花椒籽黑色素化学结构的初步研究

花椒籽黑色素化学结构的初步研究

作者：张伟 吴博

来源：《中国测试》2017年第03期

摘 要：通过紫外光谱、高效液相色谱、红外光谱、气相色谱-质谱等表征手段对花椒籽黑色素结构进行研究。采用碱提酸沉、萃取方法提取、分离纯化花椒籽黑色素，用过氧化氢和联二亚硫酸钠对黑色素碱溶降解，分析其降解产物。实验结果显示黑色素含有苯环、烷烃C-H、羟基、羧基、氨基等官能团，是一种复杂大分子结构，其降解产物含有N-乙基异丙胺、2，6-二叔丁基-4-甲基苯酚和丙氨酸丁氨酸硫醚。结果表明：花椒籽黑色素没有植物性黑色素的儿茶酚结构，是一种新的大分子黑色素，大红袍和白沙椒的花椒籽黑色素为同一物质。 关键词：黑色素；花椒籽；结构分析；GC-MS

文献标志码：A 文章编号：1674-5124（2017）03-0049-04

Abstract： The structural characteristics of Chinese prickly ash melanin are studied with UV spectra， HPLC， IR spectra and GC-MS. Melanin is obtained through alkali extraction and acid deposition， extraction and separation and purification. The Melanin is dissolved by alkali and

degraded with H2O2 and Na2S2O4 and the degraded product is analyzed. The result shows Chinese prickly ash Melanin contains benzene ring， alkane C-H， hydroxyl， carboxyl and amino functional groups. It is a complex macromolecule and its degraded products contain 2-propanamine， 2，6-Di-tert-butyl-4-methylphenol and cystathionine. Results show that Chinese prickly ash Melanin has no catechol structure of plant Melanin and it is a new macromolecular Melanin. The Chinese prickly ash Melanin of Dahongpao and Baishajiao are the same substance. Keywords： melanin； chinese prickly ash； structure analysis； GC-MS 0 引 言

黑色素广泛分布于动植物中，是酚类物质的氧化和聚合过程中产生的一类黑色和棕色高分子化合物的统称。它是生物体用来保护自身抵抗紫外线和电离辐射的一道屏障，在人体中亦参与许多生理、病理活动，是决定人类皮肤、眼睛和头发颜色的重要因素，同时一些疾病如：雀斑、黑斑、老年斑、黑色素细胞瘤、白发病、白癜风等疾病与黑色素在人体中含量水平有关[1]。近年来的研究发现，天然黑色素能作为紫外线吸收剂、抗氧化剂和新型天然药物载体，用以治疗某些与黑色素缺乏有关的神经系统疾病，具有抗癌、抑制艾滋病毒复制、抗蛇毒、治疗帕金森症等功能。同时，黑色食品如黑芝麻、黑米、黑豆等具有磁补、养生、抗衰老等方面的功效[2]，因此，黑色素在化妆品、食品、医药、装饰等领域有着非常广泛的应用前景。 黑色素是已知生物色素中最多最广的一类色素，也是最为复杂的一类聚合物。自然界中黑色素分为3类：真黑素（eumelanins）、棕黑素（phaeomelanins）和异黑素（allomelanins）。

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真黑素呈黑色或褐色，含氮原子，是酪氨酸、二羟基苯丙氨酸、多巴胺和β-氨基乙基苯酚氧化聚合而产生。棕黑素颜色较真黑素浅，合成途径与真黑素相同，不同在于胱氨酸或谷胱甘肽参加了合成过程。异黑素广泛存在于植物体中，是酚类物质在多酚氧化聚合酶作用下氧化聚合形成，其结构类型至今仍不明确[3]。

近年来，人们对黑色食品中的黑色素进行了一些研究，但从黑大米和黑大豆中提取的色素均为红色素，在531 nm处有明显的吸收峰[4]。本实验从花椒籽中成功提取黑色素，它在可见光区无明显的吸收峰，可以说是真正的黑色素。对于花椒籽黑色素分子结构的研究，文献中未见有报道，本文以碱性水溶液为溶剂，提取花椒籽黑色素。为了分析花椒籽黑色素结构，用紫外光谱（UV）、高效液相色谱（HPLC）、红外光谱（IR）、气相色谱-质谱（GC-MS）等方法进行了初步研究。 1 材料与方法 1.1 实验材料与仪器

材料：花椒籽（品种：大红袍，购于陕西韩城；白沙椒，购于河北沧州）；无水乙醇、氢氧化钠、石油醚、乙酸乙酯、联二亚硫酸钠、冰乙酸为分析纯，N，O-双-（三甲基硅烷基）三氟酰胺（Merck）、乙腈、甲醇为色谱纯。

仪器：UV2550型紫外可见分光光度计（日本岛津公司）；10A-5975C气质联用仪（美捷伦科技有限公司）；IRPrestge傅里叶变换红外光谱仪（岛津制作所）；高效液相色谱Agilent1260，四元梯度泵，自动进样器，色谱柱：SB-C18（150 m×4.6 mm，5 μm），VWD检测器；高压消解罐。 1.2 原料预处理

挑选两个品种的花椒籽，用水洗干净，除去表面的杂质。80 ℃恒温干燥以后，称取一定量的花椒籽，用石油醚浸泡24 h，过滤备用。 1.3 黑色素的提取与纯化

使用0.75 mol/L氢氧化钠溶液在60 ℃下浸泡花椒籽40 min过滤，上清液中加HCl调节pH为1～2，使黑色素沉降并静置。使用定量滤纸抽滤，沉淀用蒸馏水洗涤3次以去除氯离子和杂质，依次用乙酸乙酯、氯仿、无水乙醇萃取去除杂质，最后得到沉淀再用蒸馏水洗涤3次，80 ℃烘干至其质量不再变化为止，得到的黑色固体即为干燥纯化的黑色素。 1.4 UV吸收曲线测定

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取两个品种花椒籽的黑色素各0.035 5 g，氢氧化钠0. g，用蒸馏水定容至100 mL的容量瓶中。以氢氧化钠溶液为参比，用紫外可见分光光度计在200～800 nm做全扫描，测定吸收曲线。

1.5 HPLC测定黑色素

测定条件：流动相：V（甲醇）∶V（乙腈）∶V（乙二胺）=40∶60∶0.5，流速1 mL/min，柱温25 ℃，检测波长219 nm，进样量6 μL，测定两个品种的花椒籽黑色素纯化后的成分。

1.6 红外光谱测定

用溴化钾压片儿法测定两品种的黑色素。扫描范围为40～4 000 nm，探究黑色素结构中主要的功能性基团。

1.7 GC-MS测定黑色素降解后产物 1.7.1 样品的降解处理

碱熔降解：根据文献取两种花椒籽黑色素纯品各50 mg，分别加入氢氧化钠粉末500 mg，联二亚硫酸钠50 mg置于坩埚中，加入蒸馏水使之混匀，NaNO3盐浴加热20 min，放置一段时间冷却，用冰乙酸酸化后过滤，用20 mL的无水乙醚萃取5次，合并萃取液并浓缩，用10 mL蒸馏水萃取3次以后，乙醚部分挥干溶剂，残渣用乙腈溶后备用。

双氧水降解：取黑色素溶液，加入双氧水10 mL，在水浴中反应10 min，冷却。用100 mL乙醚萃取5次，用水洗3次，合并萃取液，减压抽滤至乙醚挥发干净，残渣用乙腈溶解备用。

1.7.2 样品降解产物的硅烷化

取0.5 mL上一步反应所得的样品降解产物，加0.5 mL N，O-双-（三甲基硅烷基）三氟酰胺，密封，在125 ℃的条件下反应30 min[5]，取样做GC-MS分析。 2 结果与分析 2.1 UV扫描结果

UV扫描结果见图1，提取液的紫外扫描曲线与文献[6]报道的一致，在可见光区无明显吸收，在紫外区有一定吸收，其最大吸收波长为219 nm，说明提取得到的为花椒籽中的黑色素，两个品种花椒籽扫描结果相同。

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2.2 HPLC测定结果

高效液相色谱图见图2。可以看出，在2.256 min时，有一个较强的峰即黑色素。通过纯化后，黑色素只有单一组分以及另外一种微量杂质，在3.584 min处的杂质，峰值较小，杂质含量低，对后续测定结果影响不大。两种黑色素峰形一致。 2.3 红外光谱扫描结果

红外光谱能够表征花椒籽中黑色素的主要官能团。由图3可知，花椒籽黑色素基团的特征吸收峰主要集中在3 300～3 500，2 500～3 000，450～1 800 cm-1 3组峰上。在3 414 cm-1处有O-H伸缩振动的强吸收峰，说明花椒籽黑色素中有-OH存在。一般固体及液体的羧酸均以缔合状态存在，所以在2 500～3 000 cm-1处有吸收峰。3 000～3 500 cm-1处有吸收峰，是由N-H伸缩振动产生，说明有-NH2或-NH（缔合）。在1 600～1 800 cm-1有羰基伸缩振动吸收峰，与3 400 cm-1的强吸收峰在一起，指示-COOH结构的存在。在1 600 cm-1附近有芳环骨架振动引起的较强的吸收峰，所以含苯环结构。在650～860 cm-1范围内吸收带很弱，2 000 cm-1附近有比较弱的苯环上氢吸收峰，表明芳环被取代，形成共轭体系。在2 830～2 930 cm-1存在相对较弱的烷烃结构的C-H吸收峰。花椒籽黑色素的红外扫描结果与文献中报道的黑芝麻色素的红外扫描结果不一致[7]，证明两种黑色素外观虽然相似，但是结构仍有不同，不是同一种物质，但两种花椒籽黑色素红外扫描结果一致。 2.4 气相色谱质谱结果分析 2.4.1 碱熔降解样品的GC-MS结果

碱熔降解黑色素的GC-MS结果见图4。在10.432 min处峰为十六甲基环辛硅氧烷，是硅烷化试剂自身转化而成，按照文献报道的处理方法[8]，不能得到花椒籽降解产物，该方法不能作为确定花椒籽黑色素的检测方法。 2.4.2 双氧水降解样品的GC-MS结果

双氧水降解产物GC-MS结果见图5，分析检索物质种类见表1。样品处理后得到3种主要降解产物：N-乙基异丙胺，2，6-二叔丁基-4-甲基苯酚和丙氨酸丁氨酸硫醚（又名胱硫醚）；其余为硅烷化试剂的降解产物。结合红外检测到含有-NH（缔合），说明N-乙基异丙胺是黑色素结构的一部分。2，6-二叔丁基-4-甲基苯酚的存在与红外检测含有苯环结构是一致的，说明2，6-二叔丁基-4-甲基苯酚是黑色素结构的一部分。2，6-二叔丁基-4-甲基苯酚又名抗氧化剂2，是一种能够抑制或延缓氧化的抗氧化剂、稳定剂，这也验证了文献中提及的黑色素具有抗氧化能力。胱硫醚是半胱氨酸和胱氨酸的结合物，是含硫氨基酸的代谢中间体，这与红外检测含有羰基和-NH2一致。同时胱硫醚中羧基和2，6-二叔丁基-4-甲基苯酚中酚羟基的存在也在一定程度上解释了黑色素为什么可溶于碱性溶液中。大红袍和白沙椒两种花椒籽黑色素，降解产物相同。

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3 结束语

Nicolaus等提出动物源黑色素属于吲哚型，而植物源黑色素属于邻苯二酚型。Prota等经过进一步研究，根据其结构单元以吲哚还是苯并噻嗪为骨架，将动物源黑色素分为Eumelanin和Pheomelanin，并推测其结构单元如图6所示。

通过对样品紫外光谱、红外光谱、GC-MS解析表明，花椒籽黑色素是含有芳环、羧基、氨基等官能团的复杂结构。其降解产物中胱硫醚的存在，一定程度上说明了花椒籽黑色素具有噻嗪骨架结构，是Pheomelanin结构。这不同于文献中报到的含有儿茶酚结构的植物性黑色素，说明该种黑色素结构是一种新型结构。

真黑素与棕黑素的主要区别在于其合成过程中是否有半胱氨酸的参与，并且半胱氨酸是唯一参与棕黑色素合成的硫化物。半胱氨酸与多巴醌反应，经过一系列过程，最终形成棕黑素[9]，如图7所示。

花椒籽黑色素中半胱氨酸结构的存才，证明花椒籽黑色素为棕黑素，是一种新型的黑色素结构。大红袍和白沙椒两个品种的黑色素表征结果一致，说明两种花椒籽黑色素为同一种物质。但关于花椒籽黑色素的具体结构仍需要借助其他手段进一步探讨。 参考文献

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