防尘螨药物的实验室药效测试方法

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防尘螨药物的实验室药效测试方法

张洪杰

1*

󰀁张金桐󰀁商成杰

12

(1󰀁军事医学科学院微生物流行病研究所󰀁北京󰀁100071;2󰀁北京洁尔爽高科技有限公司󰀁北京󰀁100088)

Methodologyofefficacytestsformite-repellentchemicalsinlaboratory.ZHANGHong-Jie1,ZHANGJin-Tong1,SHANGCheng-Jie2(1󰀁InstituteofMicrobiologyandEpidemiology,AMMS,Beijing󰀁100071;2󰀁BeijingJLSUNHigh-TechCo.,Ltd.Beijing󰀁100088,China)

Abstract󰀁Dustmites,DermatophagoidesfarinaeHughes,andEurogiyphusmayneiCooreman,areimportantanaphylactogencausingallergicasthmaandallergicrhinitis.Servedasthelaboratorialmaterials,theyareverydifficulttohandleandtreatthedustmitesfortheirtinybodysize.Basedonthelong-termpracticesandexperiences,asetofdevicesandmethodsestablishedinourlaboratoryfortheefficacytestsofmite-repellentchemicalsandmiticidesisintroduced.Ithasbeenprovedtobepracticableandconvenient.Keywords󰀁dustmites,mite-repellentchemicals,bioassaymethod

摘󰀁要󰀁建立防螨药物的药效测试装置与操作方法很有必要。由于尘螨形体微小,给防螨药效测试的操作带来诸多困难,作者利用螨虫的生物习性及特点,建立了布块集螨法、成螨自动分离与净化法、标定计数法,布块浸水计数法以及螨虫的驱避和杀灭效果的测试装置与测试方法。结果表明,采用成螨自动分离与净化法获得的成螨比例为(94󰀁0󰀁1󰀁7)%;采用标定计数的精度(成螨数󰀁刻度)为(204󰀁6󰀁6)只。标定计数1000只螨的实际回收率平均为(75󰀁9󰀁14󰀁6)%,与手工计数无显著性差别(P>0󰀁05)。实践表明,此技术与方法操作简便,结果可靠,使测试的速度及效果有明显提高。关键词󰀁防尘螨,防尘螨药物,测试方法

󰀁󰀁尘螨通常包括户尘螨Dermatophagoidespteronyssinus和粉尘螨D.farinae两大类,户尘螨主要存在于卧室的地面灰尘、地毯、沙发坐垫以及床垫、枕头、被褥等处。粉尘螨除存在于居室地面外,也孳生于面粉厂,棉纺车间,食品仓库等处。尘螨与人关系密切,不仅能引起皮肤过敏,而且是尘螨过敏性哮喘和尘螨过敏性鼻炎的重要致敏原,因此对尘螨的防治逐渐引起人们的重视。近年来,国内已有多家单位研制、开发出若干杀螨、防螨产品(驱螨布料、纤维、杀螨药剂等),这些产品在进入市场之前,必须先在实验室中对其杀螨和󰀁防螨作用进行科学的测试和鉴定。由于尘螨的个体微小(170~500󰀁m)

[2][1]

1󰀁驱螨织物的测试方法

1󰀁1󰀁驱螨织物驱螨作用的测试方法

1󰀁1󰀁1󰀁驱螨测试装置󰀁取7只直径4󰀁0cm的小平皿,其中1只为中心皿,余6只平皿围绕中

心皿,在7只平皿底面及器皿上沿的各接触点用透明胶带粘连为一整体,摆放到直径12󰀁5cm的大平皿内(见图1)。

1󰀁1󰀁2󰀁测试方法󰀁在中心皿中放入试虫1000只左右,在周围6只培皿中间隔放置经过药物处理和未经药物处理(对照)的待测面料或纤维,其面积应与培皿底面积一致并与平皿底部紧密接触(图1)。在待测面料的上面各放试虫饲料0󰀁05g。驱螨纤维的测试:将待测纤维剪

*通讯作者,E-mail:zhanghj@nic.bmi.ac.cn收稿日期:2003-07-09,修回日期:2003-09-30

,扩散较快,尤其试虫的数量难以控制,

给测试的操作和计数带来很多困难。作者在长期实践中建立了一套方便可行的测试方法,兹记述如下以供同行参考。󰀁

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昆虫知识󰀁ENTOMOLOGICALKNOWLEDGE200441(3)

成2~3mm长,均匀平铺于小平皿底部,厚度约1~2mm,在待测纤维中心点上放1块直径22mm深色无污染的面料放置试虫饲料0󰀁05g(图2),将试验装置放入盛有氯化钠过饱和溶液的干燥器中(RH75%左右),(25󰀁1)󰀁条件下培养24h,在解剖镜下计数螨量,螨的驱避率(R)按以下公式计算:

R(%)=

1-处理组试虫数

󰀁100。

对照组试虫数

的3󰀁7倍,是蓝布的6󰀁3倍。用镊子将布块取出,在容器内轻轻磕打数次,除去表层的饲料、碎屑以及螨卵和幼虫,用毛笔收集布面上的螨于陶瓷酒盅内进行成螨的进一步分离与净化。󰀁平皿集螨:将养殖容器的饲料与螨虫混合体部分取出放入平皿内,在日光灯下数分钟,螨虫自然沉积于玻璃底面上,用毛笔扫取上层饲料及杂物,将螨收集于陶瓷酒盅内进行成螨的净化。

(2)成螨自动分离与净化法󰀁试虫中含成螨及杂质的多少直接影响到标定计数的准确性、稳定性和测试中螨虫的扩散速度与螨虫的回收率。作者通过大量观察,找到一种螨虫自动分离成、幼和净化的方法。根据螨虫具有畏光的习性,将布块集螨法或平皿集螨法收集到的含有一定杂质的成幼混合体盛于小陶瓷酒盅,并置酒盅于白炽灯泡或日光灯管下片刻,成螨为避光而迅速向下移动,由于酒盅底部的斜坡形状使得全部成螨连续不断地向中心运动,结果形成个体较小的幼、若虫及饲料碎屑滞留在成螨虫体的上表层及外缘部位,此时用毛笔在解剖镜下重复分离数次,获得成螨比例平均达(94󰀁1󰀁7)%,并使螨虫得到高度净化。

(3)标定管计数法󰀁标定管(图3)为100󰀁L的微量进样器管,去除针头部分,用石蜡堵塞针孔,标定芯为50󰀁L微量进样器芯,去污棒为长12cm,直径1mm的细铁丝,在一端5cm的长度用浆糊粘着1层棉纤维,在标定过程中如发现标定管不光滑时,可用去污棒蘸无水酒精作清污处理。在计数螨之前先对收集到的螨虫进行

图1󰀁驱螨装置(面料测试)

图2󰀁驱螨装置(纤维测试)

体积标定,每次采用布块浸水计数法标定试虫3~5格,计算标定管的1刻度内所含螨数并换算1000只螨所需的刻度数,用细毛笔尖将螨虫移至标定管并通过磕打的方法使管内螨虫落到实处,再用标定芯自由滑落至所标定的刻度处。采用标定法6次重复标计的精度,平均每个刻度(2󰀁L)含成螨数为(204󰀁6󰀁6)只。对采用标定计数法与手工计数法计数1000只螨的实际回收率进行了10次重复比较,结果表明标定计数的实际回收率平均为(75󰀁9󰀁14󰀁6)%;手工1󰀁1󰀁3󰀁操作方法󰀁(1)布块集螨法或平皿集螨法󰀁在测试之前将养螨容器置于高湿环境下(RH85%)促使螨虫快速繁殖,也可在养殖容器的封口布上放一块湿海绵或湿棉花,可得到相同效果。󰀁布块集螨:在养殖杯中放入数块纹理较粗的黑色布块,快速繁殖的螨喜欢聚集并附着在黑布面上。经螨虫对蓝、白、黑3种布色诱集数量的比较表明,黑布诱集的螨数是白布

200441(3)昆虫知识󰀁ENTOMOLOGICALKNOWLEDGE

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计数的实际回收率为(69󰀁4󰀁16󰀁4)%,2种计数法t-检验结果P>0󰀁05,无显著性差别。说明用标定法计数完全可代替手工计数,采用手工计数1000只螨需要花费1h以上的时间,尤其在测试样品较多的情况下,采用标定计数法可大大节省操作时间。

试,必须在不同装置上分别进行。

1󰀁2󰀁1󰀁面料织物󰀁取直径6󰀁5cm布样2块,平铺于直径相同的玻璃平皿底部,在其中1块的中心位置放试虫50只,将另一块覆盖其上。取口径4cm左右的空瓶或平皿倒扣在上面,将试虫控制在瓶(皿)口的范围之内,要求瓶(皿)口上沿平滑并有一定重力,确保试虫不能逃脱。30min和24、48h后,在解剖镜下分别记录螨虫死亡数,并计算死亡率。

1󰀁2󰀁2󰀁纤维织物󰀁将纤维剪成2~3mm长,装入0󰀁5mL的离心管内,装满l󰀁2管后加入试虫50只,继续填装纤维至满管,盖封管口。30min和24、48h后将管中内容物倒入小平皿内,用解剖针在解剖镜下检查死螨数。所有实验设对照观察并重复3次。2󰀁杀螨药物的测试方法

2󰀁1󰀁杀螨喷射剂

2󰀁1󰀁1󰀁测试装置󰀁测试喷射剂所用的密闭圆筒装置与测试其它试虫所用者相同(见国标GB13917󰀁2-92),只是在密闭圆筒装置内增加一螨虫测试瓶(图4)。测试瓶为直径6󰀁5cm,高3󰀁5cm的玻璃称量瓶。为了便于镜下计数,在瓶底、瓶盖及外壁画有宽7mm的格线。

图3󰀁标定计量工具

(4)布料浸水计数法󰀁螨在吸水后的布面上无法移动,驱螨测试中90%以上的螨是集中在有饲料的布面上,饲料中和容器内仅有少数螨存在。利用这一特点,可将布块浸水后在解

剖镜下直接计数,󰀁用眼镊轻轻取出带有饲料的布块,将饲料倒入一小平皿(直径同装置内平皿)并将带有螨的布块放回原位,用解剖针在解剖镜下计数饲料内螨数。󰀁取出带螨的布块平放于小平皿上沿(避免另一面螨脱离布面),在镜下计数螨量较少的底面。󰀁用吸管在玻面上滴加2滴清水,将有螨的一面向上平铺于水面上,待布吸湿之后,在成堆的螨上滴加l~2滴清水,在镜下用解剖针分离并计数。󰀁最后将测试装置移入镜下,计数小平皿底面的游离螨。在纤维样品驱螨作用的测试中,只计数饲料内、布面与布块下纤维中的螨数,处于纤维边缘中的螨不予计数。

为防止螨向外扩散,在计数过程中应将测

(3)

试装置保持在过饱和的食盐水中,完成计数的平皿应随时用干棉球擦拭,带有螨的饲料和测试布块应及时倒入热水杯内,操作结束用干抹布擦拭桌面和所用物品防止螨向外环境扩散。

1󰀁2󰀁驱螨织物杀螨作用的测试方法

驱螨是阻止螨的进入,杀灭是阻止螨的逃离,因此同一样品2种作用(驱避与致死)的测图4󰀁尘螨喷射剂测试瓶

2󰀁1󰀁2󰀁操作步骤󰀁测试瓶的磨口部位涂抹凡士林油,瓶底放少许螨虫饲料并放试虫约100只后加盖。在喷药前先将瓶盖打开放入密闭圆筒,瓶盖的底面向上放置在瓶的一边,喷药后2min迅速用长镊经圆筒侧面放虫孔将瓶盖盖好,到达规定时间(30min)后,取出测试瓶在󰀁

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昆虫知识󰀁ENTOMOLOGICALKNOWLEDGE200441(3)

解剖镜下检查死虫数,以肢体不动者为死亡;如30min仍有大量试虫活动,须加盖观察24、48h的死亡结果。2󰀁2󰀁杀螨粉剂

杀螨粉剂的测试方法与织物面料致死作用的测试基本相同。在直径6󰀁5cm的玻璃平皿底部放入2块与底面积一致的空白织物,在2块织物之间按国标GB13917󰀁9-1998规定的剂量(3g󰀁m)撒粉,施药位置处于2层间药量应加1倍。将药粉(约20mg)放入0󰀁5mL的离心管用棉纱封口,均匀撒于底层布面上,取上层布面覆盖其上并挤压布面,使药粉粘附在两层布面上。约50只试虫置于药粉,将空瓶倒扣于试虫外缘,根据所测样品对试虫致死的速度确定观察间隔和24、48h的死亡率。实验重复3次并设空白对照,死亡的判断标准同上。3󰀁讨论

󰀁󰀁经过实践和应用表明,此技术与方法操作简便,实验数据能够反映客观实际,使测试的速度及效果有明显提高。但该技术和方法尚需进一步改进与完善,现就实验方法与装置的几个问题加以讨论。

3󰀁1󰀁操作方法建立的依据

主要根据螨虫对外界刺激的反映的反应性(如黑色布料对尘螨有明显的诱集作用)建立了布块集螨法;利用螨虫畏光

[2]

2

物的测试,重点放在测试装置上,使测试装置内螨虫与测试样品保持紧密接触并确保试虫不逃离测试装置以外。

3󰀁2󰀁驱螨作用测试方法的建立

通过对平皿的大小、不同湿度、对照的不同颜色以及样品的不同测试方式对驱螨效果的影响等进行初步观察后选定的测试条件。经大量实验观察表明,驱螨作用绝对有效或完全无效的样品基本上不受上述条件影响,而处于两者之间的样品则受上述条件的影响较大,可通过适当增加重复次数加以弥补。对于平皿直径的选择,首先是考虑测定效果,其次从操作方便考虑,大直径器皿增加了在解剖镜下寻找螨虫的困难,认为直径4cm较为适宜。对于不同湿度的选择,作者等对相对湿度75%、85%和95%进行了观察,没有发现明显差别,从我国南北方及不同季节湿度存在的差别考虑,选用75%为宜。观察发现,不同颜色布料对螨的诱集力具有显著差别,因此空白对照的颜色应与实验样品保持一致。对于有些不适合用布料驱螨测试的样品可改用纤维的测试方法,如袜料的结构疏松,裁剪后易扭曲变形,按布料处理时螨虫钻入布纹内无法准确计数,应将袜料剪成碎屑按照纤维方式处理较为适当。

致谢󰀁文中装置示意图是由北京服装学院服装系03级硕士研究生张晓丹同学绘制,在此表示感谢。

参󰀁考󰀁文󰀁献

1󰀁陈佩惠,孔德芳,李慧珠.人体寄生虫学实验技术.北京:

科学出版社,1998.143~144.2󰀁孟阳春,李朝品,梁国光.蜱螨与人类疾病.合肥:中国科

学技术大学出版社,1995.344.352.3󰀁张洪杰.医学动物防制,1992,8(1):23~24.

建立了成螨自动

分离和净化法;根据成螨在浸水后的布面上无法移动的特点,建立了布块浸水计数法,用于观察后可以废弃的螨虫计数;对将要用于实验观察的活螨计数,作者设计了标定管计量法,不仅省时省力,而且可避免因手工计数造成对螨虫的损伤。对于驱螨织物的致死作用以及杀螨药

本刊影响因子又创新高

据󰀁中国学术期刊综合评价数据库(CAJCED2003)󰀁80种统计刊源120余万篇中文论文引用参考文献及󰀁中国期刊网󰀁中心网站2002年全文下载记录的最新统计,并经综合评价分析,󰀁昆虫知识󰀁2003年度文献计量指标比2002年有较大的提升,其影响因子由0󰀁3236上升为0.5505,增幅达70󰀁12%。

(本刊)