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(完整word版)谷氨酰胺合成酶活性测定

来源:华佗健康网
谷氨酰胺合成酶活性测定

原理 谷氨酰胺合成酶(GS)是植物体内氨同化的关键酶之一,在ATP 和M g 2+ 存在下,它催化植物体内谷氨酸形成谷氨酰胺。在反应体系中,谷氨酰胺转化为γ—谷氨酰基异羟肟酸,进而在酸性条件下与铁形成红色的络合物,该络合物在0nm 处有最大吸收峰,可用分光光度计测定。谷氨酰胺合成酶活性可用产生的γ—谷氨酰基异羟肟酸与铁络合物的生成量来表示,单位μmol·mg -1 protein·h -1 。也可间接用0nm 处吸光值的大小来表示,单位A·mg -1 protein·h -1 。 【仪器与用具】 冷冻离心机;分光光度计;天平;研钵;恒温水浴;剪刀;移液管(2 ml、1ml)。 【试剂】 提取缓冲液: 0.05mol/L Tris-HCl,pH8.0,内含2mmol/L Mg 2+ ,2mmol/L DTT,0.4 mol/L 蔗糖。称取Tris(三羟甲基氨基甲烷)1.5295g,0.1245g MgSO 4 ·7 H 2 O,0.13g DTT(二硫苏糖醇)和34.25g 蔗糖,去离子水溶解后,用0.05 mol/L HCl 调至pH8.0,最后定容至250ml; 反应混合液A(0.1mol/L Tris-HCl 缓冲,pH7.4): 内含80mmol/L Mg 2+ ,20mmol/L 谷氨酸钠盐,20mmol/L 半胱氨酸和2 mmol/L EGTA,称取3.0590g Tris,4.9795 gMgSO 4 ·7H 2 O, 0.8628g 谷氨酸钠盐,0.6057g 半胱氨酸,0.1920gEGTA,去离子水溶解后,用0. 1mol/L HCl 调至pH7.4,定容至250ml; 反应混合液B(含盐酸羟胺,pH7.4): 反应混合液A 的成分再加入80mmol/L 盐酸羟胺,pH7.4; 显色剂(0.2mol/L TCA, 0.37mol/L FeCl 3 和0.6mol/L HCl 混合液): 3.3176g TCA(三氯乙酸),10.1021g FeCl 3 ·6H 2 O,去离子水溶解后,加5ml 浓盐酸,定容至100ml; 40mmol/L ATP 溶液:0.1210g ATP 溶于5ml 去离子水中(临用前配制)。 【方法】 1.粗酶液提取 称取植物材料1g 于研钵中,加3ml 提取缓冲液,置冰浴上研磨匀浆,转移于离心管中,4℃下15,000g 离心20min,上清液即为粗酶液。 2.反应 1.6ml 反应混合液B,加入0.7ml 粗酶液和0.7ml ATP 溶液,混匀,于37℃下保温半小时,加入显色剂1ml,摇匀并放置片刻后,于 5,000g 下离心10min,取上清液测定0nm 处的吸光值,以加入1.6ml 反应混合液A 的为对照。 3.粗酶液中可溶性蛋白质测定 取粗

酶液0.5ml,用水定容至100ml,取2ml 用考马斯亮蓝G-250 测定可溶性蛋白质(见实验28)。 4.原始数据记载 5.结果计算: GS 活力(A·mg -1 protein·h -1 )= 式中 A—0nm 处的吸光值; P—粗酶液中可溶性蛋白含量(mg/ml); V—反应体系中加入的粗酶液体积(ml); T—反应时间(h)。

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