MTT法观察DMF致人肝细胞增殖抑制作用

・论著・

MTT法观察DMF致人肝细胞增殖抑制作用

121房云　杨锦蓉　王菁3

　　【摘要】目的　观察不同染毒剂量二甲基甲酰胺(DMF)对正常成人离体肝细胞的增殖抑制作用。方法　用MTT比色法观察细胞生长变化,分别以1156mmol/L、6125mmol/L、25mmol/L、100mmol/LDMF为染毒剂量,以6h、12h、24h为染毒时间对人肝细胞进行培养。比较在不同时间下,不同染毒剂量组与阴性组的细胞生长率。结果　同一染毒时间组内,不同剂量组的细胞生长变化率结果差异有显著意义(F=27141、23186、

111122,P<0101),以100mmol/LDMF组细胞增殖率为最低,但不同染毒剂量组细胞生长变化率未见明显剂

量2效应关系,染毒6h和12h25mmol/L组的细胞生长变化率高于其他浓度组;同一染毒剂量组内,各不同染毒时间组的细胞生长变化率结果差异有显著意义(F=27180、29179、42147、28188,P<0101),以24h组细胞增殖率为最低。结论　与阴性组比较,DMF对细胞增殖有抑制作用;但不同染毒剂量组细胞生长变化率的剂量2效应关系不明显;随染毒时间延长,同一染毒剂量组内细胞增殖活性变化率有下降趋势,有一定染毒时间2效应关系。

【关键词】二甲基酰胺;肝细胞毒性;噻唑兰实验

中图分类号:R-332　　文献标识码:A　　文章编号:100720931(2006)1120001203InhibitoryEffectofDMFonCellProliferationofHumanHepatocyteDeterminedbyMTTAssay

FANGYun,WANGJing,YANGJin2rong.Hangzhou,Zhejiang,310006,China)

(TheInstituteofOccupationalandEnvironmentalHealth,ZhejiangUniversity,

【Abstract】Objective　ToexploretheinhibitoryeffectoncellproliferationofhumanhepatocytebyN,N2dimethylformamide

(DMF)invitro.Methods　ThehumanhepatocyteswereexposedtoDMFwithdoseof0mmolΠL,1156mmolΠL,6125mmolΠL,25mmolΠLand100mmolΠLrespectivelyandeachdosegroupwasexposedtoDMFfor6h,12hand24h.Methylthiazoltetrazoliumassay(MTTassay)wasperformedtocomparecellproliferationrateamongthesegroups.Results　Atsamepointofexposuretime,cellproliferationratesamongdifferentdosegroupshadstatisticallysignificantdifference(P<0101),ofwhich100mmolΠLDMFgroupwaslowest.Butthedose2effectrelationshipcouldnotbeobserved.Thehepatocyteproliferationratesin25mmolΠLDMFgroupwithexposuretimefor6hand12hwerehigherthanothergroups.Insamedosegroups,cellproliferationratesamongdifferentexposuretimegroupshadstatisticallysignificantdifference(P<0101),ofwhichexposurefor24hwaslowest.Conclusions　Comparedwithcontrolgroup,DMFhasinhibitoryeffectoncellproliferation.However,adose2dependentrelationshipbetweencellproliferationandDMFconcentrationisnotobvious.CellproliferationratedeclineswiththeprolongationofexposuretimetoDMF,andtime2effectrelationshipexists.

【KeyWords】N,N2dimethylformamide;Hepatotoxicity;Methylthiazoltetrazoliumassay

　　二甲基甲酰胺(N,N2dimethylformamide,DMF)是无色带有鱼腥味的液体,一种用途广泛的化工原料和溶剂,被广泛应用于萃取、有机合成、染料、纤维、皮革、制药等工业。随着现代化工业的发展,DMF的应用范围不断扩大,

2]但最近几年不断有接触DMF导致中毒的报道[1、。

但是目前DMF致肝细胞抗毒的抗剂尚未见报道,本实验以正常人体外培养肝细胞为观察对象,研究不同DMF染毒剂量及不同染毒时间对肝细胞生长变化的影响,探讨DMF致肝细胞损伤机制。

DMF对作业人群职业安全存在很大的隐患。国内外对DMF致职业人群健康影响的流行病学调查已有较多报道,

材料与方法

1　试剂和仪器　二甲基甲酰胺(DMF),AMRESCO公司;

浙江省医药卫生科学研究基金;编号:2005B019作者单位:1.浙江大学医学院劳动卫生与环境卫生研究所;2.浙江省疾病预防控制中心　　3通讯作者

新生牛血清(FBS),杭州四季青生物工程材料有限公司;

胰蛋白酶,AMRESCO公司;噻唑蓝(MTT),AMRESCO公司;二甲基亚砜(DMSO),浙江杭州双林化工试剂厂;谷氨酰胺,AMRESCO公司;丙酮酸钠,上海康捷生物科技发展有限公司;RPMl1640培养基,美国GIBCO公司;Olympus

・2・浙江预防医学2006年第18卷第11期　ZhejiangPrevMed,November2006,Vol18,No.1125mmol/LDMF组细胞增殖变化率为最高,24h时间组内,1156mmol/LDMF组细胞增殖变化率为最高;同一染毒剂量

光学显微镜,日本Olympus公司;Synergy(Bio-Tek)酶标仪,美国;NIKON数码摄像机,日本。

2　细胞培养　实验用肝细胞系正常成人肝细胞,购于中科

组内,各不同染毒时间组的细胞生长变化率结果差异有显著意义(P<0101),以24h组细胞增殖率为最低。

2　不同染毒时间各染毒剂量组细胞增殖活性变化趋势　各

院上海细胞库,代号为HL-7702。将购置的细胞放入5%

CO2、37℃培养箱中培养并进行传代、消化、种瓶、换液。3　MTT实验

[3]

　把处于对数增长期的细胞制备成密度约5

染毒剂量组细胞生长变化率均小于阴性组。在各个染毒剂量组内,表现为随染毒时间增加,细胞生长变化率有一定程度下降,但培养6h和12h后25mmol/L组出现上升趋势。在各个染毒时间段内,随DMF剂量增高细胞生长变化率出现时间2效应关系,但未见细胞生长变化率随染毒时间延长出现明显下降趋势。

3　细胞形态学比较　400倍荧光显微镜下观察,正常成人

5

μ×10cell/ml细胞悬液,将其接种于96孔板上,每孔200l,

放入培养箱中培养24h后,各染毒组每孔加RPMI1640培养μμ液180l、不同浓度的DMF溶液20l,使DMF终浓度为

1156mmol/L、6125mmol/L、25mmol/L、100mmol/L

[4]

;阴性

μ组加RPMI1640培养液180l;空白组不加任何试剂。染毒后放入培养箱中继续培养并开始计时。每组设置12个平行孔。各剂量组均设置3个染毒时间,分别为6h、12h、24h。染色时阴性组、染毒组、空白组各孔均加RPMI1640培养液μμlMTT染液,MTT染液终浓度为015mg/m1。染色180l,20后置培养箱中继续培养4小时,培养结束后将各孔中液体μ吸净,加入150lDMSO,在酶标仪中振荡10min,致紫色结晶全部溶解,570nm波长处测定其吸光度值。

4　细胞形态学变化　把处于对数增长期的细胞进行DMF肝细胞,细胞形状呈梭形、菱形、多角形等多种形态。而经100mmol/LDMF染毒24h后,基本上所有细胞形态出现改变,例如回缩、变圆、体积缩小,甚至漂浮等现象。

讨　论DMF在生产环境中常以蒸汽形式扩散,主要经呼吸道

吸入,液体污染体表可经完整皮肤进入体内。DMF在体内肝脏的代谢是甲基的羟基化,细胞色素加单氧化酶P4502E1起催化作用,生成N-甲基甲醇酰胺(HMMF),再进一步氧化生成活性中间产物异氰酸甲酯(CH3NCO),它具有亲电活性,可与蛋白质、DNA和RNA等大分子物质的亲核中心共价结合,造成肝、肾等脏器损害或姐妹染色体交换的改变[5]。

自1983年Mosman用MTT比色法检测存活细胞和细胞增殖以来,该方法已广泛用于细胞毒性试验,一些生物活性因子的活性检测、大规模的抗肿瘤药物的筛选以及肿瘤

染毒处理,方法同MTT实验,染毒结束后在显微镜下观察细胞形态改变。5　细胞生长变化率[3]　记录每个观察时间下各组的吸光度值,比较在各染毒时间下不同剂量染毒组及阴性组之间的细胞增殖情况,以细胞生长变化率表示。以浓度为横坐标,吸光度为纵坐标绘制细胞增殖曲线图。

6　统计方法　运用spss1115统计软件包处理数据,对结果

进行单因素方差分析。

结　果

1　不同染毒剂量及不同染毒时间细胞生长变化率　各剂量

放射敏感性测定等。在一定浓度下,MTT能透过质膜被活细胞线粒体膜上的琥珀酸脱氢酶还原成蓝紫色甲　结晶并沉积在细胞中,而死细胞无此功能。由于结晶物形成的量与细胞数量及代谢活性成比例,用酶联免疫检测仪在570nm波长处测定其光吸收值,可间接反映活细胞的数量[3]。

DMF是一种低毒类有机溶剂,毒理学实验表明:大鼠

组与阴性对照组生长变化见表1。

表1　不同染毒时间和剂量组细胞生长

变化率比较(x±s)

浓度组

mmolΠL

6h1100±01000188±01100184±01070189±01110175±0108271410100

12h1100±01000176±01110175±01130178±01130170±0113231860100

24h1100±01000165±01110159±01090158±01090152±01091111220100

F-27180291794214728188

P-0100010001000100

经口LD50:2800mg/kg,吸入LC50:5000ppm/6H;小鼠经口

LD50∶700mg/kg;吸入LC50:9400mg/m/2H。兔经皮LD50:4720mg/kg。本实验采用的离体正常成人肝细胞是无限传代

3

阴性组

11566125

25100FP

贴壁细胞。DMF染毒实验结果可见:所有染毒剂量组细胞生长变化率均小于阴性组,体外培养正常成人肝细胞DMF染毒可引起细胞损伤,干扰细胞正常分裂,对正常人肝细胞增殖有一定抑制作用;实验中不同染毒剂量组细胞生长变化率的剂量2效应关系不明显,但不同染毒时间可见明显的染毒时间2效应关系。可能是DMF被细胞摄取后,在细胞色素加单氧化酶P4502E1的催化下,生成代谢产物异氰酸甲酯(CH3NCO),造成细胞损害,进而抑制细胞的增殖活性[6]。

(下转第9页)

　　从表1可见:同一染毒时间组内,不同剂量组的细胞生长变化率结果差异有显著意义(P<0101)。以100mmol/L

DMF组细胞增殖率为最低,但染毒6h和12h时间组内,

浙江预防医学2006年第18卷第11期　ZhejiangPrevMed,November2006,Vol18,No.11・9・

讨　论

近些年来,国外学者进行了大量的研究,明确了婴幼儿幼年营养状态可以程序性地影响后续糖尿病的发生。Mc

Cance对1179名Pima印度人的研究发现,出生体重与2型

参考文献

[1]HalesCN,BarkerDJ,ClarkPM,etal.Fetalandinfantgrowthand

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糖尿病呈U型相关,即出生体重低和高者后续糖尿病的危险均增高[4]。Petrik研究孕鼠低蛋白饮食(饲料蛋白含量为

8%,正常为20%)对仔鼠成年时葡萄糖代谢的影响,发现

实验组雌性仔鼠在生后70天出现了糖耐量异常,蛋白质限制的母鼠所产仔鼠胰岛β细胞凋亡增加

[5]

。McCance通过

国外医学卫生学分册,2005,32(4):236～240.

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[9]柳红芳,陆菊明,母义明,等,增加n-6脂肪酸对高脂诱导

调整每窝新生仔鼠的数目,形成大窝和小窝喂哺,在生后第18天进行糖耐量实验结果发现,小窝喂哺组胰岛素分泌增加,大窝组胰岛素分泌减低

[4]

。Hale提出节俭基因型假

说,即子宫内不良营养环境条件可增加后续患糖尿病等症的危险[6]。进一步研究,人们提出,慢性病的发育源假说,即生长发育期间(包括胎儿期、婴儿期和断乳后的发育塑型期)的营养状况影响后续2型糖尿病的危险[7]。

研究显示,多不饱和脂肪酸可以增加胰岛素敏感性,缓解胰岛素抵抗。Lardinois等研究发现,摄入多不饱和脂肪酸可以增加外周组织对葡萄糖的摄取和利用,改善胰岛素敏感性[8]。柳红芳等研究发现,增加n-6多不饱和脂肪酸(来自大豆色拉油)的摄入可改善高脂膳食大鼠的胰岛素敏感性[9]。本研究给刚断乳大鼠喂饲多不饱和脂肪酸饲料。结果发现,幼年喂饲多不饱和脂肪酸饲料可以显著降低高脂膳食大鼠的体重,增加胰岛素敏感性,降低糖尿病危险。

有研究报道多不饱和脂肪酸可抑制糖异生

4表达、增加胰岛素的生物学效应的

[10]

[2]

的大鼠胰岛素抵抗和血清游离脂肪酸谱的影响[J).军医进修学院学报,2005,26(2):84～87.

[10]柳红芳,陆菊明,母义明,等.n-3多不饱和脂肪酸对高脂

,增加胰

岛素信号途径相关蛋白如胰岛素受体含量和葡萄糖运载体2

,所以我们推测对

诱导胰岛素抵抗大鼠肝脏和骨骼肌胰岛素受体及葡萄糖转运蛋白4的作用[J].中华糖尿病杂志,2005,13(3):192～196.

(收稿日期:2005212206)

糖异生和胰岛素信号因子的持续抑制和增强作用可能是幼年多不饱和脂肪酸饲料增加胰岛素敏感性的潜在作用机制。

(上接第2页)与阴性组比较,DMF对细胞增殖有抑制作

科技技术出版社,2004,425～426.

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(收稿日期:2006203217)

用;但不同染毒剂量组细胞生长变化率的剂量2效应关系不明显;随染毒时间延长,同一染毒剂量组内细胞增殖活性变化率有下降趋势,有一定染毒时间2效应关系。

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