;$#S+S_WS+,$/F@,.>E.2/S%$@E2,FS$/CSEA#.,SR#/#FS./SA.RA#,S>0$/EFQS%\\/@E.2/$0SC2-$./FUS#‘20\\E.2/S$/CS,#R\\0$E.2/WS9\\,S^SM.2@A#-USJaaaUSKVKQKY[ZKP[

!SSb.c.FSOUS\"\\-d,#,$FSeUS8$R#FSNWS;20#S2%S78KG9;9M8SE,$/F@,.>E.2/S%$@E2,FS./SR#/#S,#R\\0$E.2/SC\\,./RS$d.2E.@SFE,#FFWS(9M=S\"#EEUSKXXJUSYafQJf[ZJfa

明，)$-$R\\@A?=A./2c$g.SbUS#ES$0WSO;9M转录因YSS刘强，

子在提高植物抗逆性中的作用WS科学通报，KXXXUSYPQJJZJV

PSS黄荣峰U杨宇红U王学臣WS植物对低温胁迫响应的分子机理WS

农业生物技术学报，KXXJ，aQaKZaV

VSS;.#@A-$//S^S\"US_#$,CS^USN$,E./S:US#ES$0WS7,$d.C2>F.FSE,$/F@,.>E.2/S%$@E2,FQS

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!S1111展望

植物转录因子瞬间表达分析虽然在综合分析转录因子功能方面具有一定的局限性，但是它可以快速提供转录因子的OH7结合特性和转录特性的相关信息，因此，它仍将作为一种辅助手段广泛应用。

传统的基因功能缺失和基因功能增加等方法各有其优点，但它们的局限性也十分明显。近来发展较快的利用植物病毒载体的双链;H7技术，既能高效地抑制某一特定转录因子基因或转录因子基因家族中相关基因的表达，又能克服以往转化方法的局限性IK!L，在转录因子功能分析中必将发挥日益重要的作用。而基因诱导表达方法可以很好地控制目标

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