草莓psy、pds和zds基因融合植物表达载体的构建

福建农林大学学报（自然科学版）　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｆｕｊｉａｎ　Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ　ａｎｄ　Ｆｏｒｅｓｔｒｙ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ（Ｎａｔｕｒａｌ　Ｓｃｉｅｎｃｅ　Ｅｄｉｔｉｏｎ）　第４２卷第４期　２０１３年７月　草莓ｐｓｙ、ｐｄｓ和ｚｄｓ基因融合植物表达载体的构建　朱海生　，陈敏氡　，温庆放　（１．福建省农业科学院作物研究所；２．福建省农业科学院蔬菜研究中心，福建福州３５００１３；３．福建省　蔬菜工程技术研究中心，福建福州３５００１３；４．福建农林大学园艺学院，福建福州３５０００２）　摘要：根据草莓ｐｓｙ．ｐａｌｓ和础基因序列，设计含有酶切位点的特异引物，以草莓总ＲＮＡ为模板，通过ＲＴ．ＰＣＲ法分别克隆　￣ｙ，ｐｄｓ和础基因．以植物表达载体ｐＢＩ１２１为基础，利用口蹄疫病毒２Ａ序列将ｐｓｙ，ｐｄｓ和　基因融合在同一个开放阅读　框下，构建成三价融合植物双元表达载体ｐＢＩ２Ａ２Ａｐｓｙ－ｐｄｓ－ｚｄｓ．同时构建了ｐｓｙ和础基因二价融合植物表达载体　ｐＢＩ２Ａ２Ａｐｓｙ－ｚｄｓ．经ＰＣＲ、限制性内切酶酶切和测序鉴定后，成功将２个重组表达质粒ｐＢＩ２Ａ２Ａｐｓｙ－ｐｄｓ－ｚｄｓ和ｐＢＩ２Ａ２Ａｐｓｙ－ｚｄｓ　导人农杆菌ＥＨＡ１０５中．　关键词：草莓；ｐｓｙ；ｐ凼；ａｄｓ；表达载体　中图分类号：￥６６８．４　文献标识码：Ａ　文章编号：１６７１－５４７０（２０１３）０４－０３９１－０７　Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ　ｏｆ　ｐｌａｎｔ　ｂｉｎａｒｙ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｖｅｃｔｏｒ　ｏｆ　ｐｓｙ，ｐｄｓ　ａｎｄ　ｚｄｓ　ｇｅｎｅｓ　ｆｒｏｍ　ｓｔｒａｗｂｅｒｒｙ　ＺＨＵ　Ｈａｉ—ｓｈｅｎｇ　・　，ＣＨＥＮ　Ｍｉｎ—ｄｏｎｇ　，ＷＥＮ　Ｑｉｎｇ—ｆａｎｇ　・　，。　（１．Ｃｒｏｐｓ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ　Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，Ｆｕｊｉａｎ　Ａｃａｄｅｍｙ　ｏｆ　Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ　Ｓｃｉｅｎｃｅｓ；２．Ｖｅｇｅｔａｂｌｅ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ　Ｃｅｎｔｅｒ，Ｆｕｊｉａｎ　Ａｃａｄｅｍｙ　ｏｆ　Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ　ｃｉＳｅｎｃｅｓ，Ｆｕｚｈｏｕ，Ｆｕｊｉａｎ　３５００１３，Ｃｈｉｎａ；３．Ｆｕｊｉａｎ　Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ　Ｃｅｎｔｅｒ　ｆｏｒ　Ｖｅｇｅｔａｂｌｅｓ，Ｆｕｚｈｏｕ，Ｆｕｊｉａｎ　３５００１３，Ｃｈｉｎａ；４．Ｃｏｉｆｅｇｅ　ｏｆ　Ｈｏｒｔｉｃｕｌｔｕｒｅ，Ｆｕｊｉａｎ　Ａ　ｃｕｌｔｕｒｅ　ａｎｄ　Ｆｏｒｅｓｔｒｙ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｙ，Ｆｕｚｈｏｔｕ，Ｆｕｊｉａｎ　３５０００２，ＣＨｎａ）　Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｓｐｅｃｉｉｃ　ｐｒｉｆｍｅｒｓ　ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ　ｄｉｆｅｒｅｎｔ　ｅｎｚｙｍｅ　ｓｉｔｅｓ　ｗｅｒｅ　ｄｅｓｉｇｎｅｄ　ｏｎ　ｔｈｅ　ｂａｓｉｓ　ｏｆｐｓｙ，　ｂｅｒｒｙ．Ｗｉｈ　ｔｈｅ　ｔｅｍｐｌａｔｔｅ　ｏｆｔｏｔａｌ　ＲＮＡ，ｐｓｙ，　ａｎｄ　ｚｄｓ　ｇｅｎｅｓ　ｓｅｑｕｅｎｃｅ　ｏｆ　ｓｔｒａｗ－　ａｎｄ　ｚｄｓ　ｇｅｎｅｓ　ｗｅｒｅ　ａｍｐｌｉｉｆｄ　ｂｙ　ＲＴ—ＰＣＲ．Ｂａｅｓｅｄ　ｏｎ　ｔｈｅ　ｖｅｃｔｏｒ　ｏｆ　ｐＢＩ１２１，ｔｈｅ　ｔｒｉ－　ｖａｌｅｎｔ　ｐｌａｎｔ　ｅｘｐｒｅｓｓ　ｖｅｃｔｏｒ　ｐＢＩ２Ａ２Ａｐｓｙ－ｐｄｓ—ｚｄｓ　ｃｏｎｔｉｎａｉｇｐｓｎｙ，　ｎｄ　ａｚｄｓ　ｇｅｎｅｓ　ｎｄ　ｅｄ　ａｉｎ　ａ　ｓｉｎｇｌｅ　ｏｐｅｎ　ｅａｄｉｒｎｇ　ｆｒａｍｅ（ＯＲｒ）　ｂｙ　ｆｏｏｔ　ａｎｄ　ｍｏｕｔｈ　ｄｉｓｅａｓｅ　ｖｉｒｕｓ（ＦＭＤＶ）Ｗａｓ　ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｄ．Ｉｅｎ　ａｄｄｉｔｉｏｎ，ｔｈｅ　ｉｖａｌｄｅｎｔ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｖｅｃｔｏｒ　ｐＢＩ２Ａ２Ａｐｓｙ－ｚｄｓ　ｃｏｎｔａｉｉｎｇ　ｎｐｓｙ　ａｎｄ　ｚｄｓ　ｇｅｎｅｓ　Ｗａｓ　ａｌｓｏ　ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｅｄ．Ｖｅｃｔｏｒｓ　ｏｆ　ｐＢＩ２Ａ２Ａｐｓｙ－ｐｄｓ－ｚｄｓ　ａｎｄ　ｐＢＩ２Ａ２Ａｐｓｙ－ｚｄｓ　ｗｅｒｅ　ｃｈｅｃｋｅｄ　ｂｙ　ＰＣＲ．ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ朗・　ｚｙｍｅ８　ａｎａｌｙｓｉｓ　ｎｄ　ａｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ，ａｎｄ　ｔｒａｎｓｆｏｒｍｅｄ　ｉｎｔｏ　Ａｇｒｏｂａｃｔｒ／ｕｍ　ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ　ＥＨＡ　１０５．　Ｋｅｙ　ｗｏｒｄｓ：ｓｔｒａｗｂｅｒｒｙ；ｐｓｙ；　；ｚｄｓ；ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｖｅｃｔｏｒ　生物体内的代谢途径常常涉及多步反应，需要２个或多个酶共同催化．多基因组装与转化技术的诞生　使多个目的基因被导人植物基因组中，并可以在植物中表达¨工］．其策略之一是构建多基因融合植物表达　载体，把多个功能基因直接首尾相连或利用一些序列连接各个基因，使多个基因置于同一调控系统中，通　过一次转化将多个基因转入植物基因组，从而获得多价基因协同表达的转基因植物　．　在构建多基因融合表达载体时，需要在不同的基因之间加入连接肽，以避免不同蛋白之间产生空间位　阻，抑制其它蛋白的折叠或活性．口蹄疫病毒ＦＭＤＶ（ｆｏｏｔ．ａｎｄ—ｍｏｕｔｈ　ｄｉｓｅａｓｅ　ｖ／ｒｕｓ）２Ａ序列是目前比较常用　的连接肽，由２Ａ连接的多基因，不需要任何蛋白酶的参与，便可在第ｌ９个氨基酸（Ｇ）和第２０个氨基酸　（Ｐ）之间发生剪切，从而将多聚蛋白“切割”成不同的功能蛋白　】．通过２Ａ序列融合多基因在一个开放　阅读框下，可在共表达时发挥其各自基因的功能作用，目前已经广泛应用于各类生物研究　．　草莓（Ｆｒａｇａｒｉａ　ａｎａｎａｓｓａ　Ｄｕｃｈ）是一种经济价值较高的保健水果，属果中之上品，素有“水果皇后”之　称．草莓中含有较丰富的类胡萝卜素¨　．八氢番茄红素合成酶（ｐｈｙｔｏｅｎｅ　ｓｙｎｔｈａｓｅ，ＰＳＹ）、八氢番茄红素去　饱和酶（ｐｈｙｔｏｅｎｅ　ｄｅｓａｔｕｒａｓｅ，ＰＤＳ）和‘一胡萝卜素脱氢酶（－ｃａｒｏｔｅｎｅ　ｄｅｓａｔｕｒａｓｅ，ＺＤＳ）是类胡萝卜素生物合　成过程的关键酶¨引．本研究成功克隆了草莓果实类胡萝卜素生物合成途径重要基因ｐｓｙ、ｐ　和　收稿日期：２０１２—０９—０６　修回日期：２０１２—１１一ｌ２　基金项目：国家自然科学基金项目（３１１０１５３４）；福建省自然科学基金项目（２０１０Ｊ０１１１）；福建省农业科学院科技创新团队重点科研项目　（ＣＸＴＤ２０１１－２０）资助．　作者简介：朱海生（１９７８一），男，博士．研究方向：园艺植物分子生物学．Ｅｍａｉｌ：Ｏｖｒｃ＠１６３．ｃｏｎｒ．　・３９２・　福建农林大学学报（自然科学版）　第４２卷　ｚｄｓ【１７，１８，１９］对植物表达载体ｐＢＩ１２１进行含有２个２Ａ序列的多酶切位点改造，构建了嵌合类胡萝卜素生　，物合成的３个关键酶基因ｐｓｙ、ｐｃｆｓ和ｚ　三价的植物表达载体及嵌合ｐｓｙ和ｚｄｓ基因二价植物表达载体．并　且在已建立的高效稳定的草莓离体再生体系　和遗传转化体系　的基础上转化草莓，为进一步研究草　莓类胡萝卜素生物合成途径中各种代谢酶的调控功能以及类胡萝卜素积累特点和代谢机制奠定分子基础．　１材料与方法　１．１材料　１．１．１植物材料供试植物材料为草莓（Ｆｒａｇａｒｉａ　ｏＭ栅ｓ口Ｄｕｃｈ），品种为“丰香”．　１．１．２菌株和质粒大肠杆菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ）ＤＨ５ａ、根癌农杆菌（Ａｇｒｏｂａｃｔｒｉｕｍ　ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）ＥＨＡ１０５及　植物表达载体ｐＢＩ１２１为本实验室保存．ｐＭＤ１８－Ｔ　ｓｉｍｐｌｅ载体购于大连宝生物公司．　１．１．３酶与化学试剂ＢａｍＨ　Ｉ、Ｘｂａ　Ｉ、　Ｉ、　ｎ　Ｉ等限制性内切酶，Ｔａｑ　ＤＮＡ　Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ，Ｔ４ＤＮＡ连接　酶，ｄＮＴＰｓ，ＤＮＡ　ＭａｒｋｅｒＤＬ２０００和Ａ一　Ｔ１４　Ｉ　ｄｉｇｅｓｔ购于大连宝生物公司．胶回收试剂盒和质粒提取试剂　盒购于Ｏｍｅｇａ公司，其他生化试剂和常规试剂均为超纯或分析纯．　１．２方法　１．２．１　草莓总ＲＮＡ的提取与反转录ｃＤＮＡ第一链．　采用百泰克公司通用植物总ＲＮＡ提取试剂盒方法提取草莓总　ＲＮＡ．按大连宝生物有限公司的ＰｒｉｍｅＳｅｒｉｐｔＴＭ　Ｉｓｔ　Ｓｔｒａｎｄ　ｃＤＮＡ　Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ　Ｋｉｔ试剂盒（Ｄ６１１０Ａ）的方法合成　１．２．２　引物设计与２Ａ序列的合成　根据　本实验室克隆的草莓果实类胡萝卜素生物　合成途径重要基因ｐｓｙ、ｐ　、ｚｄｓ（ＧｅｎＢａｎｋ　登录号分别为Ｆｊ７８４８８９．１、ＦＪ７９５３４２．１、　表１引物序列及ＰＣＲ扩增基因片段　Ｔａｂｌｅ１　Ｐｒｉｍｅｒ　ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ　ａｎｄ　ＰＣＲ　ａｍｐｌｉｉｅｄ　ｇｅｎｅｆｒｆａｇｍｅｎｔｓ　ＦＪ７９５３４３．１）ｃＤＮＡ全长序列，并结合　ｐＢＩ１２１载体上的酶切位点分别设计３对　引物（表１），其中ｐｓｙ和ｐ　基因不包括终　止密码子．　分析合成含有口蹄疫病毒２Ａ序列的　多酶切位点序列，命名为ｐＭＤ１８－２Ａ２Ａ，序列为：，Ｉ１＇Ａ　ＴＣＴ　ＡＧＡ　ＧＧＣ　ＧＣＣ　ＣＣＧ　ＣＧＧ　ＧＧＡ　ＴＣＣ　垒　ＴｒＧ　ＡＡＴ　ＴＩ－Ｉ＇ＧＡＣ　ＣＴＴ　ＣＴＴ　ＡＡＧ　ＣＴＴ　ＧＣＧ　ＧＧＡ　ＧＡＣ　ＧＴＣ　ＧＡＧ　ＴＣＣ　ＡＡＣ　ＣＣＴ　ＧＧＧ　ＣＣＣ　ＧＴＣ　ＧＡＣ　ＣＧＡ　ＴＣＧ　ＣＴＣ　ＧＡＧ　ＣＡＧ　ＣＴＧ　ＴＩＩＧ　ＡＡＴ　Ｔｒｒ　ＣＡＣ　ＣＴＴ　ＣＴＴ　ＡＡＧ　ＣＴＴ　ＧＣＧ　ＧＧＡ　ＧＡＣ　ＧＴＣ　ＧＡＧ　ＴＣＣ　ＡＡＣ　ＣＣＴ　ＧＧＧ　ＣＣＣ　ＴＧＴ　ＡＣＡ　ＣＧＧ　ＣＣＧ　ＧＧｒＴ　ＡＣＣ　ＧＡＧ　ＣＴＣ　Ｇ（Ｘｂａ　Ｉ＋Ｈａｅ　ＩＩ＋ＳａｃⅡ＋ＢａｍＨ　Ｉ＋２Ａ＋Ｓａｌ　Ｉ＋Ｐｖｕ　Ｉ＋Ｘｈｏ　Ｉ＋２Ａ＋Ｂｓｐｌ４０７　Ｉ＋Ｘｍａ１１Ｉ（Ｅｃｏ５２　Ｉ）＋　ｎ　Ｉ＋Ｓａｃ　Ｉ，下划线部分为２Ａ序列）．　１．２．３　目的片段的克隆根据设计的引物，克隆草莓ｐｓｙ、ｐ　和ｚｄｓ的ＯＲＦ，ＰＣＲ产物用凝胶回收试剂盒　回收，与ｐＭＤ１８一Ｔ　ｓｉｍｐｌｅ载体连接．挑取白色菌落，用质粒提取试剂盒抽提质粒，经ＰＣＲ和双酶切鉴定，送　Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ公司测序．重组质粒分别命名为ｐＭＤ１８－ｐｓｙ、ｐＭＤ１８－ｐｄｓ和ｐＭＤ１８－ｚｄｓ．　１．２．４植物表达载体ｐＢＩ１２１改造对ｐＢＩ１２１进行含有２Ａ序列的多克隆位点改造，将ｐＭＤ１８－２Ａ２Ａ和　ｐＢＩ１２１分别进行Ｘｂａ　Ｉ和Ｓａｃ　Ｉ双酶切，酶切结束后进行目的片段的回收和连接，转化大肠杆菌ＤＨ５ａ感　受态细胞，随机筛选白色菌落，然后进行摇菌培养，提取质粒后进行酶切鉴定，命名为ｐＢＩ２Ａ２Ａ．　１．２．５　ｐｓｙ和ｚｄｓ二价融合表达载体的构建质粒ｐＭＤ１８－ｐｓｙ经限制性内切酶Ｘｂａ　Ｉ和ＢａｍＨ　Ｉ消化后，　从胶中回收片段约１２００　ｂｐ，与经Ｘｂａ　Ｉ和ＢａｍＨ　Ｉ消化的质粒载体ｐＢＬ２Ａ２Ａ回收的大片段经Ｔ４ＤＮＡ连　接酶连接，对重组质粒进行酶切鉴定，命名为ｐＢＩ２Ａ２Ａｐｓｙ．　质粒ｐＭＤ１８－ｚｄｓ经限制性内切酶Ｂｓｐｌ４０７　Ｉ和ｒｐｎ　Ｉ消化后，从胶中回收片段约１７００　ｂｐ，与经　Ｂｓｐｌ４０７　Ｉ和Ｋｐｎ　Ｉ消化的质粒载体ｐＢＩ２Ａ２Ａｐｓｙ回收的载体大片段经Ｔ４ＤＮＡ连接酶连接，对重组质粒进　行ＰＣＲ、酶切和测序鉴定，构建成ｐｓｙ和施　二价表达载体ｐＢＩ２Ａ２Ａｐｓｙ－ｚｄｓ．　１．２．６　ｐｓｙ、ｐｄｓ和ｚｄｓ三价融合表达载体的构建质粒ｐＭＤ１８－ｐｄｓ经限制性内切酶Ｓａｌ　Ｉ和Ｘｈｏ　Ｉ消化后，　第４期　朱海生等：草莓ｐｓｙ，ｌ￣ｓ和础基因融合植物表达载体的构建　・３９７・　＝Ｉ　［４］ＷＡＮＧ　Ｓ　Ｈ，ＹＡＯ　Ｑ　Ｈ，ＴＡＯ　Ｊ　Ｍ，ｅｔ　１ａ．Ｃｏ－ｏｒｄｉｎａｔｅ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｏｆｇｌｙｅｉｎｅ　ｂｅｔａｉｎｅ　ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ　ｇｅｎｅｓ　ｌｉｎｋｅｄ　ｂｙ　ｈｔｅ　ＦＭＤＶ　２Ａ　ｒｅ．　ｇｉｏｎ　ｉｎ　ａ　ｓｉｎｓｌｅ　ｏｐｅｎ　ｅｒａｄｉｎｇ　ｆｒａｍｅ　ｉｎ　Ｐ／ｃｈ／ａｐａｓｔｏｒｉｓ［Ｊ］．Ａｐｐｌ　Ｍｉｅｎ）ｂｉｄ　Ｂｉｏｔｅｅｈｎｏｌ，２００７，７７（４）：８９１—８９９．　［５］ＲＹＡＮ　Ｍ　Ｄ，ＤＲＥＷＪ．Ｆｏｏｔ－ａｎｄ－ｍｏｕｔｈ　ｉｄｓｅａｓｅ　ｖｉｒｕｓ　２Ａ　ｏｌｉｇｏｐｅｐｔｉｄｅ　ｍｅｄｉａｔｅｄ　ｃｌｅａｖａｇｅ　ｆａｏｎ　ａｒｔｉｉｆｃｉａｌ　ｐｏｌｙｐｒｏｔｅｉｎ［Ｊ］．ＥＭＢＯ　Ｊ，１９９４（１３）：９２８—９３３．　［６］ＳＴＥＷＡＲＴ　Ｍ　Ｄ，ＪＡＮＧ　Ｃ　Ｗ，ＨＯＮＧ　ＮＷ，ｅｔ　ａ１．Ｄｕａｌ　ｌｆｕｏｒｅｓｃｅｎｔ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｒｅｐｏｒｔｅｒｓ　ｆｏｒ　ｓｔｕｄｙｉｎｇ　ｃｅｌｌ　ｂｅｈａｖｉｏｒｓ　ｉｎ　ｖｉｖｏ［Ｊ］．　Ｇｅｎｅｓｉｓ，２００９，４７：７０８—７１７．　［７］ＳＵＺＵＬＩ　Ｎ，ＧＥＬＥＴＫＡ　ＬＭ，ＮＵＳＳ　ＤＬ．Ｅｓｓｅｎｔｉｌａ　ｎｄ　ａｉｓｄｅｎｓｐａｂｌｅ　ｖｉｒｕｓ　ｅｎｃｏｄｅｄ　ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ　ｅｌｅｍｅｎｔｓ　ｒｅｖｅａｌｅｄ　ｂｙ　ｅｆｆｏｒｔｓ　ｔｏ　ｄｅ－　叩ｈｙｐｏｖｉｒｕｓｅｓ　ｓａ　ｇｅｎｅ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｖｅｃｔｏｒｓ［Ｊ］．Ｊ　ｖｊｍ】，２０００，７４：７５６８—７５７７．　［８］ＶＡＲＮＡＶＳＫＩＡＮ，ＹＯＵＮＧＰＲ，ＫＨＲＯＭＹＫＨＡＡ．Ｓｔａｂｌｅ　ｈｉ＃．１ｅｖｅｌ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｏｆｈｅｔｅｎ）ｌｏｇｏｕｓ　ｇｅｎｅｓｉｎ　ｉｔ）ａｎｎｄｉｎ口ｉｖｏ　ｂｖ　ｎｏｎｅｙｔｏｐｏｔｈｉｅ　ＤＮＡ—ｂａｓｅｄ　Ｋｕｎｊｉｎ　ｖｉｒｕｓ　ｒｅｐｌｉｃｏｎ　ｖｅｃｔｏｒｓ［Ｊ］．ＪⅥｍｌ，２０００，７４：４３９４—４４０３．　［９］ＷＡＮＧ　ＳＨ，ＹＡＯＱＨ，ＴＡＯ　ＪＭ，ｅｔ　ａ１．Ｃｏ－ｏｒｄｉｎａｔｅ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｏｆ咖ｉｎｅ　ｂｅｔａｉｎｅ　ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ　ｇｅｎｅｓｌｉｎｋｅｄ　ｂｙｔｈｅＦＭＤＶ２Ａ　ｒｅ．　ｓｉｏｎ　ｉｎ　ａ　ｓｉｎｇｌｅ　ｏｐｅｎ　ｒｅａｄｉｎｇ　ｆｒａｍｅ　ｉｎ　Ｐ／ｃｈｈｔｐａｓｔｏｒ／ｓ［Ｊ］．Ａｐｐｌ　Ｍｉｅｎ）ｂｉｄ　Ｂｉｏｔｅｅｈｎｏｌ，２００７，７７：８９１—８９９．　ＭＡ　Ｃ　Ｌ，ＭＩＴＢＡ　Ａ．Ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ　ｍｕｌｔｉｐｌｅ　ｇｅｎｅｓ　ｉｎ　ａ　ｓｉｎｇｌｅ　ｏｐｅｎ　ｒｅａｄｉｎｇ　ｆｒＲｍｅ　ｗｉｔｈ　ｔｈｅ　２Ａ　ｒｅｇｉｏｎ　ｏｆｆｏｏｔ．ａｎｄ．ｍｏｕｔｈ　ｄｉｓｅａｓｅ　［１０］　ｖｉｒｕｓ　ｓａ　ａｌｉｋｅｒ［Ｊ］．Ｍｏｎ１．Ｂｒｅｅｄ，２００２（９）：１９１—１９９．　ＡｂｌＲＡＮＩ　ＡＥ，ＢＡＲＡＫＡＴＥＡ，ＡＳＫＡＲＩＢＭ，ｅｔａ１．Ｃｏｏｒｄｉｎａｔｅ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ａｎｄｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ　ｓｕｂｅｅｌｌｕ］ａｒｔａｒｇｅｔｉｎｇｏｆｍｕｌｉｔｐｌｅ　［１１］　ｐｒｏｔｅｉｎｓ　ｆｒｏｍ　ａ　ｓｉｎｇｌｅ　ｔｒａｎｓｇｅｎｅ［Ｊ］．Ｐｌａｎｔ　ｐｐｈｙｓｉｏｌ，２００４，１３５：１６—２４．　ＨＡＬＰＩＮ　Ｃ，ＣＯＯＫＥ　ＳＥ，ＢＡＲＡＬＡＴＥＡ。ｅｔ　ａ１．Ｓｅｌｆ－ｐｎ）ｅｅｓｓｉｎｇ２Ａ－ｐｏｌｙｐｎ）ｔｅｉｎｓ－ａ　ｓｙｓｔｅｍｆｏｒ　ｃｏ—ｏｒｄｉｎａｔｅ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆｍｕｌｔｉ－　［１２］　ｐｉｅ　ｐｒｏｔｅｉｎｓ　ｉｎ　ｔｎｍｓｇｅｎｉｅ　ｐｌａｎｔｓ［Ｊ］．Ｐｌａｎｔ　Ｊ，１９９９，１７（４）：４５３—４５９．　ＦＲＡＮＣＯＩＳ　Ｉ　Ｅ　Ｊ　Ａ，ＶＡＮ　ＨＥＭＥＬＲＩＪＣＫ　Ｗ，ＡＥＲＴＳ　Ａ　Ｍ．Ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ　ｉｎ　Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ　ｔｈａｌｉａｎａ　ｏｆ　ａ　ｈｅｔｅｎ）ｌｏｇｏｕｓ　ｐｏｌｙｐｒｏｔｅｉｎ　［１３］　ｅｓｒｕｌｉｔｎｇ　ｉｎ　ｄｉｆｅｅｎｔｒｉｌａ　ｔａｒｇｅｔｉｎｇ　ｆｔｏｈｅ　ｉｎｄｉｖｉｄｕａｌ　ｐｌａｎｔ　ｄｅｆｅｎｓｉｎｓ［Ｊ］．Ｐｌａｎｔ　Ｓｃｉｅｎｃｅ，２ＯＯ４（１６）：１１３—１２１．　［１４］　张计育，王三红，乔玉山，等．湖北海棠二价融合表达载体ＭｈＴ２ＡＣ的构建及转化烟草耐盐性分析［Ｊ］．园艺学报，　２０１２，３９（１）：１—１２．　宋新娜，汪之顼．美国的食物类胡萝卜素含量数据［Ｊ］．国外医学卫生学分册，２００７，３４（３）：１８２—１８７．　黄彬城，季静，王罡，等．植物类胡萝卜素的研究进展［Ｊ］．天津农业科学，２００６，１２（２）：１３—１７．　朱海生，李永平，温庆放．草莓八氢番茄红素合成酶基因的克隆及其表达特性［Ｊ］．中国农业科学，２０１１，４４（２）：３４９—３５７．　朱海生，李永平，温庆放，等．草莓八氢番茄红素脱氢酶基因ｐ出的克隆及特征分析［Ｊ］．园艺学报，２０１１，３８（１）：５５—６０．　李永平，朱海生，温庆放，等．草莓‘－胡萝卜素脱氢酶基因ＺＤＳ的克隆及特征分析［Ｊ］．热带亚热带植物学报，２０１０，ｌ８　（６）：６７０～６７４．　朱海生，潘东明，林义章，等．草莓高频离体再生体系的研究［Ｊ］．西北植物学报，２００７，７（５）：８５９—８６３．　朱海生，潘东明，林义章，等．根癌农杆菌介导草莓遗传转化研究［Ｊ］．核农学报，２００８，２２（１）：３６—４０．　朱长甫，陈星，王英典．植物类胡萝卜素生物合成及其相关基因在基因工程中的应用［Ｊ］．植物生理与分子生物学学　报，２００４，３０（６）：６０９—６１８．　‘　ＦＲＡＳＥＲ　ＰＤ，ＴＲＵＥＳＤＡＬＥ　Ｍ　Ｒ，ＢＩＲＤ　Ｃ　Ｒ，ｅｔ　ａ１．Ｃａｒｏｔｅｎｏｉｄ　ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ　ｄｕｒｉｎｇ　ｔｏｍａｔｏ　ｆｒｕｉｔ　ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ：Ｅｖｉｄｅｎｃｅ　ｆｏｒ　ｉｔｓｓｕｅ－ｓｐｅｃｉｉｆｃ　ｇｅｎｅ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ［Ｊ］．Ｐｌａｎｔ　Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ，１９９４，１０５：４０５—４１３．　ＳＨＥＷＭＡＫＥＲ　Ｃ　Ｋ，ＳＨＥＥＨＹ　Ｊ　Ａ，ＤＡＬＥＹ　Ｍ，ｅｔ　ａｔ．Ｓｅｅｄ　ｓｐｅｃｉｉｆｃ　ｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｏｆｐｈｙｔｏｅｎｅ　ｓｙｎｔｈａｓｅ：ｉｎｃｒｅａｓｅ　ｉｎ　ｃａｒｏｔｅ—　ｎｏｉｄｓ　ａｎｄ　ｏｔｈｅｒ　ｍｅｔａｂｏｌｉｃ　ｅｆｆｅｃｔｓ［Ｊ］．Ｔｈｅ　Ｐｌａｎｔ　Ｊｏｕｒｎａｌ，１９９９，２０（４）：４０１—４１２．　ＢＲＥＩＴＥＮＢＡＣＨ　Ｊ．ＳＡＮＤＭＡＮＮ　Ｇ．ｚｅｔａ．Ｃａｒｏｔｅｎｅ　ｅｉｓ　ｉｓｏｍｅｒｓ聃ｐｒｏｄｕｃｔｓ　ａｎｄ　ｓｕｂｓｔｒａｔｅｓ　ｉｎ　ｔｈｅ　ｐｌａｎｔ　ｐｏｌｙ－ｃｉｓ　ｃａｒｏｔｅｎｏｉｄ　ｂｉｏ－　ｓｎｔｙｈｅｔｉｃ　ｐａｔｈｗａｙ　ｔｏ　ｌｙｏｏｐｅｎｅ［Ｊ］．Ｐｌａｎｔａ，２００５，２２０（５）：７８５—７９３．　张建成，陶能国，仝铸，等．‘红肉脐橙’八氢番茄红素合成酶基因的克隆与原核表达［Ｊ］．中国农业科学，２００８，４１　（１０）：３２００—３２０ｒ７．　ＹＥ　Ｘ，ＡＬ．ＢＡＢＩＬＩ　Ｓ，ＫＬＯＴＩ　Ａ，ＺＨＡＮＧ　Ｊ，ｅｔ　ａ１．Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｇ　ｎｔｈｅ　ｐｒｏｖｉｔａｍｌｎ　Ａ（Ｂ－ｃａｒｏｔｅｎｅ）ｂｉｏｓｎｔｙｈｅｉｔｃ　ｐａｔｈｗａｙ　ｉｎｔｏ　（ｃａｒｏｔｅｎｏｉｄ－ｆｅｅ）ｒｒｉｃｅ　ｅｎｄｏｓｐｅｒｍ［Ｊ］．Ｓｃｉｅｎｃｅ，２０００，２８７，５４５１：３０３—３０５．　ＲＡＶＡＮＥＬＬＯ　Ｍ　Ｐ，ＫＥ　Ｄ，ＡＬＶＡＲＥＺ　Ｊ，ｅｔ　ａ１．Ｃｏｏｒｄｉｎａｔｅ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｏｆ　ｍｕｌｔｉｐｌｅ　ｂａｃｔｅｒｉａｌ　ｃａｒｏｔｅｎｏｉｄ　ｇｅｎｅｓ　ｉｎ　ｃａｎｏｌａ　ｌｅａｄｉｎｇ　ｔｏ　ｌｔａｅｒｅｄ　ｃａｒｏｔｅｎｏｉｄ　ｐｒｏｄｕｅｔｉｏｎ［Ｊ］．Ｍｅｔａｂ　Ｅｎｇ，２００３（５）：２５５—２６３．　ＤＥ　ＦＥＬＩＰＥ　Ｐ．ＲＹＡＮ　Ｍ　Ｄ．Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ　ｏｆ　ｐｒｏｔｅｉｎｓ　ｄｅｒｉｖｅｄ　ｆｒｏｍ　ｓｅｌｆ－ｐｒｏｃｅｓｓｉｇ　ｐｏｌｎｙｐｒｏｔｅｉｎｓ　ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ　ｍｕｌｔｉｐｌｅ　ｓｉｇｎａｌ　８ｅ－　ｑｕｅｎｃｅｓ［Ｊ］．Ｔｒａｆｆｉｃ，２００４（５）：６１６—６２６．　冯翠莲，张树珍．ＣｒｙｌＡ（ｃ）和ｇｎａ融合基因植物表达载体的构建［Ｊ］．热带作物学报，２０１０，３１（２）：２２４－２２８．　（责任编辑：吴显达）