leica共聚焦显微镜使用说明

Step 1: 打开PC电源——“1”

Step 2: 打开汞灯控制开关——“2”

6.5 Step 3: 打开中控盒——“3”

Step 4: 打开计算机主机——“4”，启动计算机。

注：计算机操作系统启动后方可继续开机！！

Step 5: 顺序打开激光器电源Scanner—“5”，激光冷却系统LASER Ar/ArKr—“6”

6.5

★注：须确认冷风开启后方可打开激光电源！！！！！

Step 6: 将上图虚线框中激光功率控制旋钮——“6.5”顺时针旋转60°左右。

Step 7: 将上图所示488 nm激光管开关——“7”钥匙沿顺时针旋转约120°至显示灯亮，再将钥匙旋回竖直位置

Step 8: 依次将上图所示3/594 nm激光管开关——“8”和633 nm激光管开关——“9”钥匙沿顺时针旋转约90°至显示灯亮。

Step 9: 依次打开半导体激光器电源——

“10”和405 nm激光管开关——“11”， （“11”的开启方式同“8” 、“9”。）

Leica共聚焦显微镜关机顺序及注意事项 Step 1: 关闭软件→拷贝Data→关闭计算机 Step 2: 依照开机顺序倒序关闭各个开关，

由”11”→”7”, ”5”→”1”。

★注：

（1）冷风——”6”不能立即关闭！！须在关闭所有硬件设备30min后方可关闭，以使激光管完全冷却，延长使用寿命。 （2）PC电源——“1”须在电脑确定关闭后方可关闭！！

数据采集

Step 1: 实验前扫描样本片观察激光通路是否正常工作。 Step 2: 上样，须轻起轻落科勒照明系统，选择合适倍数物镜，通过FLUO键选择相应荧光通道，调节载物台和焦距，找到合适视野。 Step 3: 点击由Visual→Scan ，点击选择扫描模式，如xy, xyz,

xyt, xyzt, xyλ etc..点击选择扫描格式

（一般为默认值512*512）。 Step 4: 点击打开Beam path setting窗口，对光路和检测器进行设置。首先选择光路，如右图所示，标记“L”的参数设置为Leica初设，只能调取不能修改，双击所需激发光选项，通过下图窗口可对不同波长激发光强度进行设置(一般为默认值)。如紫外(UV)激发，须

将405nm激发光调节为ND80。 Leica共聚焦显微镜共有3个PMT检测器，分为PMT 1、PMT 2、PMT 3，分别接受不同范围发射光。选择好激发光后系统会自动选择PMT，通过调节滑块可以扩大PMT发射光接收范围。如下图右所示。 如需加入透射光图像，在下图红色方框圈中的空白

方格右击菜单中选择“Configuration” →“Gain PMT Trans”，并按上图左中勾选“Active”，同时将照明系统

上方旋钮由“Vis”→“Scan”即可。

Step 5: 光路和检测器设置好后，点击开始连续扫描，利用调节器旋钮(如下图)调节焦距和相应PMT电压找到最合适的图像，停止扫描，点击保存自定义参数设置至“User”中，以

便在下一次扫描时从User中直接调取。

若只标记一种荧光，即可将获得图片保存，保存方法：鼠标置于图像上，右击菜单“Send to”→“Experiment”→“Selection(raw)”；若需加入标尺，勾选“Display”栏中“Scale”选项并将鼠标置于图像上，右击菜单“Send to”→“Experiment”→“Selection(snap shot)”→“Save”存盘（见补充说明）。

通常标记多种荧光，可选择不同光路连续扫描获得不同荧光图像，采集图像时需将不同荧光表现在同一张图像中，可采用如下方法，点击弹出窗口“Sequential Scan settings”(如下图所示)，“Add”添加已保存的自定义光路参数设置到Setting窗口，“Mode”选择“between frames”，然后点击获得所有通道荧光图像， 点击可在屏幕上显示所有通道荧光图像以及所有标记荧光 叠加在一起的图像。图像保存方法同上。

补充说明：

(1)若信号较弱，背景值较高，可采用以下方法提高信噪比：  点击 点击 于 调节(2)通常

平滑图像，一般将值设为8；

调节对应PMT增益(Gain)和补偿(Offset)； “Ar/HeNe”窗口提高激发光强度，但要小于100%； 针孔直径，但不宜过大，通常默认值=1。 图像采集需要标尺，显示标尺的方法如下：

点击“Display”，勾选“Scale”即可。

(3)放大功能：如在扫描中需选取图像中一部分进行

放大，可点击然后点击椭圆工具或矩形工具截取需要放大的部分进行扫描。放大倍数可通过旋钮调节。

Leica共聚焦显微镜常用工具简介

调节器旋钮(如下图)说明：

PMT 1，PMT 2，PMT 3：可分别调节三个检测器电压； PMT Trans：调节明场成像电压； Pinhole：调节针孔直径

Zoom：调节放大倍数 (灵敏度= 0.01) Z Pos：调节焦距 (Z轴) Leica共聚焦显微镜软件控制面板:

采图 → 显示 → 3D → 处理 → 定量 → 注解

常用图标说明：

切换不同倍数物镜 左击

选择Visual→镜下观察，Scan→切换至电脑扫描

点击弹出Beam Path Setting，用于光路和检测器参数设定

连续扫描 (边扫边调，扫描中新图像会覆盖原图)

系列扫描 ，得到样品图像 注：Series前应进行连续扫描设置好扫描

参数

单次扫描：记录样品中某个光学切片的单张图像，主要用于对光敏感的样品。

Beam Path Setting: 光路和检测器参数设定

上图右上角窗口双击鼠标可设置荧光通路。标记“L”的参数设置为

leica初设，只能调取不能修改，标记“U”为用户自定义参数设置，可被更改。

常用图标说明：

扫描模式 (xy, xyz, xyt, xyzt, xyλ etc.)

扫描格式 (左击选择阵列数点，最大2048*2048)

电子变焦(左击选择1× - 32×)

放大显示图像中任意区域

共焦针孔(设置检测光孔直径，默认值=1)

设置检测器参数(Gain：控制信号强度；Offset：决定信号阈值)

多光路组合成像(Add多个光路同时成像)

保存自定义参数设置，在下一次扫描时从User中直接调取

明场设置

负责人：杨晚竹、陈婷