SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR法测定中华绒螯蟹基因组大小

江苏农业科学２００７年第５期　ＳＹＢＲ　Ｇｒｅｅｎ　Ｉ实时荧光定量ＰＣＲ法测定　中华绒螯蟹基因组大小　朱泽远　一，杨　杰　，施用晖　，乐国伟　（１，江南大学食品科学院／教育部食品科学与工程国家重点实验室，江苏无锡２１４１２２；２．江苏省农业科学院畜牧研究所，江苏南京２１００１４）　摘要：基于ＢＩＯ—ＲＡＤ　ｉＣｙｃｌｅｒ　，利用ＳＹＢＲ　Ｇｒｅｅｎ　Ｉ染料能特异与双链ＤＮＡ结合而发荧光的特性，以已经　测序的水稻样品（Ｎｉｐｐｏｎｂａｒｅ）为对照，建立一种实时ＰＣＲ方法定量检测中华绒螯蟹基因组大小。整个过程约　１２０　ｒａｉｎ，ＰＣＲ效率为９７．８％，标准曲线为　：一３．７６８ｘ＋４４．５６８，标准曲线的相关系数（Ｒ　）为０．９９２。结果表明，　中华绒螯蟹的基因组大小为１．７２±０．２５　Ｐｇ。研究不仅首次报道了中华绒螯蟹的ｃ值，还表明基于ＳＹＢＲ　Ｇｒｅｅｎ　Ｉ的定量ＰＣＲ方法可为基因组大小的定量检测提供了一种特异、快速和简便的方法。　关键词：中华绒螯蟹；Ｃ值；实时荧光定量ＰＣＲ　中图分类号：￥９６６．１６　文献标识码：Ａ　文章编号：１００２—１３０２｛２００７）０５—０１６４—０３　中华绒螯蟹（Ｅｒｉｏｃｈｅｉｒ　ｓｉｎｅｎｓｉｓ）自然分布于我国　结果可靠　。实时ＰＣＲ，又叫Ｑ—ＰＣＲ（Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ　ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ　ｃｈａｉｎ　ｒｅａｃｔｉｏｎ），它不仅能检测特异产物　的沿海及内陆十多个省市，其蛋白质含量高、肉味鲜　美，经济价值极高，是我国名贵水产品种。我国河蟹　年产量已猛增到４０多万ｔ，年产值超过２００亿元。　当前存在的主要问题是中华绒螯蟹相关研究较薄　弱，还处于起步阶段，如品种鉴定困难，品种混杂、退　化十分严重　。迄今，尚未见中华绒螯蟹基因组大　小的研究报道。　是否合成，还能检测其生成量（拷贝数），现已逐渐　成为实验室的有力工具。迄今，未见运用实时ＰＣＲ　测定未知生物基因组大小的研究报道。　本研究以已经测序的水稻样品为参照，运用实　时ＰＣＲ测定中华绒螯蟹的基因组大小，检测这一方　法的可靠性和通用性，为中华绒螯蟹生物鉴定和分　类提供实验依据。　１材料和方法　１．１样品来源　基因组大小指单倍体中ＤＮＡ含量，也叫Ｃ值或　Ｔ值。基因组大小是生物的基本特征，在物种分类、　鉴定和进化等方面有重要意义。基因组大小的测定　方法主要是孚尔根一显微分光光度计法和流式细胞　术法。孚尔根一细胞显微分光光度计法是早期常使　用的方法，但测定结果变异较大　。流式细胞术法　不仅需要专用流式细胞仪，还存在其他不足之处，如　目前国际上还没有一个统一的测量ＤＮＡ含量的标　中华绒螯蟹来自江苏省宜兴市和桥镇人工养殖　场。水稻样品（籼稻Ｎｉｐｐｏｎｂａｒｅ）由新加坡Ｔｅｍａｓｅｋ　Ｌｉｆｅｓｃｉｅｎｃｅｓ实验室顾克宇博士馈赠。　１．２　ＤＮＡ分离　准参照物，要进行ＤＮＡ绝对含量测定，采用不同内　标时结果存在误差；此外，流式细胞术法采用不同的　核荧光染料所检测出的结果也有明显的差异　。　采集中华绒螯蟹大腿肌肉组织，其基因组ＤＮＡ　采用酚一氯仿法分离，包括用ＲＮＡ酶（Ｑｉａｇｅｎ，美　国）降解ＲＮＡ（３７℃ＲＮＡ酶处理２００　样品ｌ０　ｍｉｎ）。水稻样品的部位为叶，提取的ＤＮＡ通过琼脂　Ｗｉｌｈｅｌｍ等首次运用实时ＰＣＲ（Ｒｅａｌ—ｔｉｍｅ　ＰＣＲ）方法测定已知基因组大小的酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙ－　糖胶电泳后溴乙锭处理，紫外光下显色，确定其基因　组未降解。运用ＮＤ一１００（Ｄｒｏｐ，美国）测定所有样品　的浓度和纯度。纯度的指标为ＯＤ　印　与ＯＤ：∞　之　比值，可接受的范围是在１．８～１．９之间。每一样品　ｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、花斑剑尾鱼（Ｘｉｐｈｏｐｈｏｒｕｓ　ｍａｃｕｌａｔｅｓ）　和人的基因组大小，结果表明这一方法快速、准确，　收稿日期：２００７～０７—０５　基金项目：国家自然科学基金项目（编号：３０５７１３４７）。　作者简介：朱泽远（１９７ｌ一），男，四川自贡人，博士研究生，副研究　的浓度测定两次，记录小数点后一位，即０．１　ｎｇ／Ｉｘｌ。　１．３引物与模板　员，主要从事分子遗传学研究。Ｅ—ｍａｉｌ：ｚｅｙｕａｎｚｈｕ＠ｙａｈｏｏ．ｃｏｒｎ．　扩增中华绒螯蟹引物的位点为中华绒螯蟹微卫　星ＥＳ１７（ＧｅｎＢａｎｋ号码为：ＤＱ１１４４８０），在已报道的　维普资讯 http://www.cqvip.com

朱泽远等：ＳＹＢＲ　Ｇｒｅｅｎ　Ｉ实时荧光定量ＰＣＲ法测定中华绒螯蟹基因组大小　一１６５—　３２个中华绒螯蟹个体中均为单拷贝位点　。引物　上游序歹０为５’一ＡＡＣＴＡＴＴＣＣＴＣＴＴＣＡＡＧＧＡＡＧＡ一　３’，下游序歹０为５’一ＧｃＧＧＴＴＧＴＴＡＡＡＧｃｃＡＧＡＡＴ　３’，所扩增的特异序列不在微卫星重复区问，其　ＰＣＲ产物长度为３３７　ｂｐ。ＰＣＲ仪器为ＰＴＣ一１００　（ＭＪ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ），反应体系总体积为２５　ｌ，其中模版　ＤＮＡ约５０　ｎｇ，１　Ｉｘｌ引物，２．５　ｌ　１０倍缓冲液ｌ　５０　ｅｒｔｏｏＬ／Ｌ　ＫＣ１、１０　ｒｅｏｔｏＬ／Ｌ　Ｔｒｉｓ　ＨＣ１（ｐＨ值８．８）、１．５　ｍｍｏｌ／Ｌ　ＭｇＣ１２和０．１％吐温１００　ｌ，０．５　ｌ　ｄＮＴＰ，０．５　Ｉｘｌ　Ｔａｑ，以双蒸水补足总反应体积。ＰＣＲ反应程序　为９４℃预变性２　ｒａｉｎ，然后９４℃３０　Ｓ、５５℃３０　Ｓ、　７２　ｑＣ　３０　Ｓ，共３５个循环，最后７２　ｑＣ延伸５　ｍｉｎ，４　ｑＣ　保温。水稻的模版序列位为ＫＡＳＩＩ基因（ｂｅｔａ—　ｋｅｔｏａｃｙｌ—ＡＣＰ　ｓｙｎｔｈａｓｅ　ＩＩ）。　１．４标准物的制备　中华绒螯蟹和水稻的ＰＣＲ产物连接到载体　ＰＣＲ２．１　ＴＯＰＯ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，美国），挑选白色克隆，经　∞册∞∞∞∞∞∞∞∞∞ｏ∞　０９　８　７　６　５　４　３２　克隆ＰＣＲ和测序确定阳性克隆，挑选一阳性克隆过　夜培养，用Ｑｉａｇｅｎ　Ｐｌａｓｍｉｄ　Ｍｉｎｉ试剂纯化质粒。运　用ＮＤ～１００（Ｎａｎｏ　Ｄｒｏｐ，美国）测定所有样品的浓度　（ｒｉｇ／ｆｘ１）和纯度（ＯＤ：６０　：ＯＤ　）。根据浓度计算　其拷贝数。依次按１０　、１０　、１０　、１０　、１０　、１０　、１０　拷　贝／　ｌ稀释模版标准物。　１．５　实时ＰＣＲ　实时ＰＣＲ使用ｉＱ　ＳＹＢＲ　Ｇｒｅｅｎ　Ｓｕｐｅｒｍｉｘ（ＢＩＯ　ＲＡＤ）法，反应体系总体积为２５　ｌ，其中上下游引　物各１　Ｉｘｌ（浓度为１０　ｍ０ｌ／Ｌ），２５　Ｉｘｍｏｌ／Ｌ　ＭｇＣＩ２　１　ｌ，ｉＱ　ＳＹＢＲ　Ｇｒｅｅｎ　Ｓｕｐｅｒｍｉｘ　１２．５　ｌ，无菌水８．５　ｌ，样品标准物或待测样品１　Ｉｘｌ。ＰＣＲ反应程序为　９５℃预变性３　ｒａｉｎ，然后９５℃３０　Ｓ、５５℃３０　Ｓ、７２　℃３０　Ｓ，共４５个循环，最后收集熔解曲线，即５５℃　１０　Ｓ，每个循环增加０．５℃，共８０个循环。每个样　品或标准物均重复一次。实时ＰＣＲ结束后，运用　Ｖｉｅｗ　Ｐｏｓｔ—Ｒｕｎ　Ｄａｔａ模块自动产生分析回归曲线、　相关系数以及待测样品拷贝数。　２结果与分析　２．１　实时荧光扩增曲线　图１中每一条曲线代表一个ＰＣＲ反应，在本试　验中，ＰＣＲ引人了荧光化学物质ＳＹＢＲ　Ｇｒｅｅｎ　Ｉ，随　着ＰＣＲ反应的进行，ＰＣＲ反应产物不断累计，荧光　信号强度也等比例地增加。每经过一个循环，收集　个荧光强度信号，通过荧光强度变化监测产物量　的变化，从而得到相应的荧光扩增曲线图。实时荧　光定量ＰＣＲ就是通过对ＰＣＲ扩增反应中每一个循　环产物荧光信号的实时检测从而实现对起始模板定　量和定性的分析。　魑　循环圈数　图１　实时荧光扩增曲线　２．２　熔解曲线　图２结果表明：ＰＣＲ产物清晰，未有非特异性扩　增，结果为确定特异性扩增产物。　慧　温度（℃）　图２　ＰＣＲ产物熔解曲线　２．３　荧光定量标准曲线　由荧光定量标准曲线（图３）可见：ＰＣＲ效率为　０．９７８；标准曲线为Ｙ＝一３．７６８ｘ＋４４．５６８，标准曲线　的相关系数为０．９９２；中华绒螯蟹样品的测定值在　１０　～１０　拷贝／　ｌ之问。　４Ｏ　３５　３０　Ｉ５　ｌＯ　维普资讯 http://www.cqvip.com １６６一　江苏农业科学２００７年第５期　３讨论　ＲＮＡ样品进行定量分析，包括绝对定量分析和相对　定量分析，前者可以得到某个样本中基因的拷贝数　和浓度；后者可以对不同方式处理的两个样本中的　基因表达水平进行比较。此外，该技术还可以对　ＰＣＲ产物或样品进行定性分析。本研究表明，基于　ＳＹＢＲ　Ｇｒｅｅｎ　Ｉ的定量ＰＣＲ方法可为基因组大小提　供一种特异、快速和简便的定量检测方法，与经典的　本研究中对照水稻样品的基因组大小为０．４２　±０．１３　Ｐｇ，与以前水稻报道结果０．４５±０．０ｌ　ｐｇ相　近，其单倍体基因组约为４１７　Ｍｂｌ６　。ＰＣＲ的扩增效　率理论值为１，ＰＣＲ产物随循环的进行而成指数增　加，通常扩增效率≤１。一般要求进行定量分析的　ＰＣＲ效率为０．９５—１．０５之间，而本研究的ＰＣＲ效　率为０．９７８，在有效范围内。标准曲线回归系数Ｒ　为０．９９２，本研究检测结果中华绒螯蟹的基因组大　孚尔根一显微分光光度计法和流式细胞术法相比具　有独特优势。　参考文献：　［１］赵金良，李思发．中华绒螫蟹基因组研究概述［Ｊ］．集美大学学　报：自然科学版，２００３，８（４）：３１ｌ一３１６．　小为１．７２±０．２５　Ｐｇ，测定方法可行，结果可靠。　本试验结果显示中华绒螯蟹的基因组大小为　１．７２±０．２５　Ｐｇ，１　Ｐｇ基因组ＤＮＡ约等于９７８　Ｍｂ一　，　中华绒螯蟹基因组大小（１Ｃ）为１　６８２±２４４　Ｍｂ。这　［２］任修海，崔建勋．１４种淡水鱼基因组大小变异的研究［Ｊ］．遗　传，１９９４，１６（３）：１７—２０．　［３］Ｊｏｈｎｓｔｏｎ　ＪＳ，Ｂｅｎｎｅｔｔ　ＭＤ，Ｒａｙｂｕｒｎ　ＡＬ，ｅｔ　ａ１．Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ　ｓｔａｎｄａｒｄｓ　ｆｏｒ　ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ　ｏｆ　ＤＮＡ　ｃｏｎｔｅｎｔ　ｏｆ　ｐｌａｎｔ　ｎｕｃｌｅｉ【Ｊ］．Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｊｏｕｒ—　ｎａｌ　ｏｆ　Ｂｏｔａｎｙ，１９９９，８６：６０９—６１３．　结果低于采用孚尔根法测定的螃蟹（Ｅｔｉｓｕｓ　ｌａｅｖｉ．　ｍ０ｎ　）的Ｃ值（２．５　Ｐｇ），而与蓝色螃蟹（ＣａＵｉｎｅｃｔｅｓ　ｓａｐｉｄｕｓ）的Ｃ值接近（１．９　Ｐｇ）。有报道表明中国水　生生物（主要为淡水鱼类）ＤＮＡ含量呈非正态性分　【４］Ｗｉｌｈｅｌｍ　Ｊ，Ｐｉｎｇｏｕｄ　Ａ，Ｈａｈｎ　Ｍ．Ｒｅａｌ～ｔｉｍｅ　ＰＣＲ—ｂａｓｅｄ　ｍｅｔｈｏｄ　ｏｆｒ　ｔｈｅ　ｅｓｔｉｍａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｇｅｎｏｍｅ　ｓｉｚｅｓ［Ｊ］．Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ，　２００３，３１（１０）：５６—６２．　布，具有较宽的变异范围；其中，ＤＮＡ含量最低的为　合鳃目的黄鳝（１．２４　Ｐｇ），最高的为鲤形目鲤科裂腹　鱼亚科的双须重唇鱼（１９．２８　Ｐｇ）Ｌ　２　１。由此可见，中　［５］Ｚｈｕ　ＺＹ，Ｓｈｉ　ＹＨ，Ｌｅ　ＧＷ．Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ　ａｎｄ　ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｐｏｌｙｍｏｒ—　ｐｈｉｃ　ｍｉｃｒｏｓａｔｅｌｌｉｔｅｓ　ｆｒｏｍ　Ｃｈｉｎｅｓｅ　ｍｉｔｔｅｎ　ｃｒａｂ，Ｅｒｉｏｃｈｅｉｒ　ｓｉｎｅｎｓｉ￣［Ｊ］．　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｅｃｏｌｏｇｙ　Ｎｏｔｅｓ，２００６，６：８３８—８３９．　华绒螯蟹是中国水生生物中ＤＮＡ含量较低的物种。　荧光定量ＰＣＲ技术是通过检测ＰＣＲ产物中荧　光讯号强度来达到定量的目的，该技术不仅实现了　ＰＣＲ从定性到定量的飞跃，而且与常规ＰＣＲ相比，　它具有特异性强、可有效解决ＰＣＲ污染和自动化程　［６］Ｂｕｒｒ　Ｂ．Ｍａｐｐｉｎｇ　ａｎｄ　Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ　ｔｈｅ　Ｒｉｃｅ　Ｇｅｎｏｍｅ［Ｊ］．Ｐｌａｎｔ　Ｃｅｌｌ，　２００２，１４（３）：５２１—５２３．　［７］Ｄｏｌｅｚｅｌ　Ｊ，Ｂａ￣ｏｓ　Ｊ，Ｖｏｇｌｍａｙｒ　Ｈ，ｅｔ　ａ１．Ｎｕｃｌｅａｒ　ＤＮＡ　ｃｏｎｔｅｎｔ　ａｎｄ　ｇｅｎｏｍｅ　ｓｉｚｅ　ｏｆ　ｔｒｏｕｔ　ａｎｄ　ｈｕｍａｎ［Ｊ］．ｃ）ｒｔｏｍｅ　，２００３，５１：１２７一　ｌ２８．　度高等特点。实时荧光定量ＰＣＲ技术是ＤＮＡ定量　技术的一次飞跃　。运用该项技术，可以对ＤＮＡ、　（上接第１５３页）　［８］刘进元．同步ＰＣＲ技术及其在植物核酸分子定量中的应用［Ｊ］．　植物学报，２００３，４５（６）：６３１—６３７．　料，同时，在产蛋期要保持环境安静，以免野鸭应激，　减少不合格种蛋。尽可能使用相近的蛋重和蛋形指　数的种蛋同批孵化，以便管理。对于过大、过小、过　粘连不易出壳。种蛋过长则胚胎发育不正常而与蛋　壳粘连造成死亡。种蛋过圆则胚胎因气体供应不足　而窒息死亡　。　长、过圆的种蛋，要加强孵化后期的管理，如加大湿　度，以降低孵化后期胚胎死亡率，提高健雏率。　参考文献：　［１］丁伯良．特种禽类养殖技术手册［Ｍ］．北京：中国农业出版社，　２０００：３４９—３５０．　本试验结果表明，蛋重和蛋形对绿头野鸭种蛋　的孵化效果均有一定的影响，蛋重在５１～５５．９　ｇ、蛋　形指数在１．３０～１．３５之间种蛋孵化效果最佳，种蛋　受精率、受精蛋孵化率及健雏率较高。但试验中也　发现，蛋重及蛋形指数在一个较宽的适应范围内（蛋　重在４｜５—６０．９　ｇ，蛋形指数在１．２４～１．４１之间），也　同样获得了较好的孵化效果（受精蛋孵化率均在　９０％以上），因此，在实际孵化生产上，对于适宜蛋重　和蛋形指数的种蛋都有一个较宽的适应范围　。　绿头野鸭在饲养管理方面，要给予优质全价饲　［２］王世成，傅传谟，孙国强，等．蛋形指数、蛋重及比重对孵化率和　性比例的影响［Ｊ］．莱阳农学院学报，１９９７，１４（３）：２０６—２０９．　［３］魏华颖．蛋重和蛋形指数对黑凤鸡种蛋孵化率的影响［Ｊ］．畜禽　业，２００３（５）：６—７．　［４］郭玉勋，江建文，黄艳芳．美国绿头野鸭的人工孵化试验［Ｊ］．养　禽与禽病防治，２００５（１）：１３．