叶绿素荧光动力学及在植物抗逆生理研究中的应用

摘要：光合作用是高等植物从外界环境获取能量的惟一途径，是高等植物进行生命活动的基础，也是整个生物界赖以生存的基础，所以对光合作用的研究有着非常重要的意义。叶绿素荧光技术被称作光合作用的研究探针，具有快速、无损伤、方便快捷等优点，所以应用叶绿素荧光技术来研究光合作用是最佳选择。近年来，随着叶绿素荧光技术的日趋成熟，如激光诱导荧光和叶绿素荧光成像技术等的应用，叶绿素荧光技术在植物的光合作用以及植物的逆境、胁迫、病理等方面的研究日益深入；在果实的品质数量评估方面也有应用，甚至一部分已经在自动化园艺产业生产中得到应用。介绍了国内外关于叶绿素荧光技术在园艺方面的科研成果及应用，并讨论了目前叶绿素荧光技术发展的不足之处。

关键词：叶绿素荧光；园艺；激光诱导荧光；叶绿素荧光成像

1 叶绿素荧光简介

荧光诱导现象最开始是在1931年由Kautsky 和Hirsch发现的。他们发现叶绿素的酒精（或乙醚）溶液在透射光下为翠绿色，反射光下为棕红色，这就是最简单的荧光现象。实际上，荧光是指一种光致发光的冷发光现象。当某种常温物质经某种波长的入射光照射，吸收光能后进入激发态，并且立即退激发并发出比入射光的波长长的出射光（通常波长在可见光波段）；一旦入射光停止，发光现象也随之立即消失。叶绿素荧光现象是由于叶绿素分子吸收光子以后其分子能级发生了变化，由基态变为激发态，当分子退激发回到基态的时候，就会释放出一定的光子，即叶绿素荧光[1]。近年来，荧光检测技术得到了蓬勃发展。随着研究的日益深入，人们也逐渐认识到叶绿素荧光中蕴藏着丰富的生物信息，研究荧光动力学曲线可以反映出植物的生存状态、胁迫、病理等多种信息[2]。叶绿素荧光无论是在宏观上研究叶片和植物，还是在微观上研究细胞和叶绿体，都起着非常重要的作用[3，4]。脉冲振幅调节荧光仪PAM，是目前应用最广泛的一种荧光测试仪。通常它使用可见光作为荧光的激励源，可测光谱范围是705～740 nm[5]。主要应用3种光源，分别是调制脉冲诱导荧光、激光诱导荧光、日光诱导荧光[6]。其中有5个关键的荧光参数，分别是F0、F0′、Fm、Fm′和Fs。其中，F0和Fm是经过暗适应后的最小和最大荧光值，F0′和Fm′是最小和最大荧光值，Fs是荧光的稳定值。其他的荧光参数都是从这5个参数推导出来的，比如光学淬灭qP、非光学淬灭NPQ、PSⅡ能量转换的量子效率ФPSⅡ等。本研究就荧光动力学在园艺方面的应用，将主要阐述作物培养期一些常见的胁迫检测。

2 作物培养期的非生物胁迫检测

2.1 营养胁迫

Chaerle等[7]的研究表明，叶绿素荧光参数能很好地表现出营养胁迫，并以此来确认作物最佳的生长状态，避免缺肥或过度的施肥。研究主要集中在氮肥的吸收上，因为氮是植物吸收最多的元素。事实上叶片中50%～80%的氮都参与了

光合作用[8]。在不同生育期，小麦叶片氮含量与叶绿素荧光参数间差异较大。在生长旺盛的拔节期至开花期相关性较好，孕穗期Fv、Fv/Fm和Fv/Fo相关系数分别为0.7、0.788和0.812，开花期过后其相关系数降低[9]。

2.2 水分胁迫

水资源是作物产能的最重要的因素。高等植物的水胁迫发生时，在短期可以导致叶片的气孔关闭，从而降低光合作用。在研究番茄的水胁迫时发现，轻度的水分胁迫对番茄幼苗荧光参数有一定的促进作用，Fv/Fm逐渐下降，NPQ变化不明显，qL明显上升，随着水分p 极端温度会影响作物的生长和产量，所以有必要知道每种作物的最佳生长温度范围。叶绿素荧光技术可以检测出叶绿体对温度变化的反应。在高温下，CO2的吸收和电子的传送逐渐被抑制，Fo增加，Fm和Fv/Fm由于PSⅡ活性的降低而降低。轻微的热胁迫会导致PSⅡ活性下调并启动光保护系统，较强的热胁迫会抑制保护系统[11]。在研究高温胁迫对水稻的影响时发现，经高温胁迫，水稻的荧光参数和净光合速率均不同程度降低。高温处理5 d后，在常温下恢复2 d，上述参数有所回升，但与常温组相比仍有所下降。随着胁迫温度的升高和天数的延长，上述指标下降幅度有增大趋势[12]。结果表明，高温胁迫抑制PSⅡ潜在活性和净光合速率，阻止同化力的形成，阻碍循环式光合电子传递。

2.4 光胁迫

虽然光照是植物生长的必要条件，但是过度的光照对植物是有害的。基于植物对光的可吸收程度，适当地在强光时遮挡和弱光时补光，能有效地提高作物产量。紫外线照射对植物伤害极大，会损失一定量的核苷酸、蛋白质和脂肪[13]。叶绿素荧光成像技术可以在光照损坏植物细胞之前做出预警。尽管不同的品种由于紫外线而产生的损伤不尽相同，叶绿素荧光成像技术还是可以测量出它们的差异[14]。此外，光子通量密度对于某一个单独的植物来说是不是过度的，取决于它的生理状态，因为当几种环境胁迫同时发生时，光胁迫的临界值也会发生变化[11]。

弱光环境往往伴随着低温，很多研究弱光或者低温情况的时候都是一同进行。在研究棉花的低温弱光胁迫时发现，棉花叶片Fo升高，Fv/Fm下降，表明在低温弱光胁迫下，色素吸收的能量中用于光化学部分的比例减少，用于热耗散和叶绿素荧光的能量增加，PSⅡ潜在活性中心受损，光合电子传递过程受抑，光合机构可能遭受损害，不利于棉花叶片把所捕获的光能转变为化学能；而ФPSⅡ、Fv′/Fm′和ETR下降，表明低温弱光胁迫致使棉花幼苗叶片PSⅡ反应中心随着胁迫时间的延长而逐渐关闭，天线色素光能传递效率逐步下降[15]。2.5 农药胁迫

农药的使用会直接或者间接地影响作物的新陈代谢和光合作用的活性，这样荧光的产量就会发生变化。这种变化可以在叶片发生明显的变化之前检测到[16]。事实上农药渗透到叶片里面很容易被荧光技术检测到。叶片对农药的抑制从中脉开始，叶面上光合作用的活性差异有很强的空间异质性，因此荧光技术可

以用来检测农药的效果。利谷隆（Linuron）是广泛被用来控制多年生野草和阔叶野草的药品。这些药物堵塞了PSⅡ中光电子的转移。这使得在某些植物中会促进叶绿素荧光产量明显增多，从而在一些可视症状出现之前用荧光技术检测到[17]。在对玉米的研究中，在使用敌草隆4 min后，叶片受到的影响可以用荧光成像直观地观察到，这种影响在30 min以后会变得更加强烈，而Fv/Fm大约降低40%[18]。相反，在对豆类植物使用敌草隆后，大约需要2.5 h后荧光产量才显著增加。

2.6 空气污染

在城市和工业地区，臭氧（O3）是主要的空气污染。臭氧会导致植物光合作用降低，改变气孔的导通率，导致早衰、叶片损伤以及改变叶内抗氧化酶水平[19]。减少空气中的臭氧是有必要的，但从短期来看，更有效的做法是培养抗臭氧的植物品种。对豆类植物的研究表明细胞主要的损伤发生在叶片表面气孔周围的柱状薄壁组织。在这些区域附近可以测量得到ФPSⅡ和Fv/Fm下降，Fo上升。从而得到臭氧通过气孔渗透到叶子里并只对气孔附近的细胞有损害[20]。对向日葵的研究中同样观察到了受损细胞，但是发生在表皮细胞，并且与气孔位置无关[21]。除了臭氧以外，还有很多空气污染，比如由煤和汽油燃烧产生的SO2。最早应用荧光技术研究SO2对植物影响的是1987年对向日葵的研究[4]。无论是SO2污染还是从SO2污染的恢复过程中，都会导致叶面的荧光产量的异质性。叶片中脉附近更抵抗SO2，附近的气孔导通率更低，从而减少对SO2的吸收。

3 作物培养期的生物胁迫检测

生物胁迫一般是由虫害或者病原体引起的，从而影响荧光产量。最早应用荧光技术检测病害的是1995年对豆类植物菜豆锈病（Uromyces appendiculatus）的研究[22]和1994年对黄瓜花叶病（Cucumber mosaic）的研究[23]。最早把成像与ФPSⅡ和qN联系起来的是1996年对燕麦感染禾草冠锈病（Crown rust）的研究。禾草冠锈病发病区域不连续，并持续扩散。这些发病区域光合作用的异质性明显。在接种5 d后，发病区的ФPSⅡ略微下降，同时由于对ATP的需求量提高，整个叶片的qN显著降低。该病对叶片的局部区域光合作用有很强的抑制作用[24]。当番茄被葡萄孢菌感染24 h后，光合作用活性被抑制[25]。Fv/Fm的图像表明，叶片感染区域附近的光反应最大量子产量略微减少，然而叶片的其他部分NPQ降低，其他值无变化。无病症的成熟叶片和接种过的叶片有着非常典型的时变NPQ图像。被病原菌入侵的区域NPQ值升高，而在周围则有降低，说明在未感染区域光合作用能力有所提高。在感染的最后阶段，由于衰老过程导致光合作用失调而钝化，所以NPQ下降，因此NPQ对此类病毒有着非常明显的指示作用[26]。大多数的研究都表明发病区和无病区有着明显的荧光产量区别。也有研究叶绿素荧光光谱的发射不同来反映植物病态情况的研究，黄瓜的白粉病害和蚜虫病害与健康的叶片发射的荧光主峰分别是684.197～685.749 nm、685.019～685.620 nm、682.135～685.326 nm，可以看出明显的区别[27]。此研究如果能在病害出现之前即可测出就更有意义了。

4 结论和前景

本研究探讨了叶绿素荧光技术在园艺方面巨大的作用和潜力。这种技术已经成功地被许多研究方向所应用，如收获前期和收获后期的环境、生物逆境和非生物逆境等。荧光技术在研究植物当中有极其重要的优势，那就是它在可识别的症状出现之前检测到胁迫。这在筛选抵抗不同逆境的基因时极其关键，提前检测到胁迫能够节约大量的工作时间。荧光技术还能快速、无损伤同时大量地检测小植物。荧光技术不仅可以用在园艺的研究上，还可以应用到作物的生产上来提高产量和质量。最佳的作物培养环境应该基于作物的生理状态。把这个理念付诸事实第一步需要技术上提供可靠的植物健康信息。在这方面，荧光技术可以应用在温室栽培等多方面产业。荧光技术可以像传感器一样，在作物早期进行分辨，识别出那些新陈代谢受损的作物，来避免由胁迫和病害等产生的损失。早期矫正胁迫可以预防作物的减产，还能有效地避免主观的评判并能准确、客观地监控植物健康生长。但是，对荧光技术的应用仍然处在一个进步期，目前商业化的荧光技术传感器尚未应用。未来的研究有很多可选方向，比如确定环境最佳的范围，这样可以影响作物产量（温度、照度、水等）。通过控制温室作物每一个环境因素在最佳范围，有助于优化肥料的使用和环境的管理。荧光技术主要通过对植物在逆境中的测量，来区别每个环境因素的最佳和非最佳水平。尽管荧光技术在园艺学上是一种非常实用并有前途的一项技术，但是也有它自身的不足。比如，荧光信号的成像会由于表面组织不平整而受到干扰，因为吸收光的多少不一样。强烈的反光面，如石蜡、毛发或者表面有灰尘都会干扰荧光信号。荧光技术在研究中非常重要，但更重要的是，未来荧光技术将作为温室内环境胁迫的指针和收获后的分级工具。未来的商业设备将依靠这项技术和PSⅡ吸收光并发出荧光准确测定产量。需要注意的是，荧光技术要求园艺产品最少有一点叶绿素才能使用。此外，考虑到不同的设备和测量标准，不同试验之间的参数对比起来是相当困难的。所以有必要定义一个通用的标准，使得试验可以重复。另外在生产中，作物通常都会同时面临多种逆境。虽然荧光技术已经证明是非常好的检测工具，但是想弄清楚是哪种胁迫影响了作物还是非常困难的。这也许需要进一步的研究参数。

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