一种多肽类促感染试剂[发明专利]

*CN103145802A*

(10)申请公布号(10)申请公布号 CN 103145802 A(43)申请公布日 2013.06.12

(12)发明专利申请

(21)申请号 201210336804.X(22)申请日 2012.09.13

(71)申请人吉林大学

地址130012 吉林春市前进大街2699

号(72)发明人单亚明 孔维 张丽双(51)Int.Cl.

C07K 7/08(2006.01)A61K 48/00(2006.01)

权利要求书1页 说明书3页权利要求书1页 说明书3页序列表1页 附图3页序列表1页 附图3页

()发明名称

一种多肽类促感染试剂(57)摘要

本发明涉及一种具有促进HIV感染能力的多肽。该促HIV感染多肽包括一种肽序列，该肽序列中包括HIV-1包膜蛋白GP41的近膜外区MPER区C端多肽。本发明的多肽类促感染试剂具有显著的促包膜病毒感染的活性，在细胞水平上表现出优于常用促感染试剂DEAE等的活性，因此对于逆转录病毒或慢病毒基因疗法的发展具有重要作用。

CN 103145802 ACN 103145802 A

权 利 要 求 书

1/1页

1.一种有促感染活性的多肽，包括一种肽序列，所述肽序列包括HIV-1的包膜蛋白Gp41的MPER区的C端序列(SEQ ID NO：1)及其截短序列。

2.如权利要求1所述的有促感染活性的多肽，进一步包括一种多肽修饰，所述多肽修饰为增加一种或几种碱性氨基酸。所述碱性氨基酸包括赖氨酸，精氨酸和组氨酸。所述碱性氨基酸可以数目可以是1个或多个。

3.如权利要求1-2任一项所述的有促感染活性的多肽，进一步包括通过氨基酸单点或多点突变改造，以增强其促感染活性。

4.如权利要求1-3任一项所述的有促感染活性的多肽，进一步包括搭配合适的离子条件和pH值以提高促感染活性。

5.如权利要求1-3任一项所述的有促感染活性的多肽，除HIV-1外，进一步包括适用于其他有包膜的病毒。所述病毒为天然存在的病毒或重组病毒。

6.如权利要求1-3任一项所述的有促感染活性的多肽，包括其在组织和活体的基因治疗方面研究中的应用。

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CN 103145802 A

说 明 书一种多肽类促感染试剂

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技术领域

本发明涉及一种具有促进HIV感染能力的多肽，多肽序列衍生于HIV包膜蛋白

GP41的近膜外区MPER。

[0001]

背景技术

目前基因治疗中目的基因的转移工具分为病毒载体和非病毒载体两大类，以病毒

载体如逆转录病毒和腺病毒为基础的载体系统最为常用。逆转录病毒载体优点是转染范围广，转入的外源基因可整合入宿主细胞基因组；缺点是只能整合至期细胞；可插入外源基因片段小，难以满足较大基因的插入；有产生野生型病毒或辅助型病毒的可能，随机整合可能产生不良作用。而慢病毒载体的出现改善了这些问题。慢病毒载体源于逆转录病毒，以HIV-1病毒为基础，去除了毒性基因，用VSV-G包膜蛋白替换HIV-1的包膜蛋白。优点是宿主范围更广，更安全，和持久性表达。可整合至期和非期细胞，可插入外源片段长至5kb。因此慢病毒载体在RNAi、细胞核动物模型建立以及基因治疗等领域有着非常广泛的应用。但是，无论是逆转录病毒载体还是慢病毒载体系统，都面临一个病毒包装滴度低和感染效率差的问题。

[0002]

发明内容

为了解决现有技术中逆转录病毒载体系统和慢病毒载体系统的感染效率低的问

题，本发明提供了一种促进病毒感染的试剂，包括一条多肽序列，所述多肽序列为带包膜病毒的跨膜蛋白近膜外区的衍生多肽序列。跨膜蛋白的近膜外区(membrane proximal extracellular region，MPER)一般富集疏水性氨基酸，能与膜结构的脂双层结合，表现出膜扰乱活性(membrane perturbing property)。HIV-1包膜蛋白Gp41的MPER区能够插入到病毒膜外的界面区域，破坏病毒包膜的高度稳定性，以利细胞和病毒的膜脂重建和融合孔的形成。删除HIV的MPER区会造成融合过程的停滞。因此MPER区对于HIV病毒融合和感染能力的发挥具有极其重要的作用。基于此，我们推测MPER衍生的合成多肽也应该对HIV的感染有影响，并通过实验证实了此类多肽可以促进带包膜病毒的感染效力。本发明中，优选HIV-1跨膜蛋白Gp41的MPER区的衍生肽作为促感染试剂。[0004] 在一个实施方式中，本发明所述多肽序列可在Gp41的MPER天然序列基础上进一步增加碱性氨基酸。所述碱性氨基酸包括精氨酸，赖氨酸和组氨酸的一种或几种。增加的碱性氨基酸数目可以为一个或多个。[0005] 在一个实施方式中，上述多肽序列也可通过氨基酸单点或多点突变改造，以增强其促感染活性。

[0006] 在一个实施方式中，可以通过调节缓冲液pH值和离子强度，提高上述多肽的促感染活性。

[0003]

本发明的多肽类促感染试剂具有显著的促带包膜病毒的感染活性，因此对于逆转

录病毒或慢病毒基因疗法的发展具有重要作用。

[0007]

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CN 103145802 A

说 明 书

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附图说明

图1MPER、NK13和QW13的促感染活性的比较。在96板内，多肽梯度稀释后，与

HIV-1假病毒ZM214M.PL15孵育1h，加入TZM-bl(1×105)细胞悬浮感染。感染过程无血清，感染4h后补10％血清。感染48h后，检测luciferase表达量。Enhancement(n-fold)＝样品值/病毒对照值。病毒终浓度(p24含量)为3.2ng/mL；图示多肽浓度指加入细胞后的终浓度。

[0009] 图2NK16和NK13的促感染活性的比较。在96板内，多肽梯度稀释后，与HIV-1假病毒ZM214M.PL15孵育1h，加入TZM-bl(1×105)细胞悬浮感染。感染过程无血清，感染4h后补10％血清。感染48h后，检测luciferase表达量。Enhancement(n-fold)＝样品值/病毒对照值。病毒终浓度(p24含量)为3.2ng/mL；图示多肽浓度指加入细胞后的终浓度。[0010] 图3NK16与DEAE葡聚糖的促感染活性在不同感染时间上的比较。NK16诱导的促感染能力比DEAE更快更强。感染过程无血清，感染4h后补10％血清。NK16的终浓度是60u g/mL，DEAE葡聚糖的终浓度是16μg/mL。48h后检测luciferase活性。

[0011] 图4Hela细胞被FIV/VSV-G感染后的GFP荧光流式分析。FIV/VSV-G在NK16作用下，感染Hela细胞水平提高。FIV/VSV-G重组病毒在有无NK16共孵育的条件下感染贴壁的Hela细胞，感染过程无血清，感染4h后洗细胞，换完全培养基。2天后用流式细胞仪检测GFP的表达水平。

[0012] 图5NK16在不同离子强度条件下的促感染活性。NK16与HIV-1假病毒ZM214M.PL15预孵育的磷酸缓冲液离子强度分别为0、0.1和0.5M(pH 7.68)。DMEM是指用无血清的DMEM作为稀释缓冲液。感染过程无血清，感染4h后补10％血清。NK16的终浓度为60μg/mL。缓冲液离子强度越低，NK16的促感染能力越强。

[0008]

图6NK16在不同pH条件下的促感染活性。NK16与HIV-1假病毒ZM214M.PL15预孵育的磷酸缓冲液pH值分别为6.35、7和7.68M(0.1M)。感染过程无血清，感染4h后补10％血清。NK16的终浓度为60μg/mL。pH值越低，NK16的促感染能力越强。[0014] 图7NK16和NK16-D的促感染活性的比较。在96板内，多肽梯度稀释后，与HIV-1假病毒ZM214M.PL15孵育1h，加入TZM-bl(1×105)细胞悬浮感染。感染过程无血清，感染4h后补10％血清。感染48h后，检测luciferase表达量。Enhancement (n-fold)＝样品值/病毒对照值。病毒终浓度(p24含量)为3.2ng/mL；图示多肽浓度指加入细胞后的终浓度。

[0013]

具体实施方式

[0015] 高度保守的HIV-1gp41近膜外区(MPER)对HIV-1与宿主细胞的融合过程具有重要作用。实验证实了MPER的C端区域NWFDITNWLWYIK(SEQ ID NO：1)的合成肽具有促进带包膜病毒和宿主细胞的吸附，从而增加病毒感染效率的作用。

[0016] 下文中结合具体实施例说明了本发明的优势和技术效果。本发明的保护范围以权利要求书限定的为准，实施例仅是示例性地说明本发明的理念和原则。[0017] 实施例1[0018] 多肽的设计

4

CN 103145802 A[0019] [0020]

名字 MPER QW13 NK13[0021] [0022] [0023] [0024] [0025] [0026]

描述

MPER区全长多肽 MPER区N端多肽 MPER区C端多肽

说 明 书

3/3页

表1

序列

Ac-NEQELLELDKWASLWNWFDITNWLWYIK Ac-QELLELDKWASLW Ac-NWFDITNWLWYIK

促感染活性表征图1MPER、NK13和QW13的促感染活性的比较。实施例2多肽的设计表2

[0027] [0028] [0029] [0030] [0031] [0032] [0033] [0034] [0035] [0036] [0037] [0038] 名字 NK16

促感染活性表征

图2NK16和NK13的促感染活性的比较。与常用促感染试剂活性比较

图3NK16与DEAE葡聚糖的促感染活性在不同感染时间上的比较。在其他包膜病毒感染中的应用

图4Hela细胞被FIV/VSV-G感染后的GFP荧光流式分析。实施例3

图5NK16在不同离子强度条件下的促感染活性。图6NK16在不同pH条件下的促感染活性。实施例4表3

描述

NK13的衍生肽 NK16的衍生肽

序列

Ac-NWFDITNWLWYIKKKK Ac-NWFAITNWLWYIKKKK

NK16-D[0039]

图7NK16和NK16-D的促感染活性的比较。

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CN 103145802 A

序 列 表

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SEQ ID NO：1

[0002] NWFDITNWLWYIK

[0001]

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CN 103145802 A

说 明 书 附 图

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图1

图2

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CN 103145802 A

说 明 书 附 图

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图3

图4

图5

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CN 103145802 A

说 明 书 附 图

3/3页

图6

图7

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