黑曲霉发酵生产壳聚糖的研究

塑基室　ｆ　）、…ｉ｝ｍ　７¨Ｉ　｛　㈨ｔ　、　黑曲霉发酵生产壳聚糖的研究　王成，母晓丹　（河南省化学工业学校，河南郑０＇Ｉ１　４５００４２）　摘要：研究了黑曲霉发酵生产壳聚糖的培养条件。通过单因素试验和正交试验分析，确定了最佳发　酵条件为：培养酵温度３０℃、ｐＨ值７．０、培养时间７２　ｈ、摇床转速２００　ｒ／ａｉｒｎ。最佳发酵条件下菌体干重达　２１．３８　ｍｇ／ｍＬ。通过电解法、酸碱交替处理提取壳聚糖，壳聚糖产率１３．７％，脱乙酰度８６．１％。　关键词：黑曲霉；发酵；壳聚糖；电解；甲壳素　Ｓｔｕｄｙ　ｏｎ　Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｃｈｉｔｏｓａｎ　ｂｙ　Ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　Ｎｉｇｅｒ　ＷＡＮＧ　Ｃｈｅｎｇ，　ＭＵ　Ｘｉａｏ－ｄａｎ　（Ｈｅｎａｎ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｉｎｄｕｓｔｒｙ　Ｓｃｈｏｏｌ，　Ｚｈｅｎｇｚｈｏｕ　４５００４２，Ｃｈｉｎａ）　Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｔｈｅ　ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ　ｏｆ　ｃｈｉｔｏｓａｎ　ｂｙ　ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｎｉｇｅｒ　ｗａｓ　ｓｔｕｄｉｅｄ．Ｔｈｒｏｕｇｈ　ｓｉｎｇｌｅ－ｆａｃｔｏｒ　ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ　ａｎｄ　ｏｒｔｈｏｇｏｎａｌ　ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ，Ｔｈｅ　ｏｐｔｉｍｕｍ　ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ　ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ　ｗｅｒｅ　ａｓ　ｆｏｌｌｏｗｓ：　ｔｈｅ　ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ　ｔｉｍｅ　ｗａｓ　７２　ｈ，　ｒｏｔａｔｅ　ｓｐｅｅｄ　ｏｆ　ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ　ｒｅａｃｔｉｏｎ　ｔａｂｌｅ　ｗａｓ　２００ｒ／ｍｉｎ，ｐＨ　ｖａｌｕｅ　ｗａｓ　７，ｔｈｅ　ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ　ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ　ｗａｓ　３０％．Ｕｎｄｅｒ　ｔｈｅ　ｏｐｔｉｍｕｍ　ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ　ｐｒｏｃｅｓｓ，ｔｈｅ　ｄｒｙ　ｃｅｌｌ　ｗｅｉｇｈｔ　ｃｏｕｌｄ　ｒｅａｃｈ　２　１．３８ｍｇ／ｍＬ．Ｗｈｅｎ　ｃｈｉｔｏｓａｎ　ｗａｓ　ｅｘｔｒａｃｔｅｄ　ｂｙ　ｅｌｅｃｔｒｏｌｙｓｉｓ　ａｃｉｄ—ｂａｓｅ　ｍｅｔｈｏｄ，ｉｔｓ　ｄｅａｃｅｔｙｌａｔｉｏｎ　ｄｅｇｒｅｅ　ｗａｓ　８６．１％．　ｙｉｅｌｄ　ｏｆ　ｃｈｉｔｏｓａｎ　ｗａｓ　１　３．７％．　Ｋｅｙ　ｗｏｒｄｓ：Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｎｉｇｅｒ；ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ；ｃｈｉｔｏｓａｎ；ｅｌｅｃｔｒｏｌｙｓｉｓ；ｃｈｉｎｔｉｎ　中图分类号：ＴＳ２４２　文献标识码：Ａ　文章编号：１００７—３５８２（２０１０）０２—００４６—０２　１２１℃灭菌２０　ｍｉｎ。　壳聚糖是一种天然高分子化合物，它不仅有很　好生物相溶性、吸附性、成膜性、通透性、吸湿性　和保湿性，而且无毒、易降解，因而可广泛应用于　农业、医药环保、纺织等领域。但是目前丁业生产　壳聚糖通常是在虾、蟹壳中提取，生产受季节、地　区等因素制约较大。因此，急需挖掘生产壳聚糖的　新方法。本研究采用黑曲霉发酵生产壳聚糖，确定　了在常用培养基中发酵生产壳聚糖的条件。　摇瓶培养基：去皮马铃薯２００　ｇ，切块煮沸过滤，　加葡萄糖２０　ｇ，加水至１　０００　ｍＬ，１２１％灭菌２０　ｍｉｎ。　１．３试验方法　（１）黑曲霉发酵。在斜面培养基接种黑曲霉，　３０　ｑＣ培养７２　ｈ后，制成孢子悬液（８　Ｘ　１０　个／ｍＬ）。　在５００　ｍＬ三角瓶中装入２００　ｍＬ培养液中，接种　ｌｍＬ孢子悬液，恒温摇床培养。　１材料与方法　１．１　菌种　将培养液离心，水洗，抽滤，得到湿菌体在　１０５℃烘干至恒重，测菌体干重。　（２）壳聚糖提取。将干菌体粉末加入１％一２％　的ＮａＯＨ溶液，电解制备甲壳素。甲壳素高温浓碱　处理后离心洗涤至中性。酸碱交替法进行后处理即　得壳聚糖产品。　黑曲霉（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　Ｎｉｇｅｒ），河南省化学＿Ｔ业　学校微生物实验室提供。　１．２培养基　斜面培养基：去皮马铃薯２００　ｇ，切块煮沸过　滤，加葡萄糖２０　ｇ，琼脂２０　ｇ，加水至１　０００　ｍＬ，　收稿日期：２０１０—０３—０ｌ　作者简介：王成（１９８０一），男，硕士；专业方向为生物工程　教学与科研工作。　４６　２　２　０辕劈流　接戒　（３）发酵条件优化。有试验表明，黑曲霉发酵　生产壳聚糖，壳聚糖占细胞干重的比例基本稳定，　因此采用菌体干重（生物量ＤＣＷ）作为指标，对　培养温度、ｐＨ值、培养时间、摇床转速这４个因　其它警　素进行单因素试验、正交试验和极差分析确定最佳　发酵条件。　表１培养条件因素水平　２结果与讨论　２．１　培养温度对产率的影响　设定摇床转速２００　ｄｒａｉｎ，在不同温度下培养　７２　ｈ，比较ＤＣＷ确定最佳培养温度，如图１所示。　表２培养条件优化正交试验结果及极差分析　由图１可知，ＤＣＷ随温度上升显著增加，当温　度达到３０￣Ｃ时，ＤＣＷ最大，随后ＤＣＷ随温度上升　而减少，选择最佳培养温度为３０￣Ｃ。　２－２　ｐＨ值对产率的影响　设定摇床转速２００　ｒ／ｍｉｎ，培养温度３０℃，比　较不同ｐＨ条件下培养７２　ｌ１的ＤＣＷ，如图２所示。　由图２可知，ｐＨ值５．０时，ＤＣＷ最大。因ｐＨ　值对壳聚糖脱乙酰度影响较大，ｐＨ值５．０～７．０的　ＤＣＷ差异不大，确定最适ｐＨ７．０。　由表２可知，各因素影响ＤＣＷ的顺序是Ｃ＞　Ａ＞Ｄ＞Ｂ，即培养时间＞温度＞转速＞ｐＨ值，最　佳培养条件为Ａ　Ｂ，Ｃ。Ｄ：，即培养温度３０℃、ｐＨ值　ｚＵ　ＺＺ　Ｚ４　ＺＯ　Ｈ　ｄＵ　３　４　５　６　７　８　温度／℃　ＤＨ　为７．０、培养时间７２　ｈ、摇床转速２００　ｒ／ｍｉｎ。　图１　培养温度对产率的影响　图２　ｐＨ对产率的影响　２．３培养时间对产率的影响　设定摇床转速２００　ｒ／ａｉｒｎ，　培养温度３０　，每　１２　ｈ测定ＤＣＷ，如图３所示。　３结论　试验结果表明，用马铃薯培养基培养黑曲　霉发酵生产壳聚糖的最佳工艺条件为：培养温　度３０℃、ｐＨ值７．０、培养时间７２　ｈ、摇床转速　２００　ｒ／ａｒｉｎ。该条件下可得菌体干重（生物量ＤＣＷ）　由图３可知，ＤＣＷ随培养时间的延长增加，培　养７２　ｈ后ＤＣＷ不再增加。最佳培养时间为７２　ｈ。　２．４摇床转速对产率的影响　为２１．３８　ｍｇ／ｍＬ。通过电解法、酸碱交替处理，壳　聚糖产率１３．７％，脱乙酰度８６．１％。　用黑曲霉发酵生产壳聚糖无毒、无污染，工艺　设定不同的摇床转速，在３０℃条件下培养　７２　ｈ，比较ＤＣＷ，如图４所示。　由图４可知，ＤＣＷ随摇床转速增大而增加，当　转速达到２００　ｒ／ｍｉｎ后ＤＣＷ无明显变化。确定最佳　转涑２００　ｒ／ｍｉｎ　简单，如能应用于规模生产前景可观。　参考文献：　［１］Ｊｏｚｅｆ　Ｓｙｎｏｗｉｅｃｋｉ，　Ｎａｄｉａ　Ａｌｉ，　Ａｂｄｕｌ　Ｑｕａｗｉ，　ｅｔ　ａ１．　Ｍｙｃｅｌｉａ　ｏｆ　Ｍｕｃｏｒ　ｒｏｕｘｉｉ　ａｓ　ａ　ｓｏｕｒｃｅ　ｏｆ　ｃｈｉｔｉｎ　ａｎｄ　ｃｈｉｔｏｓａｎ［Ｊ］．Ｆｏｏｄ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１９９７，６０（４）：６０５—６１０．　［２］曹健，代养勇，李浪，等．黑曲霉电解法制备甲壳素的　３　４　６　７　图３　ｐＨ对产率的影响　研究［Ｊ］．食品科学，２００６，２７（２）：１８６—１９２．　［３］李浪，　孙红文，王成．从柠檬酸生产废渣中提取壳聚　转速ｒ／ｍｉｎ　糖的研究［Ｊ］．粮食流通技术，２００４，（１）：４０—４２．　图４摇床转速对产率的影响　［４］王传芬，　姚兰，蒋文强，等．黑曲霉发酵法制备壳聚糖　Ｉｕｕ　Ｉｚｕ　Ｌ４Ｕ　ｌ０ｕ　ＬＯＵ　ｑｕ　２．５培养条件优化正交试验　以培养温度、ｐＨ值、培养时间、摇床转速为　因素进行Ｌ　（３　）正交试验，各因素水平见表１，　结果和极差分析见表２。　的研究［Ｊ］．食品工业，２００６，２７（３）：１５—１７．　［５］何灏彦，于津津．黑曲霉发酵生产壳聚糖的研究［Ｊ］．　化学与生物工程，２００９，２６（６）：８６—８７．　２　誊００擦静蔬通撞球４７