土壤中含淀粉酶细菌的分离实验报告

摘要：本实验通过培养基的配制，常用器皿的准备及无菌水的配制为从土壤中分离出产淀粉酶细菌做了准备。又通过加热和不加热分组来观察两组相同的分密度梯次的细菌的生长情况和菌落数。还利用含淀粉酶细菌能够分泌淀粉酶，淀粉酶能够分解淀粉，淀粉能与碘试剂发生显色反应，含淀粉酶细菌菌落生长的地方不能放生显色反应而呈现透明圈，通过统计透明圈数来分析培养基浓度和温度对土壤中细菌菌落的形成的影响及土壤中有淀粉酶活性细菌占总细菌的比例。

关键词：培养基 土壤微生物 菌种分离 含淀粉酶细菌

1、前言

土壤中生活着许许多多的不同种类的、数量庞大的微生物，是微生物多样性的重要场所，它们对自然界物质的转化和循环起着极为重要的作用，对农业和环境保护有着不可忽视的影响。

早在十九世纪中期，农业化学和细菌学的形成和发展为研究土壤中物质转化的微生物学过程开辟了道路。二十世纪五十年代，人们对土壤只能够诸营养元素循环的各个环节的微生物学过程进行了深入的研究，论证了土壤微生物对增强土壤肥力的作用。新中国成立后，国家开展了对土壤微生物的教学和科学研究，后国家给予力支持，二十年来的奋力研究取得骄人的成绩。现如今，生物技术迅猛发展，一些仅在实验室里制备用于研究的细菌已经可以工业化大规模生产，可以利用该生物的有机体或其产物，将物料转化为商业性产品，在食品、轻工、医药及农林等方面广泛应用。

本实验是从土壤中筛选可以生产淀粉酶细菌为目的，利用物理和化学方法探究稀释度对细菌菌落形成的影响，以及用不同的处理方式反映出高温加热对含有高活性淀粉酶细菌的比例产生影响。

2、材料与方法

2.1 材料

2.1.1 培养基配制的材料与试剂

材料：土豆200g ，葡萄糖20g ，琼脂粉2% 6g ，淀粉1% 3g ，废报纸，棉花，纱布，棉绳

试剂：无菌水 2.1.2 玻璃器皿

无菌培养皿，无菌吸管，试管十支，移液管两支2ml，圆底培养皿十个，玻璃珠20颗，三角瓶50ml，具塞三角瓶 2.1.3 样品 新鲜土壤

2.2 方法

2.2.1 PDA溶粉的培养基制备

把土豆削皮，切成边长1-2cm，称取60g倒入大三角瓶中，加600ml水并在电炉上煮沸20min，边加热边振荡以免烧糊，趁热在纱布上过滤，在滤液中添加6g葡萄糖，再加入3g1%的淀粉和6g2%的琼脂粉，加热熔化，定容至250ml，然后用制作好的棉塞塞住瓶口，再用旧报纸包一层包扎好，在灭菌后把培养基放入养箱中培养24小时。 2.2.2 细菌分离的方法

① 在具塞三角瓶中加入90ml的水，再加入20颗玻璃珠，并用报纸和棉绳包扎好，灭菌。取十支试管，每支试管中用移液管加入9ml的水，塞上棉塞，把试管用棉绳一起绑起来，再用报纸包起来包扎好，灭菌。然后将试管分为两组，并标注适当的标签，把圆底培养皿灭菌后也分成相应的两组。 ② 称取10g土样，加入到含有90ml无菌水的三角瓶中，振荡10min，后静置5min，用吸管吸上层悬液1ml，加入到其中一组中的试管，反复吸放三次后取该试管中溶液1ml加入到另一试管中，依次进行五次，配制五支浓度分别为10

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、10、10、10、10。用另一移液管取1ml土壤上层悬液加入

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到另一组试管中，按上述同样方法分别配置五种浓度的细菌培养液，并根据稀释度在两组试管编号，将其中一组5支试管标记放在瓷缸中，用沸腾的水浴中加热5min。另一组不处理。 2.2.3 培养方法

用对应的移液管按照浓度顺序从低到高分别各取1ml菌液加入到相应的圆底培养皿中，然后将培养基倒入培养皿中，边到边晃匀，精置冷却凝固。另一组用同样方法处理。待均凝固后，倒置平板于30C培养箱中，培养一到两天后观察结果。

2.2.4 含淀粉酶细菌的鉴别方法

将培养好的细菌按组分放置，向一培养基中倒入适量的碘液，待反应一段时间后，吧该培养基中的碘液倒入到改组的下一个培养基中，以此类推，如碘液不够，可适量加入。均反映后，观察培养皿中有没有透明圈，有的即是含淀粉酶细菌的菌落。

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3、结果与讨论

3.1 稀释度对土壤细菌菌落形成的影响

用PDA培养基分别培养不同稀释度的土壤的菌悬液，结果表明如下图，10、10、10、10、10稀释度中形成的菌落分别为（未加热组）283、116、27、42、18，（加热组）102、53、16、9.其相差的倍数分别为（未加热组）2.04、1.70、1.55、1.38，（加热组）1.92、3.31、0.70、2、56.即不同菌悬液稀释度之间没有严格的比例关系，其原因可能是随着菌悬液稀释度逐渐增大，营养物质消耗，代谢产物的积累，土壤细菌群体出现竞争抑制，细菌的死亡率和生长率不规律。

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图1 稀释度对土壤细菌菌落的影响300250A组菌落数（n）200150100500110100100010000B组稀释度（×10-6）

3.2 土壤中用淀粉酶活性细菌的比例

为了了解土壤中含淀粉酶菌株的比例，选择了PDA培养基由于淀粉培养

基中只有淀粉为唯一的碳源，因此，在该培养基中能生长良好的细菌一般均为具有淀粉酶活性。实验结果如下图所示，按照10、10、10、10、10

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稀释度中菌落数计算，所采集土壤样品中具有淀粉酶活性的细菌比例在25%左右。

表1 稀释度 10-2c 10-3c 10 10-5c 10-6c

-4c

土壤中具有淀粉酶活性的细菌 马铃薯-淀粉培养基 16 10 5 7 0

3.3 菌悬液加热处理对淀粉酶活性细菌比例的影响

将菌悬液进行加热100C处理，然后按常规方法作稀释和培养，结果表明如下图，加热可以显著降低菌悬液中的细菌数量，但具有淀粉酶活性的细菌比例由 提高到 ，加热处理可以显著提高菌悬液中淀粉酶活性细菌的比例，说明淀粉酶活性细菌的最适生长温度比其他细菌的最适生长温度高，过高的温度抑制了其他细菌的生长。

含淀粉酶细菌比例（％）35302520151050常规分离处理方式加热处理0

图2 菌悬液加热处理对含淀粉酶细菌比例影响3.4 淀粉酶酶活性细菌的获得与初步筛选

将在淀粉培养基中生长的细菌菌落分别进行下一步的划线分离，挑取单

个生长的菌落接种到试管中保持，然后在含淀粉培养基的培养皿中加入碘液，观察透明圈的大小，初步选定透明圈较大的细菌菌落为淀粉酶活性较高的菌株。

4、结论

土壤中存在产淀粉酶的细菌，然而，土壤中存在的产淀粉酶的细菌在整个土壤细菌中所占的比例是较小的，土壤中绝大多数的细菌是不能产生淀粉酶的。高温对于土壤中的不耐热的细菌具好的消灭效果，却对产淀粉酶的细菌没有影响。所以，可以通过高温处理来提高分离出来的产淀粉酶细菌的纯度。由于受实验设备及实验操作等方面的影响，经初步筛选出的含淀粉酶细菌中仍混有其它杂菌。所以，我们应该对初步筛选出的细菌再次进行筛选，筛选出纯度较高的含淀粉内细菌，并用显微镜观察其菌落的特征，对照辨别其所属菌种。针对该菌种的特性，对其淀粉酶的活性、生长周期、最适温度、最适PH、耐酸性、耐碱性、发酵条件等一系列问题进行深入的研究，探究其在工业生产以及其他领域的中的应用。

参考文献

1. 沈萍 微生物学（第二版） 高等教育出版社.2006

2. 陈云中 淀粉酶的性质和分类. 武汉粮食工业学院学报.1990. 3. 殷蔚申 食品微生物学 财政经济出版社 1991 4. 黄秀梨 微生物学（第二版） 高等教育出版社 2003

5.（美）M..J.小佩尔扎等著 陈漱员等译 科学出版社 1987