壮观链霉菌CCTCC M2017417次级代谢产物抗肿瘤活性的初步研究

壮观链霉菌 CCTCC M2017417 次级代谢产物抗肿瘤活性的初步研究

叶娟1，吴杰2，王德龙3，刘源振3，徐春梅1,*，薛承斌1，孙宇辉3

(1 华中科技大学医院药剂科， 湖北 武汉 430074;

2 武汉大学人民医院药学部， 湖北 武汉 430060; 3 武汉大学药学院， 武汉 430071)

摘要：目的 研究壮观链霉菌CCTCC M2017417 次级代谢产物对乳腺癌细胞MCF7和胃腺癌细胞MCG803增殖抑制作用。方法 应用四甲基偶氮唑比色法( MTT) 测定壮观链霉菌CCTCC M2017417 次级代谢产物乙酸乙酯部位、氯仿部位以及环己烷部位、对乳腺癌细胞MCF7和胃腺癌细胞MCG803增殖抑制作用；对活性最强的氯仿部位采用硅胶柱色谱、半制备色谱等方法进行分离纯化，得化合物1；通过MS和NMR等波谱方法对化合物1结构进行鉴定；应用四甲基偶氮唑比色法( MTT) 测定测定化合物1对乳腺癌细胞MCF7和胃腺癌细胞MCG803增殖抑制作用。结果 化合物1鉴定为曲张链菌素C (Streptovaricin C)，其对对乳腺癌细胞MCF7和胃腺癌细胞MCG803 IC50分别为14μmol/L和0.001μmol/L。结论 壮观链霉菌CCTCC M2017417 次级代谢产物具有较强的抗肿瘤作用。

关键词：壮观链霉菌；次级代谢产物；曲张链菌素；抗肿瘤活性

中图分类号：R978.1 文献标志码：A 文章编号：1001-8751(2019)05-0474-05

Preliminary Study on Antitumor Activity of Secondary Metabolite Produced by

Streptomyces spectabilis CCTCC M2017417

Ye Juan1, Wu Jie2, Wang De-long3, Liu Yuan-zhen3, Xu Chun-mei1, Xue Cheng-bin1, Sun Yu-hui3

(1 Department of Pharmacy，Hospital of Huazhong University of Science and Technology, Wuhan 430074;

2 Department of Pharmacy, Renmin Hospital of Wuhan University, Wuhan 430060; 3 Wuhan University School of Pharmaceutical Sciences, Wuhan 430071)

Abstract: Objective Study on inhibitory effect of secondary metabolite produced by Streptomyces spectabilis CCTCC M2017417 on the proliferation of breast cancer cellline MCF7 and gastric adenocarcinoma cell line MCG803. Methods The inhibitory effects of ethyl acetate extract, chloroform extract, and cyclohexane extract of secondary metabolite produced by Streptomyces spectabilis CCTCC M2017417 on the proliferation of breast cancer cell line MCF7 and gastric adenocarcinoma cell line MCG803 were determined by MTT method. Compound 1 was isolated and purified by column chromatography on Silica gel and semi-preparation chromatography from chloroform extract which showed the best inhibitory effect . The structures of compound 1 was identified by NMR and MS. The inhibitory effects of compound 1 on the proliferation of breast cancer cell line MCF7 and gastric adenocarcinoma cell line MCG803 were determined by MTT method. Results Compound 1 was identified as Streptovaricin C. The IC50 values of compound 1 on MCF7 cells and MCG803 cells was 14μmol/L and 0.001μmol/L. Conclusion The secondary metabolite produced by Streptomyces spectabilis CCTCC M2017417 showed strong antitumor activity.

Keywords: Streptomyces spectabilis；secondary metabolite；streptovaricin；antitumor activity

收稿日期：2019-06-08

基金项目：湖北省卫生计生委面上项目 (No.WJ2017M0)。作者简介：叶娟，硕士，主管药师，研究方向：生物制药工程。*通信作者: 徐春梅，主管药师，研究方向：药理学。

国外医药抗生素分册 2019年9月第40卷第5期到目前为止，有三分之二微生物的活性天然药物来源于放线菌，其中链霉菌属种就生产了约7600 种天然药物，约占所有放线菌的74 %，包括临床使用的多种抗生素和抗肿瘤药物，发挥着重要的临床作用[1]。微生物来源的次生代谢产物是一类结构多样，活性显著的天然化合物，是作为筛选和发现抗肿瘤药物的天然来源之一，是开发研究抗肿瘤新药的研究热点。蒋忠科等对具有血管内皮细胞生长因子受体-2胞内酪氨酸激酶(VEGFR2—CD)抑制活性的链霉菌106A-0330次生代谢产物进行分离纯化，得到两个二酮哌嗪类化合物，均对VEGFR2—CD有一定的抑制活性[2] 。谢春兰等从海洋放线菌Nocardiopsis sp. SCSIO 11492次级代谢产物抗肿瘤活性研究，其中化合物1-棕榈酰-3-β-D-半乳糖甘油酯(5)对小鼠白血病细胞RAW2.7 IC50为10.9 μmol/L[3]。关永强等采用一株菌多种次级代谢产物方法，通过对Streptomyces roseofulvus M63 采用4种发酵方式获得其次级代谢产物，肿瘤活性研究表明化合物5-(2-甲基苯基)-4-戊烯酸对子宫颈癌细胞(HeLa)、卵巢癌细胞( SKOV3)在24 h时IC50分别为38.26 μmol/L和14.25 μmol/L；(5-羟基-2-氧代-2H-吡喃-4-基) 乙酸甲酯 对子宫颈癌细胞(HeLa) 、卵巢癌细胞(SKOV3)在72h时IC50分别为6.524 μmol/L和5.671 μmol/L[4]。

本文对壮观链霉菌 CCTCC M2017417 次级代谢产物进行了抗肿瘤活性的初步研究。1 仪器与材料1.1 仪器

超净工作台(苏州空气净化技术有限公司)；2424-2型二氧化碳培养箱(波兰Shel-Lab公司)；IX51倒置荧光显微镜(日本Olympus 株式会社)；Model 680型酶标仪(美国BIO-RAD公司)；Bs210s型电子天平(德国 Sartorius 公司)；2-5型及3-18K型离心机(美国Sigma公司)；可调式微量加样、8通道可调式微量加样(美国Gilson公司)；96孔细胞培养板(美国Corning Incorporated公司)；超低温冰箱(中国Haier公司)；电热恒温干燥箱(德国memmert (美而特) 公司)；Agilent 6210 LC/MSD TOF 质谱仪；BRUKER AV-400型核磁共振仪；分析型与半制备型高效液相色谱仪Agilent 1200色谱仪(四元泵、紫外检测器及配套色谱工作站)。1.2 药品与试剂

RPMI 10, F12基础培养基(美国Gibco 公司)；

. 475 .

胎牛血清(美国Gibco公司)；胰蛋白酶(美国Gibco公司)；链霉素、青霉素(美国Gibco公司)；PBS缓冲盐粉末(美国Gibco公司)；四甲基偶氮唑盐(MTT，噻唑蓝)(美国Sigma 公司)；二甲基亚砜(DMSO))(美国Sigma 公司)；柱层析用硅胶 100-200目、200-300目，300-400目(青岛海洋化工厂)；硅胶GF2薄层预制板(烟台化学工业研究所)；Sephadex LH-20(Amersham Biosciences公司)；氘代试剂(美国CIL公司)；色谱纯甲醇、色谱乙腈(迪科马公司)；水为HPLC级蒸馏水；其他试剂为分析纯试剂。1.3 细菌与细胞

壮观链霉菌(Streptomyces spectabilis)CCTCC M2017417从武汉大学土壤中分离筛选出。通过16S rRNA 基因测序表明其与 Streptomyces spectabilis NBRC13424T存在99.4 % 相似度[5]。

MCF7人乳腺癌细胞株，MCG803人胃腺癌细胞株由湖北中医药大学药学院提供。2 方法

2.1 Streptomyces spectabilis CCTCC M2017417细菌培养、次生代谢产物的提取分离

SFM培养基： 33 g黄豆饼粉溶于1000 mL自来水中，煮沸3 h，过滤后取上清液，分别加入甘露醇 20 g和琼脂 20 g，用蒸馏水定容至1000 mL后分装，于115 ℃灭菌30 min。

将Streptomyces spectabilis CCTCC M2017417细菌接种在SFM培养皿中，在28 ℃培养箱中培养7 d，收集大约50个培养皿的培养基，分别用环己烷，氯仿，乙酸乙酯提取次生代谢产物，并进行抗肿瘤活性评价。取活性最强的氯仿部位4.42 g，经硅胶柱层析，环己烷-乙酸乙酯梯度洗脱，半制备液相(乙腈：水=40:100)分离得到化合物1。2.2 实验样品溶液的配制

精确称取环己烷部位、氯仿部位、乙酸乙酯部位，加入 DMSO溶解，摇匀，配成浓度50 mg/mL的样品溶液；精确称取化合物1，加入 DMSO溶解，摇匀，配成浓度50 mmol/L的样品溶液，临用时用缓冲液稀释备用。

2.3 乳腺癌细胞与胃腺癌细胞增殖抑制实验2.3.1 主要试剂配制

RPMI 10基础培养基临用前加10 %的胎牛血清，100 U/mL的青霉素和链霉素。

四甲基偶氮唑盐(MTT，噻唑蓝)溶液配制使用 . 476 .World Notes on Antibiotics, 2019, Vol.40, No.5

PBS配制成5 mg/mL 的溶液，用0.22 μm的微孔滤膜除菌，分装，4 ℃避光保存，两周内有效。2.3.2 细胞培养

MCF7人乳腺癌细胞株，MCG803人胃腺癌细胞株(用含体积分数10 %的胎牛血清，100 U/mL的青霉素和链霉素的RPMI 10培养液培养)。

2.3.3 MCF7人乳腺癌细胞株、MCG803人胃腺癌细胞株增殖抑制实验

采用MTT(噻唑蓝)法分析环己烷部位、氯仿部位、乙酸乙酯部位和化合物1的体外抗乳腺癌和胃腺癌活性。实验步骤如下：

分别取对数生长期的细胞株，胰酶消化，计数，将细胞悬液稀释成每毫升3~5×104个细胞，接种入96孔板中，135 μL每孔。

分别加入不同浓度样品溶液15 μL；对照组加入含等量DMSO的PBS溶液。每组设3个平行孔，置于5 % CO2，37 ℃饱和湿度的培养箱中培养72 h。实验中止前4 h每孔加入5 mg/mL MTT液20 μL，继续培养4 h。小心弃去培养液上清液，每孔加入150 μL DMSO，振荡，使结晶溶解。

在酶联检测器上检测570 nm波长下每孔的OD值，取每三孔OD值均数，按下面的公式求出生长抑制率。结果用SPSS 17.0软件处理，求出半数抑制浓度IC50。

肿瘤细胞生长抑制率%=(OD 对照-OD 样品)/OD 对照×100%2.4 统计学方法

应用SPSS 17.0统计学软件进行处理，计量资料以均数±标准差(`c±s)表示，P<0.05表示差异具有统计学意义。3 实验结果

3.1 化合物1结构鉴定

黄色粉末，HR-ESI-MS m/z：770.3359

10090807060

[M+H]+；1H-NMR(400 MHz，DMSO-d6)：δ14.2 (1H，S)、9.32 (1H，S)、7.17 (1H，d，J=8 Hz)、6.28 (1H，t，J=8 Hz)、6.09 (1H，d，J=4 Hz)、5.65 (1H，S)、5.53 (1H，t，J=8 Hz)、5.24 (1H，d，J=4 Hz)、4.98 (1H，d，J=4 Hz)、4.86 (1H，d，J=8 Hz)、4.48 (1H，S)、4.35 (1H，d，J=4 Hz)、3.96 (1H，t，J=4，8 Hz)、3.75 (1H，d，J=4 Hz)、3.69 (1H，m)、3.62 (1H，dd，J=4，0.8 Hz)、3.53 (3H，S)、3.26 (1H，dd，J=4，4 Hz)、3.07 (1H，m)、2.93 (1H，dd，J=8，4 Hz)、2.27 (3H，S)、2.23 (3H，d，J=0.8 Hz)、1.87 (3H，d，J=4 Hz)、1.86 (3H，S)、1.85(3H，S)、1.79 (1H，dd，J=4，4 Hz)、1.62 (1H，t，J=4 Hz)、1.18 (3H，d，J=4 Hz)、1.18 (3H，S)、0.71 (3H，d，J=4 Hz)、-0.11 (3H，d，J=8 Hz)；13

C-NMR (100 MHz，DMSO-d6)：δ187.0、172.8、170.9、170.1、168.6、160.0、1.2、145.2、143.6、136.4、135.5、131.5、130.0、129.8、123.6、123.5、123.4、112.8、105.5、100.1、.9、81.4、76.2、75.2、74.2、69.8、53.1、51.0、38.1、37.4、33.6、29.2、21.7、21.2、18.3、14.6、13.2、13.0、10.2、7.7。与文献[6]报道一致，化合物1为曲张链菌素C (Streptovaricin C)，结构见图1，MS、NMR图谱见图2、3、4。

3.2 Streptomyces spectabilis CCTCC M2017417 次级代谢产物抗肿瘤活性

Streptomyces spectabilis CCTCC M2017417 次级

HNHOOHH3COCOCOOCH3OCOCH3OHOHOOOHOOH图1 化合物1的结构

770.3359

Relative Abundance504030

149.022820

245.1278

792.317910340.25853.3423

610.1827684.20122.27591041.1880190.9811

0100200300400500600700800100011009001200

279.1582

图2 化合物1 HR-ESI-MS 图谱

16

15

14.2314

国外医药抗生素分册 2019年9月第40卷第5期

210200190

187.5713

12

11

10

9.399

172.46170.52169.73168.53160.01153.83149.93144.99144.86143.24135.49135.15130.99129.48123.25123.118112.4976f1(ppm)105.1199.74.575.8574.5972.52463.09352.7151.012

3.083.161.376.223.221.07180170160150140130120110

7.207.17图3 化合物1 1H-NMR 图谱

100

1.181.061.101.211.091.091.071.271.171.351.231.101.323.711.131.3290

137.8336.7430.7528.8.269.663.8080

020.9517.9012.599.887.333.156.346.316.286.126.115.565.515.2.8870

-1

0100-100250020003000

60

图4 化合物1 13C-NMR 图谱

500200300400600

504030

4.394.003.863.723.663.2.972.942.942.292.252.081.881.861.211.071.030.740.730.080.0920100

9008001100100070012001300140015001600

-10

1000

1500

0

500

. 477 .

. 478 .代谢产物对乳腺癌细胞MCF7，胃腺癌细胞MCG803的IC50见表1。4 讨论

研究表明曲张链菌素类化合物具有抗白血病作用，其作用机制是阻断DNA聚合酶与病毒模板RNA

表1 Streptomyces spectabilis CCTCC M2017417 次级代谢产 物IC50 (72 h，n=3)

样品

MCF7MCG803次生代谢产物乙酸乙酯部位2.702±0.35>50次生代谢产物氯仿部位1.682±0.24>50次生代谢产物环己烷部位5.36±0.56>50

化合物1

14±2.67

0.001±0.0002

注 ：单体的单位是μmol/L，粗提物的单位是μg/mL。

结合而抑制病毒的反转录。曲张链菌素C衍生物抗白血病活性比曲张链菌素C强2~10倍，且毒性低[7]。Kramarsky等[8]研究表明曲张链菌素对小鼠乳腺肿瘤的生长和新发肿瘤均有明显的抑制作用。胡海峰[9]等从链霉菌SIPI 97~84的次级代谢产物中分离得到化合物曲张链菌素C (Streptovaricin C)和曲张链菌素G (Streptovaricin G)，其中曲张链菌素C (Streptovaricin C)具有中度强度的免疫抑制活性。Liu等对细胞色素P450基因参与Streptovaricin类化合物生物合成功能进行了分析，且Streptovaricin类化合物及衍生物具有抗耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)生物活性[5]。曲张链菌素类化合物毒性较大，其使用[7,10]，当日剂量大于100 mg时，小鼠死亡率即大于20 %[11]。

本文对壮观链霉菌 CCTCC M2017417 次级代谢产物的乙酸乙酯部位、氯仿部位、环己烷部位分别进行抗MCF7人乳腺癌细胞株和MCG803人胃腺癌细胞株活性筛选，其氯仿部位对MCF7人乳腺癌细胞株抑制活性最强，因此对次级代谢产物的氯仿部位进行化合物的分离，得到化合物1，经鉴定为曲张链菌素C (Streptovaricin C)，属于安莎类抗生素[7]。化合物1对MCF7人乳腺癌细胞株和MCG803人胃腺癌细胞株IC50分别为14 μmol/L和0.001 μmol/L，具有较强的抗肿瘤活性。本文首次报道曲张链菌素C对胃癌的

World Notes on Antibiotics, 2019, Vol.40, No.5

抗肿瘤活性，且活性极强，其作用机制有待进一步研究。

参 考 文 献

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