一３６一 中国动物检疫２０１０年第２７卷第９期 柔嫩艾美耳球虫的分离鉴定与致病性测定 王仲兵’，古少鹏 ． （１．山西省动物疫病预防与控制中心，山西太原０３００００；２．山西农业大学动物科技学院，山西太谷０３０８０１） 摘要：本实验采用单卵囊分离技术分离纯化球虫，并根据其临床病理变化、潜隐期、最短孢子化时间等指标综 合判定其为柔嫩艾美耳球虫。用纯化所得球虫卵囊进行致病性试验，结果表明：该柔嫩艾美耳球虫致病力较强，半数 致死量为７．５２×１０ 个／只。 关键词：鸡；柔嫩艾美耳球虫；单卵囊分离；致病性 中图分类号：３８５２．７２３ 文献标识码：Ｂ 文章编号：１００５—９４４Ｘ（２０１０）０９－００３６—０３ ｌａｏｌａｔｉ￣ｎａｔｌ￣ｅ，ａｔｉａｎ ｏｆ Ｅｉｍ￣ｉａ ｔｅａｏｌｌｎ ＰＩ玳即ｅ 柚ｄ Ｏｂ８ 硼 ａｔ＂ｐ｜曲１０ｌ 蚴 Ｗａｎｇ Ｚｈｏｎｇｂｉｎ ，Ｇｕ Ｓｈａｏｐｅｎｇ （１．Ｓｈａｎｘｉ Ｐｒｏｖｉｎｃｉａｌ Ａｎｉｍａｌ Ｄｉｓｅａｓｅ Ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ ａｎｄ Ｃｏｎｔｒｏｌ Ｃｅｎｔｅｒ，Ｔａｉｙｕａｎ，Ｓｈａｎｘｉ ０３０００１ ２．Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ａｎｉｍａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｓｈａｎｇｘｉ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｔａｉｇｕ，Ｓｈａｎｘｉ ０３０８０１） ＾ｂ嘶哺 ：Ｅｉｒｎｅｆｉａ ｔｅｎｅｌｌａ ｗａｓ ｓｅｐａｒａｔｅｄ ａｎｄ ｐｕｒｉｉｆｅｄ ｂｙ ｕｓｉｎｇ ｔｈｅ ｓｉｎｇｌｅ ｏｏｃｙｓｔ ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ，ａｎｄ ｗａｓ ｃｏｎｆｉｒｍｅｄ ａｃｃｏｒｄｉｎｇ ｔｏ ｉｔｓ ｃｌｉｎｉｃ ｐａｔｈｏｌｏｇｉｃａｌ ｃｈａｎｇｅｓ，ｐｒｅｐａｔｅｎｔ ｐｅｒｉｏｄ， ｓｈｏｒｔｅｓｔ ｓｐｏｍｌａｔｉｃ ｔｉｍｅ ａｎｄ ｓＯ ０１１．Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｏｆ ｔｈｅ ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ ｗｉｔｈ ｔｈｅ ｐｕｒｉｉｆｅｄ ｃｏｃｃｉｄｉａｎ ｉｎｄｉｃａｔｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅ ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃｉｙｔ ｏｆ Ｅｉｍｅｒｉａ ｔｅｎｅｌｌａ ｗａｓ ｑｕｉＩｅ ｓｔｒｏｎｇ ａｎｄ，ｔｈｅ ｍｅｄｉａｎ ｌｅｔｈａｌ ｄｏｓｅ ｗａｓ ７．５２×１ ０４／ｃｈｉｃｋ． Ｋ ＷＤＩｄＢ：ｃｈｉｃｋｅｎ；Ｅｉｍｅｒｉａ ｔｅｎｅｌｌａ；ｓｉｎｇｌｅ ｏｏｃｙｓｔ ｉｓｏｌａｔｉｏｍ ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃｉｔｙ； 鸡球虫病是由艾美耳球虫中的 １．２试验动物 现卵囊的即为单卵囊后代，收集保存 一种或几种寄生于鸡肠道黏膜上皮 购自太谷县韩村种鸡场海兰白 盲肠和粪便中的卵囊。 引起的一种寄生性原虫病ｉ１】，世界各 公雏，在无球虫环境中饲养，饲料经 ２．３卵囊扩增 地普遍发生，是目前养禽业中危害最 高压后使用，饮水为清洁凉开水。经 将单卵囊分离试验盲肠收集所 大的一种寄生虫病田。目前认为主要 粪便检查，确认无球虫感染后作为单 得的卵囊接种１０只１１日龄无球虫 有７种禽艾美耳球虫，即堆型艾美耳 卵囊分离试验用动物。 小鸡，一周后剖杀，收集球虫，获得大 球虫、和缓艾美耳球虫、柔嫩艾美耳 １．３主要试剂及仪器 量纯种卵囊。 球虫、巨型艾美耳球虫、早熟艾美耳 主要试剂：饱和食盐水、重硌酸 ２．４虫种鉴定 球虫、布什艾美耳球虫和毒害艾美耳 钾溶液、等渗溶液、氨水； 将上步所得卵囊感染的雏鸡，每 球虫ｐ］。大多数球虫均具有～定的致 主要仪器：电子显微镜、离心机、 日观察鸡的精神状态、食欲和最早发 病性，这使球虫诊断问题复杂化，而 温箱等。 现血便的时间，记录潜隐期，剖杀后 且７种球虫在卵囊形态、结构、大小、 ２试验方法 观察整条肠道，记录主要病变部位。 肠道病变、寄生部位、最短孢子化时 ２．１野毒株的采集及扩增 对收集的纯种球虫卵囊在带有测微 间、最短潜伏期等均具有自身特征， 采集含有球虫卵囊的鸡的粪便， 尺的显微镜下观测其形态结构，测量 它们之间没有交叉免疫原性，同一宿 以饱和盐水漂浮法分离球虫，经增殖 其长径、宽经、大小，计算该株卵囊的 主可以同时感染几种球虫。因此，球 获得大量混合球虫卵囊，置２．５％重硌 形状指数，并将收集到的纯种卵囊保 虫卵囊的分离技术是鉴定球虫的种 酸钾溶液保存。 存于重硌酸钾溶液中，置２８℃温箱 类和建立球虫的纯种体系，调查某地 ２．２单卵囊分离试验 培养，记录其最短孢子化时间，待其 区内球虫种类和获得球虫的纯种体 制备ｌ％琼脂，溶解后浇在培养 孢子化后，在显微镜下观测孢子囊的 系的重要手段［４］，对进一步研究球虫 皿上，厚约１．５ ｍｉｌｌ，凝固后切成每边 形态结构和大小，根据上述各项综合 的致病性、药物效应、产生的耐药性 为０．４ ｃｍ的小方块，移至载玻片上。 指标确定虫种。 和禽体对球虫的免疫性，以及对抗球 将保存的混合卵囊用等渗溶液稀释 ２．４虫种致病性观察 虫药的开发和球虫疫苗研制有重要 至显微镜下观察每小滴含１－２个球 将１１日龄无球虫鸡，分为７个 意义阁。 虫卵囊为止。用毛细滴管将一小滴卵 组，每组９只。分别以１×１０３个／只、 １试验材料 囊液滴于琼脂块上，显微镜下观察， ５×１０３个／只、１×１０ 个／只、２×１０４ １．１试验虫株 当确定液滴内只有一个孢子化的球 个／只、５×１０４个／只、１０×１０４个／ 从太谷县某鸡场采集粪便，经实 虫卵囊时，将一小块保鲜膜覆盖于液 只攻毒，另～组为对照组。接种后每 验室检查确定含有球虫卵囊，用饱和 滴上，经口喂雏鸡，并滴入数滴凉开 曰观测鸡的精神状态、饮食欲和血便 盐水漂浮法分离出球虫卵囊，作本试 水，促进其吞咽。 情况，记录并剖检死亡鸡。一周后剖 验使用虫株。 将感染单个卵囊的鸡于已消毒 杀全部试验鸡，记录攻毒前体重、剖 基金项目：国家自然基金资助项目 环境中隔离饲养，从感染后９６ ｈ逐只 杀前体重、死亡率、盲肠病变记分和 （３０７７１６１ ９）；山西省自然基金（２００４１ ０９４）；山 检查粪便，保存含有球虫的粪便，感 ０．Ｐ．Ｇ值，计算体增重、相对增重率、 西省攻关项目（２００６０３１０５９） 染一周后剖杀，取肠内容物镜检，发 抗球虫指数（ＡＣＩ）值和半数感染量 中国动物检疫２０１０年第２７卷第９期 一３７一 （Ｉ【）５０）、半数致死量（ＬＤ５０）。 图（图１、图２），大小范围为 芯。肉眼观察其他肠段无明显变化。 ８０—２８．８０ Ｕ ｍ×１４．４０－２５．２０ Ｕ ｍ， ２．４．１盲肠病变记分参照田角清旧 ｌ６．除对照组外，各感染组雏鸡，卵 标准 平均大小为２１．５４±０．２４ ｕ ｍ× 囊排出量和血便量随攻毒量增大而 ０：未见病变； ｌ７．８５±０．２４ ｕ ｍ，形状指数为１．２１。 增多，其半数感染量为０．９９×１０ １：盲肠壁有极少量散在出血斑， 收集到的球虫卯囊在２８℃的温箱中 个／只；相对增重率、ＡＣＩ值随攻毒 肠壁增厚，内容物正常； 培养，检测的最短孢子化时间为１９ｈ， 量的增加而减小，攻毒量由１×１０３增 ２：盲肠内有少量血液，肠壁增 将其孢子化的卵囊置于显微镜下观 到１０×１０ 个／只时，雏鸡相对增重 厚，可见多处出血斑； 察，孢子囊有斯氏体，无内外残体。根 率由５５．２７％降到了２９．２８％，可见柔 ３：盲肠内有多量血液，肠壁肥 据上述观测结果，参照国内外文献， 嫩艾美耳球虫对雏鸡增重的影响很 厚，有明显的盲肠变形和萎缩； 可确定该株球虫为柔嫩艾美耳球虫， 大，且剂量越大，对增重的影响越大， ４：盲肠显著萎缩，病变达直肠 并命名为ＥｔｓＸ０１３２３。 对照组雏鸡的ＡＣＩ值为２００，而感染 部，肠壁极度肥厚，盲肠内有盲肠芯。 雏鸡在１×１０。～２×１０４个／只范围 窖 若两侧病变不一致，以病变严重 籁 内，ＡＣＩ值在１５２．８１±１．３３～１００．４５± 蹲 的一侧为准。 ０．７０范围内，可反映出柔嫩艾美耳球 婪 盛 ２．４．２ ＡＣＩ值的计算 虫对雏鸡的损伤较轻微，感染量在 嫩 ＡＣＩ＝（存活率＋相对增重率）一（病变 卷 ５×１０４￣１０×１０ 个／只范围内，雏鸡 卵囊长径（ｕｍ） 记分＋卵囊值）［６１ 的ＡＣＩ值降到了７６．９９±２．１５～ 图１ Ｐｏ卵囊长径百分率图（ｎ＝１００） 卵囊值： ５５．６３±１．１８范围内，此时柔嫩艾美耳 Ｏ．Ｐ．Ｇ值为０～０．１，卵囊值为０； ２５ 球虫对雏鸡的损伤己较严重，可见柔 ２０ ０．Ｐ．Ｇ值为０．１～１，卵囊值为１； 嫩艾美耳球虫对雏鸡ＡＣＩ值的影响 １５ ０．Ｐ．Ｇ值为２～５，卵囊值为１０； 也很大，且随着剂量增大，对ＡＣＩ值 １Ｏ ５ ０．Ｐ．Ｇ值为６～１０，卵囊值为２０； 的影响越来越大；雏鸡的攻毒量在 ０ Ｏ．Ｐ．Ｇ值 １１，卵囊值为４０。 ５×１０ｓ个／只以内不引起死亡，攻毒 ｌ ｌｂ ｌ， ｌ Ｚｌ 卵囊宽径（ｕⅢ） Ｏ．Ｐ．Ｇ值为每克粪便中的卵囊 量在１×１０ 个／只以上，死亡率随攻 图２ Ｐ０卵囊宽径百分率图（ｎ＝ｌ００） 数，以×１０６为单位。 毒量增加而增高，其半数致死量为 ２．４．３ ＩＤ （半数感染量）根据血便 ３．２柔嫩艾美耳球虫致病性试验 ７．５２×１０ 个／只；试验各感染组病理 感染初期，试验鸡精神、饮食欲 剖检均观察到不同程度的肠道病变， 百分率来计算；ＬＤ∞（半数致死量）根 据死亡率来计算 。 无明显的异常。感染４天后，６个实验 随着感染剂量的增加，病变程度越来 组鸡均表现为饮食欲减少，羽毛逆 越严重，当攻毒量在１×１０３３试验结果 ￣５×１０３ ３．１虫种鉴定结果 立，粪便变稀，感染后第５天，鸡群出 个／只以内时，雏鸡盲肠壁见少量散 感染单卵囊后代的雏鸡，感染初 现粪便带血，精神倦怠，双翅下垂， 在出血点，内容物中有少量血液，攻 期，试验鸡精神、饮食欲无明显的异 卧地弓背或尾羽上撅，肛门周围和 毒量在１×１０４￣１０×１０４个／只以内， 常。感染后１２０ ｈ，感染鸡表现为饮食 后覆尾羽粘有红褐色血性粪便。并有 盲肠高度肿胀，肠腔内充满凝血和脱 欲减少，羽毛逆立，粪便变稀，个别鸡 部分鸡只死亡，随感染剂量增加死亡 落肠黏膜。结果见表１、２和图３、４。 开始拉鲜红色粪便；１３５ ｈ开始，每隔 率也相对增高。剖检病死鸡，可见盲 ４分析与讨论 两小时镜检一次粪便，到１４１ ｈ时，第 肠壁增厚、肿胀、出血，肠腔中充满凝 球虫分布范围广，危害大，严重 次从粪便中检出球虫卵囊，可见其 血块和盲肠粘膜碎片及干涸的盲肠 威胁养禽业的发展，球虫病对于雏鸡 最短潜隐期为１４１ ｈ。一周后剖杀，其 表２柔嫩艾美耳球虫对鸡致病性试验的体增重和抗球虫指数（ＡＣＤ的影响 中两只鸡盲肠高度肿胀和大量出血， 黏膜面有大量出血点，肠腔中充满凝 血和肠黏膜碎片，取盲肠内容物和盲 肠黏膜刮取物镜检可见卵囊，其他肠 道无肉眼可见病变，镜检内容物中也 未见球虫卵囊，取小肠中段内容物镜 检，未见裂殖子。因此可确定单卵囊 分离所获得的这株球虫的裂殖生殖 和卵囊寄生部位均在盲肠。用饱和盐 表３柔嫩艾美耳球虫对鸡致病性试验的体增重和抗球虫指数（ＡＣＩ）的影响 水漂浮法收集粪便和盲肠球虫卵囊， 在显微镜下观察，所收集的球虫卵囊 呈宽卵圆形，卵囊壁为二层，光滑，无 卵膜孔，有一圆形极粒位于窄端。用 装有测微尺的显微镜测量１００个球 虫卵囊，测得的卵囊长径集中在 １８．００ Ｕ Ｉｎ￣２４．００ ｌＪ ｍ，宽径集中在 １５．ｏ０ Ｕ ｍ－２１．６０ Ｕ ｍ，将其绘成折线 一一３８一 中国动物检疫２０１０年第２７卷第９期 ３・ ［３］索勋，李国清．鸡球虫病学［Ｍ】． 北京；中国农业大学出版社，１９９８： １１－２４． 求２。 脚 ． 攻毒剂ｉ（１ｏ。个／只） Ｏ． 图３感染柔嫩艾美耳球虫的雏鸡ＡＣＩ值图 攻毒剂量（１Ｏ。个／只） ［４】缮德年，樊生超，姚惠娟，等．鸡 球虫虫种分离鉴定方法研究［Ｊ］．国 外畜牧学一猪与禽，１９９９，（１）１５１． １５２． ［５粱兵，郑宏伟，何光源．鸡球虫单 ５］卵囊的分离与雏鸡感染试验【Ｊ】．中 而言，常常是毁灭性的嗍。其中，致病 变记分图 兽医医药杂志，１９９１（３）：３．５． 力最强的为柔嫩艾美尔球虫（Ｅ． 湖南省衡阳市鸡 ｔｅｎｅｌｌａ）和毒害艾美尔球虫（Ｅ．ｎａｃａ． 时间均为柔嫩艾美耳球虫的特征，且 【１４】刘振湘，唐晓玲．图４感染柔嫩艾美耳球虫的雏鸡盲肠病 ｔｒｉｘ），每年给养禽业带来巨大的损 在小肠中段亦未见到裂殖子。因此， 球虫病病原种类与流行情况调查【Ｊ】． 失。因此，许多学者致力于球虫方面 鉴定分离所的这株纯种球虫为柔嫩 中国兽医寄生虫病，２ｏｏｌ，９（２）： 的研究。要想深入研究每一种球虫的 艾美耳球虫（Ｅ．ｔｅｎｅｌｌａ）。 ２６—２８． 特性就需要提取品种单一的球虫卵 本实验通过设计剂量梯度对所 ［１５］杨汉春主编．动物免疫学［Ｍ】．北 囊进行研究；同时生物技术的进步为 分离出的柔嫩艾美耳球虫进行致病 京：中国农大学出版社．１９９９：１６３．１７１． 球虫的活苗，基因工程苗嘲及球虫遗 性观察，无论从攻毒剂量，还是检测 ［１６］孔繁瑶．家畜寄生虫学（第二版） 传变异的研究提供了更为广阔的空 指标（增重率、盲肠病变、ＡＣＩ值、半 ［Ｍ］．北京：中国农业大学出版社， 间，而获得品种单一、基因型纯净的 数感染量、半数致死量）均可得出该 】９９７． 球虫卵囊是这些研究能否顺利进行 株柔嫩艾美耳球虫的毒力很强，应该 『１７】Ｂｈｏｇａ１ Ｂ Ｓ，Ｍｉｌｌｅｒ ＧＡ．Ｐｏ￣ｎｆｉａｌ 的前提。目前，球虫单卵囊分离技术 引起人们足够的重视。且该株柔嫩艾 ｏｆ ａ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ａｎｔｉｇｅｎ ａｓ ａ ｐｒｏｐｈｙ－ 是获得球虫纯种体系的重要手段【埘， 美耳球虫可供以后柔嫩艾美耳球虫 ｌａｃｔｉｃ ｖａｃｃｉｎｅ ｆｏｒ ｏｎｅ．ｄａｙ．ｏｌｄ ｂｒｏｉｌｅｒ 是上述各种研究的基础。 的进一步深入研究。 ｃｈｉｃｋｅｎｓ ａｇａｉｎｓｔ Ｅ．ａｃｅｒｖｕｌｉｎａ ａｎｄ Ｅ． 柔嫩艾美耳球虫（Ｅ．ｔｅｎｅｌｌａ）显 参考文献： ｔｅｎｅｌｌａ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎｓ『Ｊ１．Ｖｅｔ Ｉｍｍｔｍｏｌ Ｉｍ． 著的特征是寄生于盲肠和临床上出 ［１］索勋，李国清．鸡球虫病学［Ｍ］．北 ｍｕｎｏｐａｔｈｏｌ，１９９２，３１：３２３．３３５． 现明显的血便，本实验分离纯化的这 京：中国农业大学出版社，１９９８： ［１８】缮德年，樊生超，姚惠娟，等．鸡 株球虫具有此特征，在显微镜下其卵 １ １７．３７３． 球虫虫种分离鉴定方法研究［Ｊ】．国 囊结构、测得的卵囊和孢子囊大小、 ［２】江苏泰州市畜牧兽医学校编．畜禽 外畜牧学一猪与禽，１９９９（１）：５１—５２． 卵囊形状指数、潜隐期和最短孢子化 球虫病［Ｊ］．北京农业出版社，１９９３：３２． 北京举行首都现代官方兽医体系建设现场观摩会 ２０１０．年８月ｌＯ日，“首都现代官方兽医体系建设工程暨畜牧兽医综合执法网络智能指挥系统启动仪 式’，在京举行。农业部兽医局张弘、北京市农业局赵根武、市农委李海平、市农业局刘亚清、金兴利、王振邦、任 宗刚同志以及市财政局、市、区县农业局、动物卫生监督管理局等单位有关领导和同志共计１４２人参 加了启动仪式。与会同志先后参观了康庄区域官方兽医室和五肉联驻厂官方兽医室。对官方兽医室的外观设 计、硬件条件、公示内容、档案室、技术室以及相关工作制度进行了现场观摩。赵根武对康庄和五肉联官 方兽医室的运行机制进行详细了解，询问了运行情况，并对官方兽医工作制度的建设提出了要求：一是要重 点加强对签约兽医队伍的管理，通过严把来源，定期督查、强化培训等形式提升签约兽医队伍的能力和素质； 二是要将签约兽医辅助下的首都现代官方兽医工作制度坚持好，运行好，切实保障畜牧业健康发展、动物源 性食品安全，人民群众生命健康。 首都现代官方兽医制度的探索建立是在新修订《中华人民共和国动物防疫法》确定了动物卫生监督机构 及其职能和官方兽医的法律地位，北京市兽医改革的完成的大背景下，根据法规要求和发展需要， 结合本市实际，经过不断研究、探索和在部分区县试点，建立的科学、高效、与国际接轨、具有首都特点的执业 兽医、镇（乡）村兽医、院企兽医多元辅助下的官方兽医制度。目前，全市共考核聘用签约兽医９６３名，其中执 业兽医７６名，镇村兽医４６６名，院企兽医４２１名，签约兽医辅助下的官方兽医工作制度初步建立；按照 匕京 市动物防疫体系建设规划（２００８—２０１２）９要求，官方兽医室规划布局和规模设置已经完成，并开展了建设试点 工作。目前，已建成区域官方兽医室９个，驻厂（场）官方兽医室５个。上述工作的开展，有效解决了现有官方 兽医设置与实际工作现状和发展要求不相适应的状况，极大地提高了官方兽医公共服务水平，并逐步向世界 官方兽医工作迈进。
