地中海贫血基因检测试剂盒安全性、有效性、可靠性质量规范和审查标准

地中海贫血基因检测试剂盒安全性、有效性、可靠性质量规范和认证标准

本文件旨在指导和规范地中海贫血基因检测试剂注册质量管理体系核查资料的准备及撰写，同时也为注册质量管理体系核查现场检查提供参考。根据《医疗器械监督管理条例》（中华人民共和国国务院令第680号）、《体外诊断试剂注册管理办法》（国家食品药品监督管理总局令第5号）、《医疗器械生产质量管理规范》（国家食品药品监督管理总局2014年第64号）、《国家食品药品监督管理总局关于发布医疗器械生产质量管理规范附录体外诊断试剂的公告》（国家食品药品监督管理总局2015年第103号）、《食品药品监管总局关于印发医疗器械生产质量管理规范现场检查指导原则等4个指导原则的通知》（食药监械监〔2015〕218号）等管理办法，结合广东省地中海贫血基因检测类产品注册证超过全国注册证60%，因此，制定广东省地中海贫血基因检测试剂质量规范和认证标准，旨在提高广东省行业水平，规范行业发展，把控产品的安全性、有效性、可靠性。

本文件是在现行法规、标准体系及当前认知水平下制定的，随着法规、标准体系的不断完善和科学技术的不断发展，其相关内容也将适时进行调整。

本文件不作为法规强制执行，不包括行政审批要求。申请人应根据国家相关法律法规、标准及技术指导原则的要求合理评价产品的安全性和有效性。

一、 适用范围

本文件旨在指导申请人对地中海贫血基因检测试剂注册质量管理体系核查提交资料的准备及撰写，同时也为注册质量管理体系核查现场检查提供参考。根据《体外诊断试剂注册管理办法》（国家食品药品监督管理总局令第5号）、《食品药品监管总局关于印发体外诊

1

断试剂分类子目录的通知》（食药监械管〔2013〕242号），地中海贫血基因检测试剂属于三类体外诊断试剂。

二、 产品概述

地中海贫血（Thalassemia），又称海洋性贫血、珠蛋白生成障碍性贫血，简称地贫，是一组遗传性小细胞低色素溶血性贫血，其共同特点是由于珠蛋白基因的缺陷使血红蛋白中的珠蛋白肽链有一种或几种合成减少或不能合成，导致血红蛋白的组成成分改变，从而导致发病。地中海贫血为世界上发病率最高、危害性最大的单基因遗传性疾病之一。地中海贫血临床症状轻重不一，大多表现为慢性进行性溶血性贫血，其临床上分轻型（TT）、中间型（TI）和重型（TM），对重症患者身体构成严重威胁，具体表现为铁过载、脾脏肿大、感染、骨骼畸形以及增长速度减缓等症状和体征。地中海贫血在全球广为流行 ，广泛分布于世界热带和亚热带地区，全球约有3.5亿人携带地贫基因，占世界总人口的5%，我国长江以南的广大地域为该病的高发区，人群携带率为3%-24%，地贫已经成为我国长江以南各省发病率最高、影响最大的遗传病之一，在广东、广西、海南、云南、贵州、四川、重庆、福建、湖南、湖北等省发病率较高，其中以广西、广东、海南最为严重。

地中海贫血按照受累的基因来分类，组成珠蛋白的肽链有4种，即α、β、γ、δ链，分别由其相应的基因编码，这些基因的缺失或突变可造成各种肽链的合成障碍，致使血红蛋白的组分改变。通常将地中海贫血分为α、β、δ、δβ等4种类型，其中以α和β地中海贫血较为常见。正常成人血红蛋白（Hb）有三种HbA (α2β2)（94.5~97.8%）、Hb A2(α2δ2)（2.5~3.5%）、Hb F (α2γ2 )（2%以下）。

地中海贫血的诊断是根据典型的临床特征和实验室检查，结合区域及家系调查，一般

2

可作出诊断。目前国际常规的实验室诊断方法是血常规检测分析红细胞参数的基础上对可疑人群直接进行基因检测，国内常规的做法是在血红蛋白电泳筛查的基础上，对可疑人群直接进行基因诊断。基因诊断对于地贫确诊是必须的，是地贫携带者确诊的检测指标和进行高风险胎儿产前诊断的有效手段。鉴于地中海贫血成为我国长江以南各省发病率最高、影响最大的遗传病之一，地贫尚无有效的治疗方法，规范的开展地中海贫血的三级防控工作，包括婚前、孕前及产前夫妇双方进行地贫筛查及基因检测，并做好遗传咨询，及时有效进行高风险胎儿的产前诊断，新生儿及时规范进行地贫筛查及基因检测，是降低重型地中海贫血患儿出生率的首要措施，对提高人口素质具有重要意义。

本文件所述地中海贫血基因检测试剂是指，利用分子生物学检测技术，主要以PCR-反向点杂交法、Gap-PCR法、PCR-荧光探针法、荧光PCR熔解曲线法、PCR+导流杂交法、微阵列芯片法、PCR-流式荧光杂交法等，以地中海贫血基因特定序列为检测靶标，对人基因组DNA中α和/或β地中海贫血基因进行体外定性检测的试剂。也可为其它方法学的地中海贫血基因检测试剂盒提供参考依据。

三、 审查与核查关注要点：

（一） 设计开发：

应关注原材料的开发、来源、使用是否符合规定的要求，通过检查试剂盒研制记录，核对物料信息、物料的采购记录、临床批/注册批产品留样、生产记录、稳定性研究记录等，确认整个研制过程是否真实、可追溯。

1. 主要原材料

3

地中海贫血基因检测试剂的主要原材料应包括产品的所有主要组成成分，如引物、探针、酶、dNTP、试剂盒质控品（如有）、核酸提取/纯化组分（如有）等。申请人应验证主要原材料的性能指标符合产品研发、生产和检验要求，若主要原材料为企业自己生产，其生产工艺必须稳定；若主要原材料源于外购，应提供的资料包括：对物料供应商审核的相关资料、供货方提供的质量标准、出厂检定报告，以及对该原材料进行的质量检验资料。

1.1. 核酸提取/纯化组分（如有）的主要组成、原理介绍及相关的验证资料。

1.2. PCR组分的主要原材料（包括引物、探针、各种酶及其它主要原材料）的选择、制备、质量标准及实验研究资料，主要包括以下内容：

1.2.1. 引物和探针

目前市场上用于地中海贫血基因检测试剂盒的引物和探针主要是生产企业自行制备或外购于其他供应商,作为试剂盒的关键因素，引物和探针的筛选和验证必不可少。引物和探针由一定数量的碱基构成的特定序列，通常采用DNA合成仪人工合成，合成后经聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）或其他适宜方法纯化。应详述引物和探针的设计原则，提供引物、探针核酸序列、模板核酸序列及两者的对应情况。

引物、探针的质量标准至少应该包括纯度检查、功能性试验等。如为外购，还应提供合成机构出具的合成产物的质检证明，如紫外光吸收分析、PAGE结果或高效液相色谱法（HPLC）分析图谱等。如探针带有荧光标记物，还应确认标记的荧光基团。

1.2.2. 酶：对酶活性等进行评价和验证。

4

地中海贫血基因检测试剂盒需要的酶主要包括DNA聚合酶，其质量标准应包括DNA聚合酶活性、热启动能力（如有）、热稳定性，是否具有内切或外切酶活性。

尿嘧啶DNA糖基化酶（UDG/UNG）（如有），具有水解尿嘧啶糖苷键的活性，无外源核酸外切酶及核酸内切酶活性。

如使用其他工具酶，应提供相应的质检证明和验证资料。

1.2.3. 脱氧三磷酸核苷（dNTP）

核酸的组成成分，包括：dATP、dCTP、dGTP、dUTP和/或dTTP。应明确其纯度要求，如高效液相色谱（HPLC）纯、无DNase和RNase污染。质量标准应至少包括纯度检查或功能性实验等。

1.3. 产品研制所用参考品：

参考品的作用是产品性能溯源的根源。目前市场上用于地中海贫血基因检测试剂盒采用的主要是第三方标准品或是企业自行制备的企业参考品两种，应详细介绍参考品的原料选择、制备、定值过程、评价指标、统计学分析等试验资料。主要包括以下内容：

1.3.1. 阳性参考品

应包括申报产品声称的全部突变/缺失类型。阳性参考品中临床常见突变/缺失基因位点建议采用含人类基因组的样本（人体细胞）或其核酸提取液，临床少见的突变/缺失基因位点亦可采用细胞系或质粒样本。申请人可根据权威机构的最新文件或文献等确定常见突

5

变/缺失类型，并提交相应的支持资料。

1.3.2. 阴性参考品

可采用经确认无相应靶突变序列的细胞系、质粒样本、含人类基因组的样本或其核酸提取液。如野生型人基因组DNA，申报产品声称之外的其他突变类型的人基因组DNA等。

1.3.3. 检测限参考品

检测限参考品的原料要求参考阳性参考品，需包括所有的突变/缺失类型。在进行最低检测限性能评估时，应设置多个梯度，建议采用至少95%（n≥20）的阳性检出率作为最低检测限确定的标准。

1.3.4. 重复性参考品

重复性参考品原料可采用临床常见突变/缺失类型的质粒、细胞系、样本核酸提取液等。

1.4. 试剂盒质控品

试剂盒的质控体系通过设置各种试剂盒对照品来实现，质控体系需考虑对样本核酸分离/纯化、配液及加样、试剂及仪器性能、扩增反应抑制物（管内抑制）、交叉污染、靶核酸降解等因素可能造成的假阴性或假阳性结果进行合理的质量控制。鉴于此类产品检测目标为人基因组序列，任何临床样本均应有结果呈现，因此试剂盒中可不另外设置内部对照。

对照品可采用质粒、细胞系或临床样本的核酸提取液等进行配置。申报资料应对试剂

6

盒对照品有关原料选择、制备、定值过程等试验资料详细说明。申请人应视申报产品具体情况设置合理的试剂盒对照品（质控品），试剂盒质控体系主要考虑以下几方面要求：

1.4.1. 阳性对照

阳性对照可采用人体细胞系、质粒或基因核酸提取液等。企业应对阳性对照相应判断结果做出明确要求。

1.4.2. 阴性对照

阴性对照是含有野生型核酸序列的核酸溶液，对交叉污染导致的假阳性结果进行质控。

1.4.3. 空白对照（如有）

空白对照，对交叉污染导致的假阳性结果进行质控。

2. 主要生产工艺及反应体系

地中海贫血基因检测试剂盒类产品的生产工艺主要包括PCR反应液制备、质控品制备、膜条及显色相关配套试剂制备等，关键工序为反应液的配制以及膜条的点膜生产工艺。反应体系主要包括被测样本用量、试剂用量、反应条件、质控体系设置等。具体如下：

2.1. 反应原理介绍，可将反应原理形成图示表示；

2.2. 产品主要生产工艺介绍，可使用图表方式表示，并标明生产过程的关键工序、特

7

殊过程及质控要求；

2.3. 被测样本的要求，包括样本采集要求、处理方式的选择和设置等；

2.4. 确定反应体系的研究资料，包括：

2.4.1. 反应体系中的样本用量；

2.4.2. 体系中各试剂组分用量（包括引物/探针浓度；各种酶的浓度；dNTP浓度；缓冲离子浓度等）；

2.4.3. 检测程序的确定（包括扩增程序的确定；实验过程中关键参数的确认，如温度、时间）；

2.4.4. 质控体系的确定；

2.5. 试剂盒生产过程中影响因素的确定。

2.6. 不同适用机型的反应条件如果有差异应分别详述，并提交验证资料。

2.7. 如申报产品包含核酸分离/纯化试剂，应提交对核酸分离/纯化过程进行工艺优化的研究资料。

2.8. 对于关键工序如配液、点膜等应建立生产过程中的质量控制方法。

8

2.8.1 配液：用于配液和点膜的监视测量器具、设备应进行定期校准和维护保养；重点监控投料准确性、物料平衡、温度控制要求。

2.8.2 芯片（可包含膜、玻璃等不同材质的载体）制作：用于芯片制作的监视测量器具、设备应进行定期校准和维护保养；重点监控芯片处理工艺、探针点样控制。点膜过程中应确定点膜位置、印迹大小等控制标准。

2.9. 配制工作液的各种原材料及其配比应符合要求，原材料应混合均匀，配制过程，应根据实际情况设置关键参数进行有效控制。

3. 分析性能评估：

地贫基因检测试剂的性能评估主要包括：准确性、特异性、检测限、重复性、核酸提取效率等，应参考YY/T 1527-2017《α/β-地中海贫血基因分型检测试剂盒》和指导原则的要求。

4. 稳定性：

4.1. 产品稳定性

应对申报产品（包含质控品）的实时稳定性（包含三个批次）、运输稳定性、使用稳定性（例如：反复冻融稳定性、开瓶稳定性等）、加速稳定性（例如：高温加速破坏、光照加速破坏等，根据申报产品的实际情况选择）进行研究并规定。

重点核实稳定性研究资料的环境、设备、温度记录的规范性合理性；提供稳定性研究

9

过程的证据和研究结果，是否能够达到宣称的温度范围。

4.2. 样本稳定性

应对临床样本稳定性进行研究并规定，例如样本保存条件与期限、运输、反复冻融等。

（二） 采购环节

采购环节中的关注点主要来源于主要原材料的采购，是否制定供应商管理制度。针对主要原材料的采购，需其中包括

1. 主要原材料是否与供应商签订质量协议；

2. 按照《医疗器械生产企业供应商审核指南》建立供应商审核制度，对供应商进行审核评价；必要时进行现场审核。

3. 建立采购记录，包括采购合同、原材料清单、供应商资质证明文件、质量标准、检验报告及验收标准等；

4. 主要原材料按批次进行进货查验，记录完整并确保整个过程具有可追溯性；

5. 供应商变更时应重新对新供应商提供的原材料进行筛选验证。

（三） 生产管理环节

10

1. 人员：生产过程中的人员需经过充分的培训，并通过考核。

2. 设备/器具：生产过程中使用的设备/器具应在验证/校准合格期内，且与生产批量匹配，精准度应满足要求，并在生产一定周期后进行再确认。生产过程中使用的移液器应与生产批量相适应，首选量程相近的微量移液器。生产应配备有相应的计量器具并有校准标识。生产设备有明显的状态标识。

3. 物料：试剂盒生产时所使用的原材料应与设计开发输出的原材料要求一致，在规定的使用期限内使用，且经验收/检验符合原材料的技术指标。生产过程中主要原辅料应进行物料平衡，确认物料平衡限度的合理性。在生产过程中应实施物料平衡核算并记录，例如可利用公式【物料平衡率=（实际产量+抽样量+损耗量）/理论产量*100%】进行物料平衡核算。

4. 生产环境：

4.1. 根据产品的生产工艺要求，在相应的生产车间进行生产，生产聚合酶链反应（PCR）试剂的，其生产和检验应当在独立的建筑物或空间内进行，保证空气不直接联通，防止扩增时形成的气溶胶造成交叉污染。申报企业应建立防止人类基因组污染的制度，并有相应的验证方法。

4.2. 聚合酶链反应（PCR）试剂、质控品、酶类的配制、分装、点膜、干燥、切割以及内包装等，生产区域应当不低于100,000级洁净度级别。阴性或阳性血清、质粒或血液制品等的处理操作，生产区域应当不低于10，000级洁净度级别，并应当与相邻区域保持相对负压。

11

4.3. 应根据生产工艺特点对生产环境进行监测，并保存记录。人员进出、物料进出、人员穿着均应符合相应的要求。

5. 生产工艺：

根据设计开发输出的生产工艺规程进行生产，对于生产过程的关键控制点进行监控。重点关注工艺用水（纯化水）制水设备应满足用水要求，具有防止污染的措施，符合YY/T 1244-2014 体外诊断试剂用纯化水或《中华人民共和国药典》或GB/T 6682等的要求。

6. 标识：生产过程中应对设备、产品及其检验状态作出标识。

7. 追溯：生产过程中持续保持相关记录并符合可追溯性要求。

（四） 质量控制环节

1. 人员：检验过程中的人员需经过充分的培训，并通过考核。

2. 设备/器具：检验过程中使用的设备/器具应在验证/校准合格期内，且满足产品检验要求。

3. 检验要求：生产/检验用菌种的来源、验收、储存、保管、使用、销毁，应执行国家有关规定，菌种传代应有传代记录，操作者应熟悉菌种传代和接种方法。按照产品技术要求建立主要原材料、半成品及成品的检验规程，按批次保留检验记录，并具有可追溯性。产品技术要求、检验规程应尽可能满足或优于YY/T 1527-2017等相应法规标准要求。检测微生物限度需在万级无菌/微生物检验室、阳性对照间进行。

12

4. 不合格品控制：应当建立不合格品控制程序，对不合格品进行标识、记录、隔离、评审、处置。

5. 追溯：每批产品均应当有批检验记录，并满足可追溯要求；检验过程中使用的参考品应建立台账及使用记录，符合可追溯性要求。

6. 放行：应按产品放行审核程序的要求对产品进行放行管理。

7. 留样：应当根据产品和工艺特点制定留样管理规定，按规定进行留样，并保持留样观察记录。

（五） 分析与改进环节

地中海贫血基因检测试剂盒一直在不断创新和改进，基因诊断对于地贫确诊是必须的，是地贫携带者确诊的检测指标和进行高风险胎儿产前诊断的有效手段。鉴于地中海贫血成为我国长江以南各省发病率最高、影响最大的遗传病之一，地贫尚无有效的治疗方法，及时有效进行高风险胎儿的产前诊断，新生儿及时规范进行地贫筛查及基因检测。

1. 不良事件：应建立不良事件监测制度，规定可疑不良事件管理人员的职责、报告原则、上报程序、上报时限，启动实施医疗器械再评价的程序等内容。按规定开展不良事件监测活动并持续保持相关记录。

2. 纠正预防：应建立纠正预防措施程序，确定问题发生的根本原因，采取措施，纠正并预防问题的再次发生。

13

3. 召回：对存在安全隐患的医疗器械，应当按照有关法规要求采取召回等措施，并按规定向有关部门报告。

4. 设计更改：产品设计发生变更应符合生产企业的变更制度和国家法规要求。

5. 追溯：设计更改应保持记录并可溯源，并符合相关规定。

6. 内审及管理评审：应根据质量管理体系的要求进行内审或管理评审，确保质量管理体系的有效运行。

7. 当产品进行更新改进时，如地中海贫血基因检测试剂检测基因分型增加等，应进行评审或变更注册。

14