酶活性测定

河南理工大学本科毕业设计（论文）开题报告

题目名称 学生姓名 怀山药根际土壤酶活性测定 专业班级 学号 选题的目的和意义： 土壤中所进行的生物和生物化学过程是陆地生态系统功能的基础，这些过程之所以能够持续进行，得益于土壤中酶的作用。 酶是土壤生态系统代谢的一类重要动力，土壤中所进行的一切生物学和化学过程都要由酶的催化作用才能完成。 土壤酶是土壤微生物、植物根系和土壤中其他生物细胞产生的胞内酶和胞外酶的总称，其活性反映了土壤中各种生物化学过程的强度和方向，其中土壤过氧化氢酶、蔗糖酶、磷酸酶、脲酶、蛋白酶和多酚氧化酶活性之间的关系及总体活性对评价土壤肥力水平有重要意义。土壤中微生物种类、水气热状况、酸碱度、结构组成、养分丰缺、污染程度及培肥方式等都显著地影响着土壤酶活性，如在土壤表层脲酶活性较高，随着土壤剖面加深而降低；过氧化氢酶活性与作物根系距离越近，活性越小；离作物根系越远，活性越大；保护性耕作与传统耕作方式相比，对土壤的干扰较小，表土中的土壤酶活性较高。试验中，主要是通过根际土壤与非根际土壤酶的比较，研究根际生物对土壤酶活性的影响。 土壤酶主要来源于植物根系和微生物的活动，它参与各种生化反应和物质循环。根际微生物比根际外高得多，当微生物受到外界环境因素刺激时，便不断向外分泌酶，致使根际内外酶差异大。过氧化氢酶促进过氧化氢的分解，有利于防止它对生物体的毒害作用；蛋白酶活性表征根际有机质含量。多酚氧化酶活性表征根际土壤酚类等有毒物质积累。脲酶活性表征氨的供给情况，蔗糖酶活性表征有机质的多少。 二、国内外研究现状简述： 关于土壤酶的研究历史可以追溯到19世纪末Woods发现过氧化氢酶，并指出它来源于植物腐解。Kong、May和Gile曾正式测定过氧化氢酶的活性。1910年Fermi曾检测土壤中的蛋白酶和尚时已知的其它酶。以后脱氨基酶、磷酸酶和脲酶等相继被检测出来。19世纪50年代以后，由于植物和生物化学以及其它学科研究的进步，许多这方面的理论成果及方法等被引入土壤酶学的研究，从而加深了对土壤酶促反应方面的认识，开始应用土壤酶学方面的知识解决现代农业中出现的问题和环境问题。德国的Koepf H、苏联的Galstyan A sh、捷克斯洛伐克的Drobnik J等对土壤酶的研究均做出了重要的

贡献。一些国家成立了专门的土壤酶研究机构，对于土壤酶的来源、分布，土壤酶在土壤有机质中的转化和肥力形成中的作用及其用作判断土壤熟化程度的指标的可行性等方面进行了大量研究。现在土壤酶的研究已经超越了经典土壤酶学的研究范畴，在几乎所有的生态系统的研究中，土壤酶活性的检测几乎成了必不可少的测定指标。由于土壤酶活性与土壤的理化性质、土壤类型等密切相关，所以土壤酶活性一直以来被作为评价土壤生产力及土壤质量的指标而备受科研工作者的重视。土壤酶来源主要有三种途径：微生物、土壤动物、植物根系和植物残体。 许多微生物能产生胞外酶、在研究米曲霉时发现，各种酶是按一定顺序向介质中释放的。首先是糖酶和磷酸酶，而后是蛋白酶和酯酶，最后是过氧化氢酶、在生长的最初阶段能释放出一些酶；另一些酶则释放较迟，这时菌丝重量降低。但有趣的是在介质中发现的过氧化氢酶是游离态的，是典型的胞内酶。在合成的和自然的介质中，微生物对各类胞外酶的释放，科学工作者也进行了广泛的研究。Phaff在这方面取得了很好的成果。许多细菌和真菌都能释放淀粉酶、纤维素酶、果胶酶和蛋白酶。Jeuniaux证明了几丁质酶是在链霉菌胞外产生的。Meyer证明了镰刀霉可以释放磷酸酶和酯酶。 根系也可以分泌一些酶。Knudson和Smith发现了植物根分泌的淀粉酶；Rogers在玉米和番茄根分泌物中发现磷酸酶，在根中发现土壤核酸酶。 植物残体在分解的过程中也能够向土壤中释放酶，或者在分解的植物细胞组织中保持部分活性。有证据间接表明，提取所有可能来源于植物碎屑的酶很快地被分解，但能够促进土壤中微生物的生长。其它研究发现，当把新鲜玉米的根组织加入到土壤中，土壤呈现磷酸酶活性，但随后迅速降低并呈现蛋白酶活性。加入蒸汽灭菌的根能提高酸性磷酸酶的活性，这意味着对于直接提供土壤酸性磷酸酶，植物残体更多的是刺激微生物对酸性磷酸酶的合成。 土壤动物区系对土壤所提供的酶的数量很少有人研究。Kiss研究了蚯蚓对于转化酶活性的影响，并且指出，在草地和耕作土壤中，特别是在土壤表层，对提高转化酶的活性，蚯蚓的排泄物有重要的作用。Kozlov进一步的研究结果支持了Kiss的结论，即土壤动物确实在某种程度上对土壤酶的含量有作用。

三、毕业设计（论文）所采用的研究方法和手段： 1．研究手段： A、紫外分光光度计测定酶活性：DNS法制定葡萄糖标准曲线，茚三酮法制定甘氨酸标准曲线，邻苯三酚比色法制定重铬酸钾标准曲线。B、高锰酸钾滴定法 2．实验设计：（1）土壤中蔗糖酶活性测定：称5g风干土于50ml三角瓶中→加入15ml8%蔗糖溶液，5ml缓冲液，5滴甲苯→摇匀37℃恒温培养24h→过滤，取1ml滤液于50ml容量瓶中→加入3mlDNS试剂→沸水浴5min，冷却定容50ml→0nm比色→数据处理 （2）脲酶活性测定: 称5g风干土于50ml三角瓶中→加入1ml甲苯→15min后加10ml10%尿素液，20ml柠檬酸盐缓冲液→摇匀37℃恒温培养24h→过滤，取3ml滤液于50ml容量瓶中→加蒸馏水20ml，4ml苯酚钠溶液，3ml次氯酸钠溶液→20min后显色，定容50ml→578nm处比色→数据处理 （3）蛋白酶活性测定：称4g风干土于50ml三角瓶中→加入20ml1%酪素液，1ml甲苯→摇匀30℃恒温培养24h→加入0.1N硫酸和12ml20%硫酸钠溶液→离心15min（6000转/min）→取上清液2ml于50ml容量瓶中→500nm处比色→数据处理 （4）多酚氧化酶活性测定：称1g风干土于50ml三角瓶中→加入10ml1%邻苯三酚溶液→摇匀37℃恒温培养24h→加4ml柠檬酸-磷酸缓冲液，和35ml乙醚→萃取30min→乙醚相430nm处比色→数据处理 （5）过氧化氢酶活性测定：称2g风干土于100ml三角瓶中→注入40ml蒸馏水和 5ml0.3%过氧化氢→在往复式振荡机上振荡20min→加入3N硫酸→过滤，吸取25ml滤液，用0.1N高锰酸钾滴定至淡粉红色→数据处理 四、主要参考文献与资料获得情况： 1.陈慧，郝慧荣，熊君，齐晓辉，张重义 林文雄地黄连作对根际微生物区系及土壤酶活性的影响[期刊论文]-应用生态学报 2007(12) 2.郝慧荣，李振方，熊君，陈慧，张重义 林文雄连作怀牛膝根际土壤微生物区系及酶活性的变化研究[期刊论文]-中国生态农业学报 2008(2) 13.关松荫 土壤酶及其研究法 1986

4.孟立君 设施不同种植年限土壤酶活性及其与土壤肥力关系的研究 2004 5.马云华，王秀峰，魏珉，亓延凤，李天来 黄瓜连作土壤酚酸类物质积累对土壤微生物和酶活性的影响[期刊论文]-应用生态学报 2005(11) 6.吕卫光，沈其荣，余廷园，诸海涛 酚酸化合物对土壤酶活性和土壤养分的影响[期刊论文]-植物营养与肥料学报 2006(6) 7.王明道，吴宗伟，原增艳，陈红歌，吴坤，贾新成 怀地黄连作对土壤微生物区系的影响[期刊论文]-河南农业大学学报 2008(5) 8. 乔卿梅，程茂高，王新民，魏志华 怀山药根际土壤微生物、酶活性和酚酸物质变化及其关系研究 [中国农学通报] 2009 9.Morgan J A W.Bending G D.White P J Biological costs and benefits to plant-microbe interactions in the rhizosphere 2005 10.Ni G Y.Song L Y.Zhang J L Effects of root extracts of Mikania micrantha HBK on soil microbial community 2006(2) 五、毕业设计（论文）进度安排（按周说明）： 第4-5周：资料收集并撰写开题报告 第6—7周：研究方案的确定，包含实验处理的温度范围、处理时间和测定内容 第8—14周：实验处理和相关参数的测定 第15-16周：实验数据处理和撰写论文 六、指导教师审批意见（对选题的可行性、研究方法、进度安排作出评价，对是否开题作出决定）： 指导教师： （签名） 年 月 日

河南理工大学本科毕业设计（论文）中期检查表

指导教师： 于洪飞 职称： 实验师 所在院（系）： 资源环境学院 教研室（系、研究所） 生物技术系 题 目 学生姓名 专业班级 怀山药根际土壤酶活性测定 学号 一、进度情况说明： 目前已完成实验的前期准备工作，查阅、收集相关文献资料，确定研究方向和研究 内容；并完成实验耗材的准备工作；熟悉相关仪器的原理和操作说明，学习恒温培养箱 设定调节及分光光度计的正确使用。已经完成怀山药根际土壤中蔗糖酶活性的测定，正 在进行蛋白酶活性测定。总体上实验进行比较顺利。 二、阶段性成果： 1、毕业课题的确定、相关资料的收集和开题报告的撰写 2、实验相关耗材的订购：如茚三酮染色剂 3、实验仪器的操作：恒温培养箱设定调节及分光光度计的使用 4、实验设计和研究内容的确定 5、相关数据正在进行测定：如土壤中蔗糖酶活性的测定

三、存在的主要问题及解决方法： 存在的问题： 1、测定的吸光度值有偏差，导致标准曲线不太准确。 2、DNS试剂保存不超过七天，过氧化氢溶液要现配现用。 3、所需试剂太多，数据难处理。 解决方法： 1、配制溶液时，称量尽量准确；多做一重复比较分析。 2、注意试剂的配制时间，严格按照实验步骤进行实验。 3、配制试剂不能急于求成，要按部就班。 四、指导教师对学生在毕业设计（论文）中的纪律及毕业设计（论文）任务的完成进展等方面的评语 指导教师： （签名） 年 月 日