银杏内酯B自微乳化释药系统的制备及质量评价

󰀂󰀂󰀂󰀂󰀂󰀂󰀂󰀂󰀂󰀂󰀂󰀂󰀂󰀂󰀂󰀂󰀂󰀂󰀂

Vol󰀁35,Issue󰀂22November,2010

󰀁制剂与炮制󰀁

银杏内酯B自微乳化释药系统的制备及质量评价

郭梦翔,胡海燕,唐仕波,朱晓波,王延东,李健桥,马伟

(1󰀁广州市妇女儿童医疗中心,广东广州510120;

2󰀁中山大学药学院,广东广州510080;3󰀁中山大学中山眼科中心,广东广州510060)

[摘要]󰀂目的:制备银杏内酯B自微乳化制剂,并对其质量进行评价。方法:通过高效液相󰀂电喷雾󰀂质谱(HPLC󰀂ESI󰀂MS)方法测定银杏内酯B在不同油相、表面活性剂、助表面活性剂中的溶解度,结合伪三元相图,筛选银杏内酯B自微乳化制剂的处方。考察药物含量和分散介质对制剂稳定性的影响以及经0󰀁1mol󰀁L-1HCl稀释后形成微乳的形态、粒径和成乳稳定性。结果:自微乳化介质处方为油酸乙酯󰀂(cremophorEL󰀂大豆磷脂󰀂无水乙醇,40 60),其中cremophorEL󰀂大豆磷脂󰀂无水乙醇(4 1 2),GB的载药量为2󰀁5%。乳化介质(H2O和0󰀁1mol󰀁L-1HCl)对制剂自微乳化效率影响不大。银杏内酯B自微乳制剂经0󰀁1mol󰀁L-1HCl稀释100倍后透射电镜下呈圆球形,分布均匀,粒径(41󰀁6!1󰀁11)nm,自微乳化时间大约在2min。8h内制剂稳定,粒径变化不大,无药物析出。结论:银杏内酯B自微乳化制剂制备简单,质量稳定,可以显著提高药物的溶解度。

[关键词]󰀂银杏内酯B;自微乳化;伪三元相图

1

2

3*

3

3

3

3

󰀂󰀂银杏内酯(ginkgolideB,GB)作为银杏叶提取物中的主要药效成分,具有神经元保护和抗细胞凋亡的作用,其在中枢神经系统变性性疾病和缺血缺氧

[1󰀂2]

病变中的作用已经得到公认。笔者的前期工作证实

[3󰀂4]

杏内酯B(纯度98%,南京海陵中药生产公司,批号100135󰀂200404);无水乙醇(天津诺克科技发展有限公司),辛酸/癸酸甘油三酯(法国LabrafacCc,Gat󰀂tefosse),聚氧乙烯󰀂35󰀂蓖麻油(cremophorEL,德国BASF),正油基聚氧乙烯(10)醚(Brij97,美国Sig󰀂ma),油酸乙酯(ethyloleiate,中国医药集团上海化学试剂厂),乙腈为色谱纯,氨水为分析纯。

SurveyorMSPump液相色谱输液泵和TSQQuantumMassSpectrometerSystemMS/MS系统(美国Finnigan);SurveyorAutosampler进样器;JB󰀂3型定时恒温磁力搅拌器(上海雷磁新经仪器有限公司);ZetasizerNanoZS90纳米粒度及Zeta电位分析仪(英国Malvern);透射电子显微镜(PHILIPSTEC󰀂NAI󰀂10,荷兰);超声波细胞粉碎仪(宁波新芝科器研究所)。2󰀂方法与结果

2󰀁1󰀂HPLC󰀂ESI󰀂MS测定GB含量方法学的建立2󰀁1󰀁1󰀂HPLC󰀂ESI󰀂MS分析条件󰀂PhenomenexC18柱(2󰀁1mm∀100mm,5󰀁m),AJO󰀂4287型保护柱,柱温40#;流动相乙腈󰀂0󰀁01%氨水(50 50);流速0󰀁2mL󰀁min;进样量20󰀁L。

质谱条件:电喷雾离子化方式ESI,选择离子采集(SIM)方式,干燥气为氮气,干燥气温度365#,

󰀁2967󰀁-1

,银杏内酯B对视网膜感光细胞凋亡的体

内外模型有抗凋亡作用。但是,银杏内酯B的高疏

水性和大分子量的理化特性,大大降低了其在体内的生物利用度,也了它在临床的应用,目前国内、外都没有成品药物上市。自微乳化释药系统

[5]

作为一种提高难溶性药物溶出度和生物利用度的新剂型显示出广阔的应用前景。作者以自微乳化释药系统为载备银杏内酯B的自微乳化制剂,并对其处方、质量等作出评价。

1󰀂材料

银杏内酯B对照品和内标格列本脲对照品(中国药品生物制品检定所,批号110863󰀂200406);银

[稿件编号]󰀂20100318008

[基金项目]󰀂广东省建设中医药强省专项基金项目(2008087)[通信作者]󰀂

*

唐仕波,教授,主要从事玻璃体视网膜疾病方向的研

究,Te:l(020)87330485,E󰀂mai:ltangshibo@mail󰀁sysn.edu.cn[作者简介]󰀂郭梦翔,主治医师,主要从事玻璃体视网膜疾病方向研究,Te:l(020)81330738,E󰀂mai:lgmengxiang@hahoo.com.cn

第35卷第22期2010年11月

󰀂󰀂󰀂󰀂󰀂󰀂󰀂󰀂󰀂󰀂󰀂󰀂󰀂󰀂󰀂󰀂󰀂󰀂󰀂

Vol󰀁35,Issue󰀂22November,2010

干燥气流速10L󰀁min,雾化器压力275792Pa,毛细管电压1nA,碰撞诱导解离电压70V,多离子

监控窗口,负离子方式监测。定量离子,银杏内酯B:m/z422󰀁6/366󰀁6,格列本脲:m/z492/366󰀁7。2󰀁1󰀁2󰀂方法学研究󰀂精密称取GB对照品2mg,加乙腈定容到2mL作为储备液,取储备液用流动相配

-1

制成质量浓度为50,100,500,1000,5000mg󰀁L的稀释液,置于4#保存,测定时按照9 1的比例加入1mg󰀁L的格列本脲作为内标,在上述色谱方法下进行测定,以GB对照品与内标的峰面积比计算GB的浓度,按照最小方差做线性回归,得到标准曲线方程Y=166󰀁996007X-0󰀁391480(R=

-1

0󰀁999984)。结果显示,在50~5000mg󰀁L标准曲线线性良好。方法平均回收率是100󰀁6%,日内和日间RSD分别为1󰀁5%,1󰀁8%(n=5)。2󰀁2󰀂银杏内酯B自微乳的制备

2󰀁2󰀁1󰀂GB油/水分配系数的测定󰀂用水饱和的正辛醇制备质量浓度约0󰀁1g󰀁L的GB正辛醇溶液,取该溶液10mL与等量的正辛醇饱和的水涡旋10min混合,放置在(25!5)#恒温水浴箱中,振荡24h,0󰀁45󰀁m的有机滤膜过滤后用HPLC󰀂ESI󰀂MS分别检测正辛醇和水中的GB含量,按照下列公式计算油水分配系数logP。

P=COCT/CH2O

COCT为GB在正辛醇中的浓度,CH2O为GB在水中的浓度。

结果测得GB的油/水分配系数logP为2󰀁12。logP是评价药物脂溶性的重要指标。药物本身的溶解度对于制剂的选择有重要的意义,对于中等脂溶性(2∃logP∃4)的药物,需要选择含助表面活性剂的自微乳化系统。

2󰀁2󰀁2󰀂GB在不同油相、表面活性剂和助表面活性剂中的平衡溶解度测定󰀂将过量的GB分别投入适量的油相和表面活性剂中,(37!0󰀁5)#搅拌48h后,10000r󰀁min离心10min,取上清液,经0󰀁45󰀁m有机滤膜过滤后,用流动相稀释,并且按照比例加入内标后用HPLC󰀂ESI󰀂MS测定GB的含量,见表1。结果显示,GB在各个油相中的溶解度差异不大,在各个表面活性剂中cremophorEL的溶解度最高,而在助表面活性剂中无水乙醇的溶解度最高。2󰀁2󰀁3󰀂伪三元相图的绘制󰀂以水、油以及一定比例的混合表面活性作为3个顶点,采用滴定法绘制伪󰀁2968󰀁-1

-1

2

-1

-1

表表面活性剂和助表面活性剂󰀂󰀂1󰀂GB37#时在不同油相、

中的溶解度(x !s,n=3)

溶剂

大豆油soybeanoil肉豆蔻酸异丙酯IPM

辛酸/癸酸甘油三酯lacrafacCc油酸乙酯ethyloleate

聚氧乙烯󰀂35󰀂蓖麻油cremophorEL聚氧乙烯脱水山梨醇单油酸酯正油基聚氧乙烯(10)醚Brij97无水乙醇

1,2󰀂丙二醇聚乙二醇400水

溶解度0.532!0.080.594!0.050.458!0.170.2!0.1274.45!0.0722.13!7.532.81!0.08135.94!2.42

24.82!8.0136.3!3.260.77∀10-3!0󰀁01

g󰀁L-1

三元相图,确定微乳形成区域的趋势。具体操作:将表面活性剂和助表面活性剂按照一定的质量比(Km)混合,必要时加热,使固体或半固体表面活性剂溶解,从而得到总表面活性剂(thetotalsurfactan,tStot)。精密称取一定量的总表面活性剂置入具塞

玻璃瓶,室温下加入一定量的油相,在磁力搅拌器上充分搅拌混匀,随后用微量注射器加入水相,保持磁力搅拌状态,肉眼观察,记录相变点;改变Stot和油相的比例,同上操作。分别以Stot、油相、水相为顶点,根据相变前后液体的性质绘制伪三元相图,确定微乳区,见图1。

由图1中可见,当总表面活性剂(cremphorEL󰀂大豆磷脂󰀂无水乙醇)的Km为4 1 2,获得的自微乳区域(AMR)最大,固定cremphorEL󰀂大豆磷脂(4 1),随着无水乙醇的比例增加,当Km为4 1 10时,AMR明显减小。所以作者选择Km为4 1 2的总表面活性剂作为处方。同时笔者考察了不同比例的油󰀂总表面活性剂形成微乳的能力,结果当油󰀂总表面活性剂为1 9,2 8,3 7,4 6时均可以得到透明、流动性好的体系。考虑到减少表面活性剂毒性,笔者选取油󰀂总表面活性剂比例为4 6作为空白自微乳剂的处方。

2󰀁3󰀂银杏内酯B自乳化制剂的质量评价

2󰀁3󰀁1󰀂影响自乳化效率因素的初步考察󰀂影响自乳化制剂自微乳化速率的因素通常包括:药物的含量、温度、稀释倍数、分散介质和胃肠道的脂解作用等。本实验初步考察了药物含量和分散介质的影响。

选择一个比较理想的空白微乳处方,在此基础

第35卷第22期2010年11月

󰀂󰀂󰀂󰀂󰀂󰀂󰀂󰀂󰀂󰀂󰀂󰀂󰀂󰀂󰀂󰀂󰀂󰀂󰀂

Vol󰀁35,Issue󰀂22November,2010

󰀂󰀂

ME󰀁自微乳区;E󰀁微乳区。

图1󰀂自微乳化体系的伪三元相图

上考察不同载药量和乳化介质(H2O和0󰀁1mol󰀁L

-1

HCl)对SMEDDS自乳化时间和粒径的影响,确

会在加水后4h内析出,说明药物的稳定性还不满

意。经过摸索,载药量在2.5%时自乳化效率比较好,同时药物稳定,加水后放置24h以上也不会有药物析出,所以选择最大载药量为2.5%。2󰀁3󰀁2󰀂粒径和形态的考察󰀂称取处方量的总表面活性剂,超声混合均匀,加入处方量的银杏内酯B,振荡至药物完全溶解,再与适量的油酸乙酯混匀,制备载药自微乳,肉眼观察其外观。

取制备好的GB󰀂SMEDDS适量,37#条件下用0󰀁1mol󰀁LHCl稀释100倍,取适量滴加到载有Formvar支持膜的铜网上,自然晾干。将铜网置于蜡板上,取2%磷钨酸(pH7󰀁4)1滴滴在蜡板上,将晾干的铜网倒覆于染液上,负染15min,然后用蒸馏水冲洗、吸干,上透射电镜观察。结果可见空白微乳和载药量为2󰀁5%GB󰀂SMEDDS经过稀释100倍可以形成圆形,大小均一,分布均匀的微球,两者相比差别不大,粒径均在20~50nm。

取同一样品,经激光粒度分析仪分别测量空白自微乳和载药自微乳的粒径。结果空白微乳粒径为(34󰀁7!0󰀁11)nm,PDI为0󰀁112;2󰀁5%GB󰀂SMEDDS粒径为(41󰀁6!1󰀁11)nm,PDI为0󰀁218。

GB󰀂SMEDDS自乳化后乳液的稳定性的初步考察󰀂取适量GB󰀂SMEDDS加入37#0󰀁1mol󰀁L

-1

-1

定GB的处方量,见表2。

表2󰀂药物含量和乳化介质对GB󰀂SMEDDS乳化

效率的影响( x!s,n=3)

载药量/%012

2.5

H2O29.8!0.5132.5!0.3535.4!0.44

36.9!5.32

粒径/nm

0󰀁1mol󰀁L-1HCl34.7!0.1140.1!1.00.8!0.47

41.6!1.11

研究结果发现,随着GB含量的增加,乳滴的粒径有不同程度地增加,但是乳滴的粒径仍然保持在100nm以内,而且自乳化的时间均在1min左右。这表明,GB对SMEDDS的乳化效率并不产生明显

影响。另外,GB的SMEDDS在不同的乳化介质(H2O和0.1mol󰀁L

-1

HCl)中自乳化的时间变化不

大,虽然乳滴的粒径较H2O中稍微增加,但是仍然在50nm以内。这说明笔者选择的体系中非离子表面活性剂仅受到pH变化的轻微影响。

在预实验中发现,笔者选择的空白介质的最大载药量可以达到4.5%,但是此时用蒸馏水滴定,药物会迅速析出,载药量在3%时GB󰀂SMEDDS体系也

HC,l稀释100倍,考察制剂自微乳化时间、粒径、成

󰀁2969󰀁第35卷第22期2010年11月

󰀂󰀂󰀂󰀂󰀂󰀂󰀂󰀂󰀂󰀂󰀂󰀂󰀂󰀂󰀂󰀂󰀂󰀂󰀂

Vol󰀁35,Issue󰀂22November,2010

乳后稳定性。一般情况下药物在胃肠道内的滞留时间为8~24h,故所制备的微乳应至少在8h内稳定

才能满足胃肠道内的吸收要求。目测制剂自乳化时间;分别在0,8h测定制剂的粒径,方法同前。

稳定性的测定方法:分别于0,1,2,4,8h取适量上述加0󰀁1mol󰀁LHCl制备的微乳,4000r󰀁-1

min离心15min,取适量上清液,经流动相稀释定容后,用HPLC󰀂ESI󰀂MS测定。以B=Ct/C0∀100%作为考察稳定性程度的指标。

结果加入0󰀁1mol󰀁LHCl稀释100倍后,自微乳化时间大约在2min。0h粒径为(41󰀁6!1󰀁11)nm,8h粒径为(44󰀁1!0󰀁17)nm。粒径变化不大。微乳形成后在8h内保持稳定,没有药物结晶析出,说明药物在被吸收前主要以分子状态存在于微乳中。3󰀂讨论

本实验采用HPLC󰀂ESI󰀂MS为定量检测GB的方法,具有方法的专属性。同时采用内标法,进一步提高了检测的精度。方法学验证可见,该方法的回收率、精密度都良好。总之,HPLC󰀂ESI󰀂MS联用的方法具有更加快速、稳定、精确的优点。

在SMEDDS处方中,油相的作用除了溶解药物外,更重要的是促进药物通过肠道淋巴管吸收。笔者选取了常用的几种油相,由表1可以看出,GB在各个油相中的溶解度差异不大,但是肉豆蔻酸异丙酯一般多用于外用制剂,如贴片或乳膏中,少用于口服,所以选择溶解度次高的油酸乙酯作为油相。笔者通过考察不同表面活性剂对药物的溶解度发现,GB在cremophorEL中的溶解度最大。在前期工作中发现

[6]

-1

-1

时减少表面活性剂的毒性。所以选择cremophorEL和大豆磷脂作为混合表面活性剂。

本实验的自微乳化处方所选用的均为无不良反应的辅料,所得的银杏内酯B自微乳化制剂质量稳定,显著提高了药物的溶解度。通过质量评价发现,GB󰀂SMEDDS可以形成透明的微乳。透射电镜和激光粒度仪检测可见制备的GB󰀂SMEDDS可以形成粒径分布均一的微乳。

GB制成自微乳化制剂后不仅提高了药物的溶解性,而且在体内可以自发形成O/W型的微乳,乳滴中的脂质成分使其可以通过肠道淋巴管吸收,避免了肝脏的首过效应,从而最终提高了药物的生物利用度。与普通的乳剂相比SMEDDS制备工艺比较简单,可以填充到软胶囊或硬胶囊中,同时具有易于保存、稳定、可以过滤除菌、吸收迅速和靶向给药等优势,作为口服药物患者的依从性好,所以有广阔的开发前景。

[参考文献]

[1]󰀂HosfordD,BraquetP󰀁Antagonistsofplateletactivatingfactor:

Chemistry,pharmacologyandclinicalapplications[J]󰀁ProgMedChem,1990,27(3):325󰀁

[2]󰀂黄贱英,孙建宁,徐秋萍,等󰀁银杏内酯B对缺血再灌大鼠脑

损伤抗氧化活性的实验研究[J]󰀁中成药,2006,28(2):265󰀁[3]󰀂盂晶,唐仕波,林少芬,等󰀁银杏内酯B对体外培养的大鼠视

网膜神经细胞凋亡的影响[J]󰀁中国病理生理杂志,2006,22(2):791󰀁

[4]󰀂孟晶,唐仕波,林少芬󰀁银杏内酯B对N󰀂甲基󰀂N󰀂亚硝脲诱导

的大鼠视网膜变性的保护作用[J]󰀁眼科研究,2006,24(4):340󰀁

[5]󰀂ShahNH,CarvajalMT,PatelCI,etal󰀁Self󰀂emulsifyingdrugde󰀂

liverysystems(SEDDS)withpolyglycolzedglyceridesforimpro󰀂vinginvitrodissolutionandoralabsorptionoflipophilicdrugs[J].IntJPharm,1994,6(1):15󰀁

[6]󰀂胡海燕,徐雄良,龚涛,等󰀁不同溶解性质的药物在O/W微乳

中的溶解度和体外释放特性[J].中国药学杂志,2006,41(9):678󰀁

,单独用cremophorEL作表面活性剂形成

的微乳区很小,而且形成大面积的凝胶区;cremo󰀂

phorEL和大豆磷脂混合可以降低表面活性剂的HLB值,同时cremophorEL具有亲水性,而大豆磷脂具有亲脂性,两者连用可以增加药物的两亲性,同

󰀁2970󰀁第35卷第22期2010年11月

󰀂󰀂󰀂󰀂󰀂󰀂󰀂󰀂󰀂󰀂󰀂󰀂󰀂󰀂󰀂󰀂󰀂󰀂󰀂

Vol󰀁35,Issue󰀂22November,2010

PreparationandqualityevaluationofginkgolideB󰀂loaded

selfmicroemulsifyingdrugdeliverysystem

GUOMengxiang1,HUHaiyan2*,TANGShibo3,ZHUXiaobo3,WANGYandong3,LIJianqiao3,MAWe3i(1󰀁DepartmentofOphthalmology,GuangzhouWomenandChildren%sMedicalcenter,Guangzhou510120,China;

2󰀁SchoolofPharmaceuticalSciences,SunYat󰀂senUniversity,Guangzhou510006,China;3󰀁ZhongshanOphthalmicCenter,SunYat󰀂senUniversity,Guangzhou510610,China)

[Abstract]󰀂Objective:ToprepareginkgolideB󰀂loadedselfmicroemulsifyingdrugdeliverysystem(SMEDDS)andevaluateitsquality󰀁Method:ThesolubilityofginkgolideBindifferentoi,lsurfactantandco󰀂surfactantweremeasuredbyHPLC󰀂ESI󰀂MS󰀁TheGB󰀂SMEDDSformulationwasoptimizedbytheselfemulsifyingefficiencyofvariouscombinationsofoilandmix󰀂surfactantevaluatedbyusingpseudo󰀂temaryphasediagram󰀁ThepreliminarystabilityofGB󰀂SEMEDDSwasevaluatedbythevarietyofloadingrateofGBanddispersedmedium󰀁Themorphology,theparticlesizeandtheformulationstabilitywereevaluatedafterdilutingby0󰀁1mol󰀁L-1HCl󰀁Result:Theblankselfmicroemulsifiedsystemwascomposedofethyloleate󰀂(cremophorEL󰀂lecithin󰀂ethano,l4 1 2)(40 60),theloadingdosagewas2󰀁5%󰀁LittleinfluenceofGBandemulsifiedmediumwasobservedonthestabilityofGB󰀂SEMDDS󰀁Afterdilutedwith0󰀁1mol󰀁L-1HC,lthemorphologyofthemicroemulsionwashomogeneoussmallsphericaldropsobservedunderelectro󰀂micro󰀂scope󰀁Theparticlesizewas(41󰀁6!1󰀁11)nm,theselfmicroemulsifingtimewasaround2min󰀁Theformulationwasstablewithin8h,withoutsignificantchangesinparticlesizeandseparationofdrugs󰀁Conclusion:GB󰀂SMEDDSiseasytoprepareanditsqualityisstable󰀁ThesolubilityofGBwassignificantlyimprovedbySMEDDS󰀁

[Keywords]󰀂ginkgolideB;self󰀂emulsified;pseudo󰀂temaryphasediagram

do:i10.4268/cjcmm20102207

[责任编辑󰀂周驰]

󰀁2971󰀁