洼地绵羊MHC-DRB1基因PCR-RFLP多态性分析

动物医学进展。２０１　１，３２（５）：６３—６８　Ｐｒｏｇｒｅｓｓ　ｉｎ　Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ　Ｍｅｄｉｃｉｎｅ　洼地绵羊ＭＨＣ—ＤＲＢ１基因ＰＣＲ－ＲＦＬＰ多态性分析　肖　娜。，任艳玲　。，李敏。，董文艳。，沈志强　２＊　（１．山东省滨州畜牧兽医研究院，山东滨州２５６６００；２．山东省洼地绵羊繁育技术研究推广中心，山东滨州２５６６００；　３．山东绿都生物科技有限公司，山东滨州２５６６００）　摘　要：为了探讨洼地绵羊ＭＨＣ—ＤＲＢ１基因的多态性，采用套式ＰＣＲ扩增８２只洼地绵羊的ＭＨＣ＿　ＤＲＢｌ基因第２外显子，其２９６　ｂｐ扩增产物经．Ｓａｃ　Ｉ、ＨⅡｅ　Ｉ］Ｉ限制性内切酶酶切后进行ＲＦＬＰ多态性分析。　结果表明，洼地绵羊的ＭＨｃ—ＤＲＢ１基因外显子２在Ｓａｃ　Ｉ、　ｅⅢ的酶切位点存在多态性，测序发现，这些　酶切位点分别受２、５个等位基因控制，由于ＭＨＣ—ＤＲＢ１为多碱基突变的基因位点，综合２种限制性内切酶　的酶切结果，在洼地绵羊中共发现ｌ５种基因型，其中新的等位基因ＭＨＣ—ＤＲＢ１．Ｄ（２２５　ｂｐ／７１　ｂｐ）仅在该洼　地绵羊群体中发现。对ＭＨＣ．ＤＲＢ１的５个等位基因的核苷酸序列以及预测的氨基酸序列分别进行比对，　发现５个等位基因间存在丰富的变异位点。　关键词：洼地绵羊；ＭＨＣ＿ＤＲＢ１基因；聚合酶链反应和限制性片段长度多态性；多态性　中图分类号：￥８５２．１６５　文献标识码：Ａ　文章编号：１００７—５０３８（２０１１）０５—００６３—０６　主要组织相容性复合物（ｍａｊｏｒ　ｈｉｓｔｏｃｏｍｐａｔｉ—　来应答细胞毒Ｔ淋巴细胞，而ＭＨＣ　１分子主要与　ｂｉｌｉｔｙ　ｃｏｍｐｌｅｘ，ＭＨＣ）是由紧密连锁、高度多态的基　外来抗原相结合并将这些抗原递呈给Ｔ淋巴细胞，　因位点所组成的复合物。哺乳动物主要的组织相容　最终引起机体的免疫反应Ｌ２］。　复合物包括两个亚家族，即或Ｉ型和Ⅱ型。ＭＨＣ　不同物种之间ＭＨＣ连锁群包含的基因座位种　的表达产物是细胞表面的糖蛋白，ＭＨＣ　Ｉ是由ａ微　类以及核苷酸序列的同源性非常高，绵羊的ＭＨＣ　球蛋白和ｐ２微球蛋白两条多态链组成；ＭＨＣ１１分　称为ＯＬＡ（ｏｖｉｎｅ　ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ　ａｎｔｉｇｅｎ），位于绵羊第　子是异源二聚体，是由ａ和Ｉ３链组成，在抗原细胞表　２０号染色体上。ＭＨＣ抗原由多肽结合区、类免疫　面表达［１］。ＭＨＣ　Ｉ、ＩＩ结构上很类似，但是它们的　球蛋白区、跨膜区和胞质区组成，其中的多肽结合区　功能却不尽相同。ＭＨＣ工主要作为一种内源抗体　是决定其抗原递呈功能的结构域，由ＭＨＣ基因的　收稿日期：２０１０—１２一ｌｌ　基金项目：国家高技术研究发展计划（８６３计划）（２Ｏ０８ＡＡ１Ｏｚ１４２）；山东省自然科学基金（Ｙ２０ｏ７Ｄ１２）；山东省良种工程　（２００６ＧＧ２２）　作者简介：肖　娜（１９８３～），女，山东滨州人，硕士，主要从事动物分子遗传育种与繁殖研究。＊通讯作者　料诺－ｇ／　÷崇崇＋ｋ－崇球料岽啦求豢÷＊杀条杀料　Ｓｕｂ—ｃｈｒｏｎｉｃ　Ｔｏｘｉｃｉｔｙ　Ｔｅｓｔ　ｏｆ　Ｇｉｎｓｅｎｇ　Ｌｅａｆ　Ｏｒａｌ　Ｌｉｑｕｉｄ　ｉｎ　Ｒａｔｓ　ＧＵＯ　Ｙｉｎｇ—ｅｈｕｎ　，ＤＩ　Ｊｉｎｇ　，ＨＵ　Ｓｏｎｇ—ｈｕａ　，ＹＡＮＧ　Ｙｉｎｇ　，ＮＩ　Ｊｉｎｇ—ｘｕａｎ　，ＷＡＮＧ　Ｙｕ　（１．Ｃｏｌｌｅｇｅ　ｏｆＶｅｔｅｒｉｎａ￣－ｙＭｅｄｉｃｉｎｅ，ＩｎｎｅｒＭｏｎｇｏｌｉａＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｈｏｈｈｏｔ，ＩｎｎｅｒＭｏｎｇｏｌｉａ，０１００１８，Ｃｈｉｎａ；　２．Ｃｏｌｌｅｇｅ　ｏｆＡｎｉｍａｌ　Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｚｈｅｊｉａｎｇ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｈａｎｇｚｈｏｕ，Ｚｈｅｊｉａｎｇ，３１００００，Ｃｈｉｎａ）　Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｔｈｅ　Ｗｉｓｔａｒ　ｒａｔｓ　ｗｅｒｅ　ｒａｎｄｏｍｌｙ　ｄｉｖｉｄｅｄ　ｉｎｔｏ　４　ｇｒｏｕｐｓ，ｔｈｅ　ｔｈｒｅｅ　ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ　ｇｒｏｕｐｓ　ｗｅｒｅ　ｇｉｖｅｎ　ｇｉｎｓｅｎｇ　ｌｅａｆ　ｏｒａｌ　ｌｉｑｕｉｄ　ｉｎ　ｄｏｓｅｓ　ｏｆ　４０，８０，１　６０　ｍｇ／ｋｇ　ｂｙ　ｇａｓｔｒｉｃ　ｌａｖａｇｅ　ｆｏｒ　２８　ｄａｙｓ　ａｎｄ　ｗｅｒｅ　ｏｂｓｅｒｖｅｄ　ａｆｔｅｒ　ｓｔｏｐｐｉｎｇ　ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ　ｆｏｒ　１４　ｄａｙｓ．Ｔｈｅ　ｃｏｎｔｒｏｌ　ｇｒｏｕｐ　ｗａｓ　ｇｉｖｅｎ　ｔｈｅ　ｓａｍｅ　ａｍｏｕｎｔ　ｏｆ　ｎｏｒｍａｌ　ｓａｌｉｎｅ．Ｔｈｅ　ｂｏｄｙ　ｗｅｉｇｈｔ，ｉｎｄｅｘｅｓ　ｏｆ　ｈｅｍａｔｏｌｏｇｙ　ａｎｄ　ｂｌｏｏｄ　ｂｉｏ—ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，ｗｅｉｇｈｔ　ｃｏｅｆｆｉｃｉｅｎｔｓ　ｏｆ　ｏｒｇａｎｓ　ｗｅｒｅ　ｏｂｓｅｒｖｅｄ．　Ｒｅｓｕｌｔｓ　ｓｈｏｗｅｄ　ｔｈａｔ　ｔｈｅ　ｂｏｄｙ　ｗｅｉｇｈｔ，ｉｎｄｅｘｅｓ　ｏｆ　ｈｅｍａｔｏｌｏｇｙ　ａｎｄ　ｂｌｏｏｄ　ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，ｗｅｉｇｈｔ　ｃｏｅｆｆｉｃｉｅｎｔｓ　ｏｆ　ｏｒｇａｎｓ　ｗｅｒｅ　ｎｏｔ　ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ　ｆｒｏｍ　ｔｈａｔ　ｉｎ　ｔｈｅ　ｃｏｎｔｒｏＩ　ｇｒｏｕｐ（尸＞０．０５）．Ｒｅｓｕｌｔｓ　ｃｏｎｆｉｒｍｅｄ　ｔｈａｔ　ｒａｔｓ　ｈａｄ　ｎｏ　ａｄｖｅｒｓｅ　ｒｅａｃｔｉｏｎ　ａｆｔｅｒ　ｂｅｉｎｇ　ｇｉｖｅｎ　ｇｉｎｓｅｎｇ　ｌｅａｆ　ｏｒａｌ　ｌｉｑｕｉｄ　ｆｏｒ　２８　ｄａｙｓ，ａｎｄ　ｈａｄ　ｎｏ　ｄｅｌａｙｅｄ　ａｄ—　ｖｅｒｓｅ　ｒｅａｃｔｉｏｎ　ｉｎ　１４　ｄａｙｓ’ｒｅ　ｅｏｖｅｒｙ．　Ｋｅｙ　ｗｏｒｄｓ：ｇｉｎｓｅｎｇ　ｌｅａｆ　ｏｒａｌ　１ｉｑｕｉｄ；ｓｕｂ—ｃｈｒｏｎｉｃ　ｔｏｘｉｃｉｔｙ；ｒａｔ　６４　动物医学进展２０１１年第３２卷第５期（总第２１５期）　第２外显子编码。研究表明，虽然ＭＨＣ抗原的种　类很多，只有ＤＲ抗原和ＤＱ抗原主要发挥作用　］。　因此，有关ＭＨＣ的报道多集中于ＤＲ基因和ＤＱ　基因的第２外显子。　随着长期自然选择和人工选择，洼地绵羊形成　了独特的优势，如繁殖力高、抗逆性强。然而，由于　近年来外来商业绵羊品种以及具有优良性状的遗传　育种绵羊的引入，纯种洼地绵羊的数目也在逐渐减　少。如果群体数目继续减少，将导致一些在免疫过　程中起重要作用的基因的遗传变异丢失，从而使该　群体抗疾病能力减弱，面临灭绝的危险Ⅲ。本研究　对洼地绵羊群体中ＭＨＣ－ＤＲＢ１基因位点的多态性　进行了初步的研究，为未来研究ＭＨＣ基因对微生　物引起的绵羊疾病感染的影响奠定了基础　引。　１材料与方法　１．１材料　１．１．１样品采集　洼地绵羊样品来自山东省洼地　绵羊原种场，共８２只，颈静脉采血，ＡＣＤ抗凝，全血　基因组试剂盒为宝生物工程（大连）有限公司产品。　（Ｃｏｄｅ　Ｄ９０８１），提取基因组ＤＮＡ，置－－２０℃保存备　用。　１．２　方法　１．２．１　引物合成及ＰＣＲ—ＲＦＬＰ　引物合成参照文　献［６］，引物序列如下：　ＯＬＡ—ＥＲＢＩ（ＧＣ）：５＇－ＣＣＧ　ＧＡＡ　ＴＴＣ　ＣＣＧ　ＴＣＴ　ＣＴＧ　ＣＡＧ　ＣＡＣ　ＡＴＴ　ＴＣＴ　Ｔ一３　；　Ｈ　ＬＯ３１：５＇－ＴＴＴ　ＡＡＡ　ＴＴＣ　ＧＣＧ　ＣＴＣ　ＡＣＣ　ＴＣＧ　ＣＣＧ　ＣＴ一３　；　０ＬＡ—ＸＲＢＩ：５　一ＡＧＣ　ＴＣＧ　ＡＧＣ　ＧＣＴ　ＧＣＡ—　ＣＡＧ　ＴＧＡ　ＡＡＣ　ＴＣ：３　。　根据文献［６］的试验条件为基础进行套式　ＰＣＲ。反应体系为：第一轮（２０／ｘＬ）１０×ｂｕｆｆｅｒ　２．０　Ｌ，ＭｇＣ１２（２５　ｍｍｏｌ／Ｌ）１．２肛Ｌ，ｄＮＴＰ　（２　ｍｍｏｌ／Ｌ）１．２　Ｌ，ＨＬ０３ｌ（１￣ｍｏｌ／Ｌ）２．０　Ｌ，　０ＬＡ—ＥＲＢ１（１／ｌｍｏｌ／Ｌ）　２．０　Ｌ，Ｔａｑ　３　Ｌ　（１．５　Ｕ），最后加ｄｄＨ。Ｏ至２０　Ｌ。ＰＣＲ反应条件　为：９４℃５　ｍｉｎ；９４℃３０　Ｓ，５０℃３０　Ｓ，７２℃６０　Ｓ　５　个循环；７２℃１０　ｍｉｎ，４℃终止反应。　第二轮（２Ｏ　ｔｔＬ）：１０×ｂｕｆｆｅｒ　２．０　，ＭｇＣ１２　（２５　ｍｍｏｌ／Ｌ）１．２　Ｌ，ｄＮＴＰ（２　ｍｍｏｌ／Ｌ）１．２　Ｌ，　０ＬＡ—ＸＲＢＩ（１　ｇｍｏｌ／Ｌ）４．０　“Ｌ，ＯＬＡ—ＥＲＢ１　（１　ｔ．ｔｍｏｌ／Ｌ）４．０　ｇＬ，Ｔａｑ　３　Ｌ（１．５　Ｕ）；最后加　ｄｄＨ２０至２Ｏ　Ｌ。ＰＣＲ反应条件为：９４℃５　ｍｉｎｉ　９４℃３０　Ｓ，６３℃３０　Ｓ，７２℃６０　Ｓ　３０个循环；７２℃　１０　ｍｉｎ，４℃终止反应。ＰＣＲ产物经ｉ０　ｇ／Ｌ琼脂糖　凝胶电泳，凝胶成像仪观察结果。　通过ＲＦＬＰ分析来检测多态性位点。ＰＣＲ扩　增产物通过Ｓａｃ　Ｉ、ＨａｅⅢ限制性内切酶进行酶　切，然后经２０　ｇ／Ｌ的琼脂糖凝胶电泳进行分离。　１．２．２　ＭＨＣ—ＤＲＢ１基因克隆与序列分析选取不　同基因型的检测样品，ＰＣＲ扩增产物经１２　ｇ／Ｌ琼　脂糖凝胶电泳后，利用ＤＮＡ凝胶回收试剂盒回收　纯化后，连接ｐＧＥＭ—Ｔ载体，转化到感受态细胞　ＤＨ５ａ中，挑选阳性克隆，提取质粒ＤＮＡ，由上海生　工生物工程技术服务有限公司完成测序。　１．２．３等位基因测序及遗传多样性分析测序后，　在ＮＣＢＩ数据库（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｈｉｍ．ｎｉｈ．　ｇｏｖ／）进行Ｓｔａｎｄａｒｄ　ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ－ｎｕｃｌｅｏｔ［ｄｅ　Ｂｌａｓｔ搜　索。各序列经过ＤＮＡ　Ｓｔａｒ　５．０３软件包中的Ｅｄｉｔ—　ｓｅｑ、Ｓｅｑｍａｎ和Ｍｅｇａｌｉｇｎ软件并结合排序分析，比　较序列的同源性。序列间的核苷酸、氨基酸差异数、　转换、颠换、各序列的碱基含量均由ＭＥＧＡ　３．０软　件进行计算。分析该物种的遗传多样性。基因频　率、基因型频率、Ｙ。适合性检验以及基因杂合度的　计算均用Ｐｏｐｇｅｎｅ３２软件进行。　２　结果　２．１　ＭＨＣ－ＤＲＢ１基因ＰＣＲ扩增　应用套式ＰＣＲ扩增了洼地绵羊ＭＨＣ＿ＤＲＢ１　的第２外显子，扩增产物为２９６　ｂｐ（图１）。　２．２　ＰＣＲ—ＲＦＬＰ结果　参照Ｋｏｎｎａｉ　Ｓ等［６　报道的绵羊酶切图谱和等　位基因命名方法对绵羊ＭＨＣ＿ＤＲＢ１基因ＰＣＲ－　ＲＦＬＰ的电泳检测结果进行判型。　在Ｓａｃ　Ｉ酶切位点上，洼地绵羊表现出多态性，　出现有（２９６　ｂｐ）、ＢＢ（２０８　ｂｐ和８８　ｂｐ）和ＡＢ（２９６、　２０８、８８　ｂｐ）３种表型，Ｓａｃ　Ｉ酶切位点受Ａ和Ｂ两　个共显性基因控制（图２）。８２个洼地绵羊个体　ＭＨＣ－ＤＲＢ１经Ｓａｃ　Ｉ酶切后的基因频率和基因型　频率见表１。　在Ｈａｅ　ｍ酶切位点上，８２个洼地绵羊个体上出　现了１２种基因型，即ＡＡ、ＣＣ、ＤＤ、ＢＢ、ＥＥ、ＢＣ、ＢＥ、　ＤＥ、ＣＤ、ＡＤ、ＡＥ、ＡＣ，有５种复等位基因，即Ａ　（１５９　ｂｐ／１３７　ｂｐ）、Ｂ（１５９　ｂｐ／１２３　ｂｐ／１４　ｂｐ）、Ｃ　（１５９　ｂｐ／７１　ｂｐ／５２　ｂｐ／１４　ｂｐ）、Ｄ（２２５　ｂｐ／７１　ｂｐ）、Ｅ　（１５９　ｂｐ／６６　ｂｐ／７１　ｂｐ）控制（图３）。５种等位基因中　Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｅ与Ｋｏｎｎａｉ　Ｓ等Ｅ。　报道的绵羊酶切图谱中　６种等位基因中的４种相同，分别是等位基因ｅ　（１５９／１３７）、ｄ（１５９　ｂｐ／１２３ｂｐ／１４　ｂｐ）、ｅ（１５９　ｂｐ／　６６　ｂｐ／７１　ｂｐ）、ｆ（１５９　ｂｐ／７１　ｂｐ／５２　ｂｐ／１４　ｂｐ）。同　时确定了ｌ２个基因型，５个纯合型和７个杂合型。　肖　娜等：洼地绵羊ＭＨ＆ＤＲＢ１基因ＰＣＲ—ＲＦＬＰ多态性分析　６５　８２个洼地绵羊个体ＭＨＣ—ＤＲＢ１经Ｈａｅ　１１Ｉ酶切后　现的５种等位基因中，Ｄ等位基因是一种新的等位　的基因频率和基因型频率见表ｌ。此外，本研究发　基因，在以前的研究中并未发现　。　２　３　４　６　２９６　ｂｐ——　Ｍ．ＤＮＡ标准ＤＬ　２　０００；１～６．ＭＨＣ—ＤＲＢ１　ＰＣＲ产物　Ｍ．ＤＮＡ　Ｍａｒｋｅｒ　ＤＬ　２　０００；１－６．ＰＣＲ　ｐｒｏｄｕｃｔｓ　ｏｆ　ＭＨＣ－ＤＲＢ１　图１套式ＰＣＲ扩增产物的检测结果　Ｆｉｇ．１　Ｄｅｔｅｃｔｉｎｇ　ｒｅｓｕｌｔｓ　ｏｆ　ｎｅｓｔｅｄ　ＰＣＲ　ｐｒｏｄｕｃｔｓ　Ｍ　ｌ　２　３　４　５　６　７　Ｍ　１　２　３　４　５　６　Ｍ　８　９　１（）１１　１２　１３　ｆ　７　８　９　１０　Ｍ．ＤＮＡ标准ＤＬ　５００；１．ＢＢ基因型；２，４，５，１０，１３．ＡＡ基　Ｍ．ＤＮＡ标准ＤＬ　５００；１～２．ＡＥ基因型；３～４。ＥＥ基因型；　因型；３，６，７，８，９，１１。１２．ＡＢ基因型　５～６．ＣＤ基因型；７～８．ＡＤ基因型；９～１０．ＢＣ基因型　Ｍ．ＤＮＡ　Ｍａｒｋｅｒ　ＤＬ　５００；１．ＢＢ　ｇｅｎｏｔｙｐｅ；２，４，５，１０，１３．ＡＡ　Ｍ．ＤＮＡ　Ｍａｒｋｅｒ　ＤＬ　５００；１－２．ＡＥ　ｇｅｎｏｔｙｐｅ；３－４．ＥＥ　ｇｅｎｏｔｙｐｅ；　ｇｅｎｏｔｙｐｅ；３，６，７，８，９，１１，１２．ＡＢ　ｇｅｎｏｔｙｐｅ　５－６．ＣＤ　ｇｅｎｏｔｙｐｅ；７－８．ＡＤ　ｇｅｎｏｔｙｐｅ；９－１０．ＢＣ　ｇｅｎｏｔｙｐｅ　图２　ＤＲＢｌ基因的Ｓａｃ酶切鉴定　图３　ＤＲＢ１基因的Ｈａｅ　Ｕｌ酶切鉴定　Ｆｉｇ．２　Ｉｄｅｎｔ．ｆｉｃａｔｉｏｎｎ　ｏｆ　ＤＲＢ１　ｇｅｎｅ　ｄｉｇｅｓｔｅｄ　ｗｉｔｈ　Ｓａｃ　Ｉ　Ｆｉｇ．３　Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎｎ　ｏｆ　ＤＲＢ１　ｇｅｎｅ　ｄｉｇｅｓｔｅｄ　ｗｉｔｈ　Ｈａｅ　ＵＩ　表ｌ　洼地绵羊ＭＨＣ—ＤＲＢ１外显子２　Ｓａｃ　Ｉ、Ｈａｅ　Ｉｌｌ酶切位点的基因型和等位基因及其频率　Ｔａｂｌｅ１　Ｇｅｎｏｔｙｐｅｓ　ａｎｄ　ａｌｌｅｌｅｓ　ｆｒｅｑｕｅｎｃｉｅｓ　ａｔ　ｔｈｅ　ｌｏｃｉ　ｄｉｇｅｓｔｅｄ　ｗｉｔｈ　ＨａｅⅢａｎｄ　Ｓａｃ　Ｉ　ｏｆ　ＭＨＣ－ＤＲＢ１　ｇｅｎｅ　ｅｘｏｎ　２　ｉｎ　Ｗａｄｉ　ｓｈｅｅｐ　６６　动物医学进展２０１１年第３２卷第５期（总第２１５期）　２．３　Ｙｚ适合性检验结果　本研究所获得目的序列编码９８个氨基酸（图　叭舭　Ａ　Ｂ　Ｃ　Ｄ　Ｅ　豫胩胩　腿　采用　ｚ适合性检验法分析了洼地绵羊ＭＨＣ—　５），其中６９个位点为保守区，２９个位点为可变区。　腿眯砒叭　ＤＲＢ１基因外显子２是否处于平衡状态。适合性检　２Ｏ种氨基酸中没有酪氨酸，其他ｌ９中氨基酸虽然有　＾验结果表明，洼地绵羊在限制性内切酶Ｓａｃ　Ｉ、Ｈａｅ　使用，但是使用频率差异很大，如丝氨酸使用频率高　Ⅲ的　２值分别是４．６０８（Ｐ　ｄ０．０５）、４１．２８６（Ｐ＜　达１９．８３６，而天冬酰胺的使用频率仅为０．２０４　５％。　０．０１），均未达到Ｈａｒｄｙ－Ｗｅｉｂｅｒｇ平衡状态。　２．４　ＨａｅⅢ酶切目的ＤＮＡ的测序及序列分析结果　ｑ　ｑ　ｑ　ｑ　ｑ　Ｂ　∞∞　ｑ　ｑ　＝主　丙氨酸、半胱氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、苯丙氨酸、甘　氨酸、组氨酸、异亮氨酸、赖氨酸、蛋氨酸、亮氨酸、天　目的ＤＮＡ测序及序列分析得到５个等位基因　冬酰胺、脯氨酸、谷氨酰胺、精氨酸、丝氨酸、苏氨酸、　（图４）。在８２只洼地绵羊ＭＨＣ＿ＤＲＢ１　ｅｘｏｎ　２序列　缬氨酸、色氨酸的含量分别是７．９８　、３．４８　、　长度为２９６　ｂｐ中，共发现４１（１４％）个变异位点，不　２．Ｏ５　、２．６６　、１．Ｏ２　、ｌ１．２４　、１．Ｏ２　、３．４８　、　包括同一位点出现多种碱基的位点，未发现插人或　Ｃ　２４．４　，Ｇ　３４．６　，Ｔ　１８．９　，其中（Ｇ＋Ｃ）为　１．４３　、３．６８　、１．６３　、０．２０　、５．９３　、１．Ｏ２　、　　、２。８６　、５．５２　。　缺失位点。４种碱基的含量分别为Ａ　２２．２　，　ｌＯ．６３％、ｌ９．８３　、１４．３ｌ利用最大简约法［１　，非同义替换率远远大于同　义替换率（ｄｎ：ｄｓ＝５：１）。　５９　，高于（Ａ＋Ｔ）４１．１　。　Ｍａｊｏｒｉｔｙ　…ＣＣＧＧＡＡＴＴＣＣＣＧＴＣＴＣＴＧＣＡＧＣＡＣＡＴＴＴＣＴＴＧＧＡＧＴＡＴＴＣＴＡＡＧＡＧＣＧＡＧＴＧＴＣＡＴＴＴＣＴＴＣＡＡＣＧＧＧＡＣＧＧＡＧＣＧＧ６ＴＧ　…一一一＋………＋…一…一一十…一…＋……一一一＋……一一一＋一……一一＋一一…一…＋　１０　………２０　……＋………３０　＋………４０　＋………５０　＋………６０　＋………７０　＋………８０　＋　＋…８Ｏ　８Ｏ　８Ｏ　…．Ｃ………　８Ｏ　８０　Ｍａｊｏｒｉｔｙ　…ＣＧＧＴＴＣＣＴＧＧＡＣＡＧＡＴＡＣＴＴＣＴＡＴＡＡＴＧＧＡＧＡＡＧＡＧＴＡＣＧＴＧｃＧＣＴＴＣＧＡｃＡＧＣＧＡｃＴＧＧＧＧＣＧＡＧＴＡＣＣＧ＾ＧＣＧＧＴＩＧｌ　……＋………＋………＋………＋………＋………＋………＋………＋　９０　………１Ｏ０　……＋………１１０　＋………ｌ２Ｏ　＋………ｌ３Ｏ　＋………１４０　＋………１５０　＋………１６０　＋　＋…ＤＲＢＩ．Ａ．ｓｅｑ．．．．．Ｇ．．．．．Ａ．．．。．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．Ｔ．．．Ｇ．．．．．．．．　ＤＲＢＩ．Ｂ．ｓｅｑ．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．　１６０　１６０　ＤＲＢＩ．Ｃ．ｓｅｑ．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．Ａ．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．　１６０　ＤＲＢ１．Ｄ．ｓｅｑ…．．Ｇ…Ｃ……Ｔ．．＾．ＡＣ…………．＾Ｃ………………………．．Ｔ…Ｇ……＾．　１６０　１６０　ＤＲＢ１．Ｅ．ｓｅｑ．．．．．．．．．。．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．　Ｍａｊｏｒｉｔｙ［ｊ　ＡＧＣＴＧＧＧＧｃ囹一……一一ＧＧＡｃＧｃｃＡＡＧＴＡｃＴＧＧＡＡｃＡＧｃｃＡＧＡＡＧＧＡＧＡＴｃｃＴＧＧＡＧｃＧＧＡＧＧｃＧＧ囫…＋………＋………＋………＋………＋………＾ＧＧＴＧＧＡＣＡＣＧＴ　＋………＋　＋……１７０　………１８０　……＋………１９０　＋………２００　＋……一２ｌ０　＋………２２０　＋一……２３０　一一＋………２４０　＋　＋…２４０　２４０　２４０　２４０　２４０　２５０　２６０　２７０　２８０　２９０　２９４　２９４　２９４　２９４　２９４　图中与顶部序列相同的序列用原点表示；大方框标出的区域是多态区域；Ｈａｅ　ｎｌ的酶切位点用小方框标出　Ｔｈｅ　ｌｅｔｔｅｒｓ　ｍａｒｋｅｄ　ｂｙ　ｌａｒｇｅ　ｂｏｘ　ｒｅｆｅｒ　ｔｏ　ｔｈｅ　ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｃ　ｒｅｇｉｏｎｓ｝Ｔｈｅ　Ｈａｅ　Ｉｌｌ　ｄｉｇｅｓｔｉｏｎ　ｌｏｃｉ　ａｒｅ　ｉｎｄｉｃａｔｅｄ　ｂｙ　ｓｍａｌｌ　ｂｏｘ　图４　洼地绵羊ＭＨＣ－ＤＲＢ１外显子２等位基因核苷酸序列比对结果　Ｆｉｇ．４　Ａｎ　ａｌｉｇｎｍｅｎｔ　ｏｆ　ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ　ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ　ａｍｏｎｇ　ｔｈｅ　ａｌｌｅｌｅｓ　ｏｆ　ＭＨＣ—ＤＲＢ１　ｅｘｏｎ　２　ｏｆ　Ｗａｄｉ　ｓｈｅｅｐ　ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎｓ．　肖　娜等：洼地绵羊ＭＨＣ－ＤＲＢ１基因ＰＣＲ—ＲＦＬＰ多态性分析　６７　腿胩胩　腿　一一一一一一一一一Ａ　Ｂ　Ｃ　Ｄ　Ｅ　＋一一一一一一一一一＋一一一一一一一一一＋一一一一一一一一一＋一一一一一一一一一十一一一一一一一一一＋一一一一一一一一一｝　吣啪啪啪吣　肚叭舭叭　Ａ　Ｂ　Ｃ　Ｄ　Ｅ　１０　一一２０　３０　４０　５０　６０　７０　８０　一一一一一一一＋一一一一一一一一一十一一一一一一一一一＋一一一一一一一一一＋一一一一一一一一一＋一一一一一一一一一＋一一一一一一一一一＋　０　Ｏ　０　０　Ｏ　邮　哪啪　．　．８Ｏ　８０　８０　．　Ｃ　．　８Ｏ　８０　．　．　．睡　．　唧ＳＧＧＧＰＲ１ｒｒｌ　一　～　一　９８　９８　９８　９８　９８　图中与顶部序列相同的序列用原点表示；大方框标出的区域是多态区域　Ｔｈｅ　ｌｅｔｔｅｒｓ　ｍａｒｋｅｄ　ｂｙ　ｌａｒｇｅ　ｂｏｘ　ｒｅｆｅｒ　ｔｏ　ｔｈｅ　ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｅ　ｒｅｇｉｏｎｓ　图５　洼地绵羊ＭＨＣ－ＤＲＢ１外显子２等位基因氮基酸序列比对结果　Ｆｉｇ．５　Ａｎ　ａｌｉｇｎｍｅｎｔ　ｏｆ　ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ　ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ　ａｍｏｎｇ　ｔｈｅ　ａｌｌｅｌｅｓ　ｏｆ　ＭＨＣ—ＤＲＢ１　ｅｘｏｎ　２　ｏｆ　Ｗａｄｉ　ｓｈｅｅｐ　３讨论　通过ＲＦＬＰ—ＰＣＲ技术及序列测序分析了ＤＲＢ１　基因外显子２存在高度多态性。序列测序发现了多　用，同义突变不造成氨基酸顺序的任何变化，因而，　同义突变被当作选择上呈中性突变的侯选者。本研　究计算了ｄｎ／ｄｓ，远高于１。这说明非同义位点的进　化速度要高于同义位点，这一特点也可能使得新的　基因变异产生和多态性增加，也为ＭＨＣ基因适应　同样不断变化的抗原创造了条件［１　。　参考文献：　Ｅ１］Ｋｌｅｉｎ　Ｊ．Ｎａｔｕｒａｌ　ｈｉｓｔｏｒｙ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｍａｊｏｒ　ｈｉｓｔｏｃｏｍｐａｔｉｈｉｌｉｔｙ　ｃｏｍｐｌｅｘ　［Ｍ］．Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ：Ｊｏｈｎ　Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，１９８６。　［２３　Ｌｉ　Ｍ　Ｈ，Ｌｉ　Ｋ，Ｋａｎｔａｎｅｎ　Ｊ，ｅｔ　ａ１．Ａｌｌｅｌｉｅ　ｖａｒｉａｔｉｏｎｓ　ｉｎ　ｅｘｏｎ　２　ｏｆ　ｅａｐｒｉｎｅ　ＭＨＣ　ｃｌａｓｓ　ｌＩ　ＤＲＢ３　ｇｅｎｅ　ｉｎ　Ｃｈｉｎｅｓｅ　ｉｎｄｉｇｅｎｏｕｓ　ｇｏａｔｓ　种等位基因，等位基因序列比对分析存在丰富的碱　基以及氨基酸替代［１¨。基因座位上基因的多态性使　得基因产物的多样性增加，从而使机体能够在内或　外界抗原引起的免疫应答中发挥作用，这一现象在　Ｎｉｎｏ—Ｖａｓｑｕｅｚ　Ｊ　Ｊ等Ｌ１　］的研究中也有报道。洼地绵　羊ＭＨＣ＿ＤＲＢ１基因外显子２等位基因及基因型Ｙ。　适合性检验结果说明，在Ｓａｃ　Ｉ和Ｈａｅ　Ｉｌｌ的酶切位　点未达到ＨａｒｄｙＷｅｉｎｂｅｒｙ（Ｐ＜０．０５）平衡状态。酶　［Ｊ］．Ｓｍａｌｌ　Ｒｕｍｉｎａｎｔ　Ｒｅｓ，２００６，６６：２３６—２４３．　［３］Ｚｈａｏ　Ｔ　Ｍ．Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅ　ａｎｄ　ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ　ｏｆ　ＨＬＡ　ｔｙｐｉｎｇ［Ｍ］．Ｓｈａｎｇ—　ｈａｉ：Ｓｈａｎｇｈａｉ　Ｓｃｉｅｎｃｅ　ａｎｄ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　Ｐｒｅｓｓ，１９８４．　切位点的非平衡状态可能是由于基础群体的选择以　及研究所选择的绵羊群体中个体数目较少的原因。　也可能是由于长期进化过程中一些控制重要生产性　状的基因发生了遗传漂移或遗传选择的原因。　［４］Ｇａｒｒｉｇａｎ　Ｄ，Ｈｅｄｒｉｃｋ　Ｐ　Ｗ．ＣｌａｓｓＩ　ＭＨＣ　ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ　ａｎｄ　ｅｖｏ—　ｌｕｔｉｏｎ　ｉｎ　ｅｎｄａｎｇｅｒｅｄ　Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ　Ｃｈｉｎｏｏｋ　ａｎｄ　ｏｔｈｅｒ　Ｐａｃｉｆｉｃ　ｓａｌｍ—　ｏｎ［Ｊ］．Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ，２００１，５３（６）：４８３—４８９．　在本研究的洼地绵羊群体中发现的一种新的等　位基因ＤＲＢ１．Ｄ与萨福克羊群、多浪羊［１。　群体中的　ＤＲＢ１基因的等位基因不同。本文提供了一种新抗　［５］　Ｇｒｕｓｚｃｚｙｎｓｋａ　Ｊ，Ｂｒｏｋｏｗｓｋａ　Ｋ，Ｃｈａｒｏｎ　Ｋ　Ｍ，ｅｔ　ａ１．Ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ　ｆｒａｇｍｅｎｔ　ｌｅｎｇｔｈ　ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ　ｏｆ　ｅｘｏｎ　２　Ｏｖａｒ—ＤＲＢ１　ｇｅｎｅ　ｉｎ　ｐｏｌｉｓｈ　ｈｅａｔｈ　ｓｈｅｅｐａｎｄ　ｐｏｌｉｓｈ　ｌｏｗ　ｌａｎｄ　ｓｈｅｅｐ［Ｊ］．Ｊ　Ａｐｐｌ　Ｇｅｎｅｔ，　２００５，４６（３）：３１卜３１４．　病的等位基因，该种群特异性的等位基因可能是由　于自然选择的结果。但是，ＭＨＣ－ＤＲＢ１等位基因与　绵羊抗某种疾病的相关性还需要进一步研究。而本　文洼地绵羊群体ＭＨＣ－ＤＲＢ１基因中另外４种等位　［６］Ｋｏｎｎａｉ　Ｓ，Ｎａｇａｏｋａ　Ｙ，Ｎａｇａｏｋａ　Ｓ，ｅｔ　ａ１．Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ　ｎｏｔｅ：ＤＮＡ　ｔｙｐｉｎｇ　ｆｏｒ　ｏｖｉｎｅ　ＭＨＣ　ＤＲＢＩ　ｕｓｉｎｇ　ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ　ｃｈａｉｎ　ｒｅａｃｔｉｏｎ　ｆｒａｇｍｅｎｔ　ｌｅｎｇｔｈ　ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｌｓｍ（ＰＣＲ－ＲＦＬＰ）［Ｊ］．Ｊ　Ｄａｉｒｙ　Ｓｃｉ，　２００３，８６（１０）：３３６２—３３６５．　基因与萨福克羊群［２］、多浪羊［”］群体中的ＤＲＢ１基　因的等位基因是相同的，然而基因型却不尽相同，这　［７］贾　斌，申　红，余智勇，等．多浪羊和中国美利奴羊ＭＨＣ—　ＤＲＢ１基因多态性与包虫病的遗传易感性［Ｊ］．中国人兽共患病　学报，２００７，２３（１０）：１００４—１０１２．　可能是由于绵羊群体生存的微环境相同或类似，如　气候、生态环境、地理环境等因素，而这些因素可能　都会对其产生影响。　一［８］Ｌａｒｒｕｓｋａｉｎ　Ａ，Ｍｉｎｇｕｉｊ６ｎ　Ｅ，Ｇａｒｃｉａ—Ｅｔｘｅｂａｒｒｉａ　Ｋ，ａｔ　ａ１．ＭＨＣ　ｃｌａｓｓ　ＩＩ　ＤＲＢ１　ｇｅｎｅ　ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ　ｉｎ　ｔｈｅ　ｐａｔｈｏｇｅｎｅｓｉｓ　ｏｆ　Ｍａｅｄｉ—　Ｖｉｓｎａ　ａｎｄ　ｐｕｌｍｏｎａｒｙ　ａｄｅｎｏｃａｒｃｉｎｏｍａ　ｖｉｒａｌ　ｄｉｓｅａｓｅｓ　ｉｎ　ｓｈｅｅｐ　般认为，自然选择主要在蛋白质水平上起作　［Ｊ］．Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ，２０１０，６２（２）：７５—８３．　６８　动物医学进展２０１１年第３２卷第５期（总第２１５期）　ｔｙ　ｏｆ　ＤＲＢ　ｇｅｎｅｓ　ｏｆ　Ａｏｔｕｓ　ｎａｎｃｙｍａａｅ，ａ　ｐｒｉｍａｔｅ　ｍｏｄｅｌ　ｆｏｒ　ｈｕ—　［９］Ｓａｙｅｒｓ　Ｇ，Ｇｏｏｄ　Ｂ，Ｈａｎｒａｈａｎ　Ｊ　Ｐ，ｅｔ　ａ１．Ｍａｊｏｒ　ｈｉｓｔｏｃｏｍｐａｔｉｂｉｌｉｔｙ　ｃｏｍｐｌｅｘ　ＤＲＢ１　ｇｅｎｅ：ｉｔｓ　ｒｏｌｅ　ｉｎ　ｎｅｍａｔｏｄｅ　ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ　ｉｎ　Ｓｕｆｆｏｌｋ　ｍａｎ　ｍａｌａｒｉａ　ｐａｒａｓｉｔｅｓ［Ｊ］．Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｚｃｓ，２０００。５１（３）：ｚ１９—　２３０．　ａｎｄ　Ｔｅｘｅｌ　ｓｈｅｅｐ　ｂｒｅｅｄｓ［Ｊ］．Ｐａｒａｓｉｔｏｌｏｇｙ，２００５，１３１（３）；４０３—　４０９．　［１３］　彭林泽，袁其彬，郭玉强，等．多浪羊ＭＨＣ－ＤＲＢＩ基因的Ｈａｅ　Ⅲ酶切多态性［Ｊ］．石河子大学学报：自然科学版，２００７，２５　（２）：１７７－１７９．　Ｅ１０３　Ｎｅｉ　Ｍ，Ｇｏｊｏｂｏｒｉ　Ｔ．Ｓｉｍｐｌｅ　ｍｅｔｈｏｄｓ　ｆｏｒ　ｅｓｔｉｍａｔｉｎｇ　ｔｈｅ　ｎｕｍ—　ｂｅｒｓ　ｏｆ　ｓｙｎｏｎｙｍｏｕｓ　ａｎｄ　ｎｏｎｓｙｎｏｎｙｍｏｕｓ　ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ　ｓｕｂｓｔｉｔｕ—　ｔｉｏｎｓ［Ｊ］．Ｍｏｌ　Ｂｉｏｌ，１９８６，３（５）：４１８—４２６．　［１１］蒋梅，杨勇，杨仕标，等．猪ＰＬＴＰ基因的ＰＣＲ扩增及多　ｌｉｎｇａｌｌ　Ｋ　Ｔ，Ｆａｒｄｏｅ　Ｋ，ＭｃＫｅｅｖｅｒ　Ｄ　Ｊ．Ｇｅｎｏｍｉｅ　ｏｒｇａｎｉｓａｔｉｏｎ　［１４］　Ｂａｌａｎｄ　ａｌｌｅｌｉｃ　ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ　ｗｉｔｈｉｎ　ｃｏｄｉｎｇ　ａｎｄ　ｎｏｎ－ｃｏｄｉｎｇ　ｒｅｇｉｏｎｓ　ｏｆ　态性检测［Ｊ］．动物医学进展，２００９，３０（６）；５０—５３．　［１２］Ｎｉｎｏ－Ｖａｓｑｕｅｚ　Ｊ　Ｊ，Ｖｏｇｅｌ　Ｄ，Ｒｅｄｒｉｇｕｅｚ　Ｒ．Ｓｅｑｕｅｎｃｅ　ａｎｄ　ｄｉｖｅｒｓｉ一　ｔｈｅ　Ｏｖａｒ－ＤＲＢ１　ｌｏｃｕｓ［Ｊ］．Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ，２００８，６０（２）；９５—　１Ｏ３．　Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ　Ａｎａｌｙｓｉｓ　０ｆ　ＭＨＣ—ＤＲＢ　１　Ｇｅｎｅ　ｉｎ　Ｗａｄｉ　Ｓｈｅｅｐ　ｂｙ　ＰＣＲ—ＲＦＬＰ　ＸＩＡＯ　Ｎａ　，ＲＥＮ　Ｙａｎ－ｌｉｎｇ　，ＬＩ　Ｍｉｎ。，ＤＯＮＧ　Ｗｅｎ—ｙａｈ。，ＳＨＥＮ　Ｚｈｉ—ｑｉａｎｇ。’。　（１．Ｓｈａｎｄｏｎｇ　Ｂｉｎｚｈｏｕ　Ａｎｍｉｍａｌ　Ｓｃｉｅｎｃｅ＆Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ　Ｍｅｄｉｃｉｎｅ　Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，Ｂｉｎｚｈｏｕ，Ｓｈａｎｄｏｎｇ，２５６６００，Ｃｈｉｎａ；　２．Ｒｅｓｅａｒｃｈ　ａｎｄ　Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ　Ｃｅｎｔｅｒ　ｏｆ　Ｗａｄｉ　Ｓｈｅｅｐ　Ｂｒｅｅｄｉｎｇ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｂｉｎｚｈｏｕ，Ｓｈａｎｄｏｎｇ，２５６６００，Ｃｈｉｎａ；　３．Ｓｈａｎｄｏｎｇ　Ｌｖｄｕ　Ｂ　０ｆＰｃ　ｎｏＺ０ｇｙ　Ｌｆ　．，Ｂｉｎｚｈｏｕ，Ｓｈａｎｄｏｎｇ，２５６６００，Ｃｈｉｎａ）　Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｔｏ　ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅ　ｔｈｅ　ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ　ｏｆ　ｍａｊｏｒ　ｈｉｓｔｏｅｏｍｐａｔｉｂｉｌｉｔｙ　ｃｏｍｐｌｅｘⅡＤＲＢ１（ＭＨＣ－ＤＲＢ１）ｉｎ　Ｗａｄｉ　ｓｈｅｅｐ，ｔｈｅ　ｓｅｃｏｎｄ　ｅｘｏｎ　ｏｆ　ｔｈｉｓ　ｇｅｎｅ　ｉｎ　８２　Ｗａｄｉ　Ｓｈｅｅｐ　ｗａｓ　ａｍｐｌｉｆｉｅｄ　ｂｙ　ｎｅｓｔｅｄ　ＰＣＲ　ａｎｄ　ｔｈｅ　ａｍｐｌｉｆｉｅｄ　ｐｒｏｄｕｃｔｓ　ｗｅｒｅ　ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚｅｄ　ｂｙ　ＲＦＬＰ　ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ　ｕｓｉｎｇ　２　ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ　ｅｎｚｙｍｅｓ，ｉｅ，Ｓａｃ　Ｉ　ａｎｄＨａｅ　ＩＩ．Ｔｈｅ　ｒｅ—　ｓｕｉｔｓ　ｓｈｏｗｅｄ　ｔｈａｔ　ｔｈｅ　ｅｘｔｅｎｓｉｖｅ　ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍｓ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｅｘｏｎ２　ｏｆ　ＭＨＣ＿ＤＲＢ１　ｗｅｒｅ　ｆｏｕｎｄ　ａｔ　ｔｗｏ　ＪＯＣｉ　ｄｉｇｅｓｔｅｄ　ｗｉｔｈ　Ｓａｃ　Ｉ　ａｎｄＨａｅⅢ，ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ，ａｎｄ　ｔｈｅｓｅ　ｓｉｔｅｓ　ｗｅｒｅ　ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ　ｂｙ　ｔｗｏ，ｆｉｖｅ　ａｌｌｅｌｅｓ，ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ．Ａｓ　ｓｏｍｅ　ｂａｓｅ　ｍｕｔａｔｉｏｎｓ　ｗｅｒｅ　ｆｏｕｎｄ　ｉｎ　ＭＨＣ＿ＤＲＢ１　ｌＯＣＵＳ，ａｎｄ　ａｃｃｏｒｄｉｎｇ　ｔｏ　ｔｈｅ　ｒｅｓｕｌｔｓ　ｉｎ　ｔｈｉｓ　ｐａｐｅｒ，ｆｉｆｔｅｅｎ　ｇｅｎｅｔｙｐｅｓ　ｗｅｒｅ　ｆｏｕｎｄ　ｉｎ　Ｗａｄｉ　ｓｈｅｅｐ．Ｔｈｅ　ｎｅｗ　ａｌｌｅｌｅ　ＭＨＣ－ＤＲＢ１．Ｄ　ｗａｓ　ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄ　ｏｎｌｙ　ｉｎ　ｔｈｅｓｅ　Ｗａｄｉ　ｓｈｅｅｐ　ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎｓ．Ｔｈｅ　ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ　ａｎｄ　ｐｒｅｄｉｃｔｅｄ　ａｍｉｎｏ　ａｃｉｄ　ｓｅｑｕｅｎｃｅ　ａｌｉｇｎｍｅｎｔｓ　ｏｆ　ＭＨＣ—ＤＲＢ１　ａｌｌｅｌｅｓ　ｐｒｏｖｉｄｅｄ　ｔｈｅ　ｅｖｉｄｅｎｃｅ　ｆｏｒ　ｃｏｎｓｉｄｅｒａｂｌｅ　ｖａｒｉａｔｉｏｎ　ａｍｏｎｇ　ｔｈｅ　ｆｉｖｅ　ａｌｌｅｌｅｓ．　Ｋｅｙ　ｗｏｒｄｓ：Ｗａｄｉ　ｓｈｅｅｐ；ＭＨＣ－ＤＲＢ１　ｇｅｎｅ；ＰＣＲ—ＲＦＬＰ；ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ