液相微萃取_高效液相色谱法分析葡萄汁中多酚类化合物_胡玉玲

2009年8月ChineseJournalofAnalysisLaboratory2009-8

液相微萃取2高效液相色谱法分析葡萄汁中多酚类化合物

胡玉玲,常蓓蓓,罗学军,李攻科Ξ

(中山大学化学与化学工程学院,广州510275)

摘　要:建立了一种基于液相微萃取与高效液相色谱联用技术测定葡萄汁中鞣

花酸、白藜芦醇和槲皮素的分析方法。比较了单液滴液相微萃取和中空纤维液相微萃取两种萃取模式,选择了单液滴液相微萃取作为3种多酚类化合物的液相微萃取模式。考察了搅拌速度、萃取时间、料液相pH和料液相离子强度的影响。鞣花酸、白藜芦醇和槲皮素的富集倍数分别为4814、7914和15518,方法的线性范围为010050～510μgΠmL,鞣花酸、白藜芦醇和槲皮素的检出限分别为gΠmL,相对标准偏差分别为210%,118%和117%。用01015,010020,010080μ于实际样品葡萄汁的分析,加标回收率在8119%～10213%之间。

关键词:液相微萃取;高效液相色谱;葡萄汁;多酚

中图分类号:O657.7　　文献标识码:A　　　文章编号:100020720(2009)082022204

　　葡萄中含有多种多酚类化合物,在成熟的葡

[1]

萄浆果中的多酚化合物包括:酚酸类(没食子酸、丁香酸、安息香酸、鞣花酸等)、黄酮醇类(槲皮素、山奈酚等)、黄烷醇类(儿茶素等)、黄烷酮醇类、花色苷类和芪类化合物(白藜芦醇)。研究表明,多酚类化合物具有抗氧化、抗自由基和预防心血管疾病的作用。因此,研究葡萄相关产品中多酚类化合物的分析方法具有重要意义。

目前,色谱法是分析多酚类化合物的主要方法,但存在目标化合物含量低、基体复杂等问题,因此样品前处理环节是影响结果准确度和分析速度的关键。液2液萃取界流体萃取

[4]

[2]

分析研究很少

[7,8]

。本文建立了液相微萃取与高效

液相色谱法联用测定葡萄汁中的鞣花酸、白藜芦

醇和槲皮素3种生物活性多酚的分析方法。1　实验部分1.1　仪器与试剂

LC210Avp高效液相色谱仪(Shimadzu公司,日本),包括LC210ATvp双泵系统,SPD210AvpUV2Vis检测器和CLASS2VP液相色谱工作站;磁力搅拌器(IKA公司,RETbasicC),聚偏氟乙烯(PVDF)中空纤维膜(天津膜天膜科技公司),纤维内径Π外径:0.65mmΠ1.0mm,膜壁平均孔径为0.2μm。

鞣花酸、槲皮素标准品(纯度∂99%,Sigma2Aldrich公司),白藜芦醇标准品(纯度98%,广州药检所)。乙腈、甲醇(HPLC级,Sigma2Aldrich公司);正辛醇(HPLC级,天津市光复精细化工研究所)。

1.2　液相微萃取方法

、微波辅助萃取

[5]

[3]

、超临

、固相萃取等均有报道作为多酚

类化合物的分离富集手段。

液相微萃取(LPME)是利用悬挂于色谱微量进样器针尖的微升级有机溶剂液珠进行萃取的微型液2液萃取技术。由于使用有机溶剂量极少,并且萃取后溶剂可全部转移至色谱仪中进行后续分析测定,不造成二次污染,因此是一种环境友好的样品前处理技术

[6]

。LPME用于植物中有效成分的

单液滴液相微萃取:在萃取瓶中加入8.00mL

料液及搅拌磁子,用10μL微量进样器抽取7.0μL正辛醇,将针尖插入到料液相液面以下,按下微

Ξ收稿日期:2008208209;修订日期:2008211206

基金项目:国家自然科学基金(20775095;20705042)和广东省自然科学基金(06023094)项目资助作者简介:胡玉玲(1973-),女,副教授;E2mail:cesgkl@mail.sysu.edu.cn

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量进样器的活塞,使萃取溶剂在针尖上形成一个小液滴,搅拌速度为500rΠmin,萃取40min后抽取6.0μL萃取液进样分析。中空纤维液相微萃取:将中空纤维切为2.5cm的小段,放入丙酮中清洗5min以除去杂质;晾干后取一段放入正辛醇中浸泡2min以使中空纤维壁孔中充满有机溶剂,再将其套在10μL微量进样器(已吸入5μL接收相)的针尖上,推出正辛醇接收相,另一端用热钳子封住浸入料液相萃取。搅拌速度625rΠmin,萃取时间50min。1.3　色谱分析条件

图1　中空纤维液相微萃取与单液滴液相微萃取的比较Fig.1　ComparisonofSD2LPMEandHF2LPME1-鞣花酸:210μgΠmL;2-白藜芦醇:0120μgΠmL;3-槲

色谱柱为PhenomenexLunaC18反相色谱柱(250m),流动相为醋酸缓冲液×4.6mmi.d.,5.0μ(质量分数为0.6%)与乙腈混合溶液,采用梯度洗脱程序:30min内乙腈体积百分比由15%增加到50%,流速1.0mLΠmin,白藜芦醇的紫外检测波长

皮素:0120μgΠmL

变时,分配系数也会随之发生变化。

本研究通过改变样品溶液中NaCl的浓度来改变其离子强度,分别取0,5%,10%,15%(wΠv)NaCl的浓度水平考察离子强度的影响。离子强度

为306nm,鞣花酸和槲皮素的检测波长为254nm。

2　结果与讨论2.1　液相微萃取模式的选择

液相微萃取分为单液滴液相微萃取(SD2LPME)和中空纤维液相微萃取(HF2LPME)两种模式,实验中比较研究了3种多酚类化合物在两种萃取模式下的萃取率和萃取速度。结果表明,单滴液相微萃取和中空纤维液相微萃取的最佳搅拌速度分别为500rΠmin和650rΠmin,并且在各自优化的搅拌速度下,单滴液相微萃取和中空纤维液相微萃取的萃取平衡时间分别为40min和50min。单液滴液相微萃取可以采用相对较低的搅拌速度在更短的时间达到萃取平衡,这是由于接受相与料液相直接接触,使分析物的传质速度更快。

分别在两种萃取模式的最佳实验条件下,比较了鞣花酸、白藜芦醇和槲皮素的萃取率(如图1)。从图中可知,单液滴液相微萃取对各分析物的萃取率均高于中空纤维液相微萃取的萃取率,尤其是鞣花酸。有可能是因为鞣花酸分子体积较大,通过中空纤维膜的速率较慢,影响其萃取率。因此,本研究选用单液滴液相微萃取模式,并研究了该萃取模式下料液相离子强度和pH对萃取率的影响。2.2　料液相离子强度

由于分析物在接受相和料液相之间的分配系数受基体的影响,所以当基体的离子强度发生改

对白藜芦醇的萃取率影响不显著,鞣花酸和槲皮素的萃取率随离子强度增大而降低,因此本研究选择不加入NaCl。2.3　料液相pH

在液相微萃取过程中,调节样品溶液pH可以影响分析物的存在状态,从而影响萃取效率。多酚类化合物是一类弱酸性物质。当溶液为酸性介质时,多酚类化合物的离解程度降低,以中性分子的状态存在,加速了分析物向萃取溶剂的扩散。研究结果表明,pH4.0时,分析物的萃取率达到最大值。随着pH进一步增加,鞣花酸和槲皮素的萃取率略有下降,白藜芦醇萃取率显著下降。因此,选择pH4.0作为实验的最佳条件。2.4　方法富集倍数

为验证液相微萃取方法对鞣花酸,槲皮素和白藜芦醇的萃取富集效果,将鞣花酸,槲皮素,白藜芦醇标准溶液的直接进样色谱图与液相微萃取富集后进样色谱图进行比较,根据测定萃取结束后分析物在接受相中的浓度和萃取开始前分析物在待测样品相的初始浓度计算富集倍数,鞣花酸、白藜芦醇和槲皮素的富集倍数分别为4814、7914、15518。2.5　线性范围、检出限和精密度分别配制010020、010050、01010、01020、01050、0120、0150、210、510、10μgΠmL的鞣花酸,

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槲皮素,白藜芦醇标准溶液,在优化的实验条件下液相微萃取并定量分析。以峰面积对多酚类化合物浓度作标准曲线,以平行萃取测定6次质量浓度为012μgΠmL的鞣花酸、槲皮素、白藜芦醇标准溶液计算精密度RSD。根据IUPAC定义,计算方法的检出限。表1为方法的线性范围、线性相关系数、检出限和精密度。2.6　样品分析

将建立的液相微萃取2高效液相色谱法用于葡萄汁中多酚类化合物分析。将购自超市的两种不同品牌葡萄汁过0145μm膜后稀释10倍,pH调至410后进行液相微萃取。色谱图和分析结果分别为表1　方法线性范围,相关系数,检出限和精密度

Tab.1　Thelinearrange,correlationcoefficient,limitsof

detectionandprecisionofthemethod(n=6)

分析物鞣花酸槲皮素

线性范围

(μΠgΠmL)0.050～5.00.020～2.0

相关系数

0.99960.99840.9979检出限

(μΠgΠmL)0.0150.00200.0080

RSD

Π%

2.01.81.7

白藜芦醇0.0050～5.0

3种多酚类化合物,另一种葡萄汁检测出白藜芦醇图2和表2,从表2可知,其中一种葡萄汁未检出和槲皮素。3种多酚类化合物的加标回收率在8119%～10213%之间,RSD在113%～812%之间,满足痕量分析的要求。

图2　标准溶液(a)及葡萄汁样品(b)液相微萃取后进样色谱图

Fig.2　ChromatogramsofthestandardsolutionandthegrapejuiceafterLPME

1-鞣花酸;2-白藜芦醇;3-槲皮素

萃取溶剂:正辛醇;萃取时间:40min;搅拌速度:500rΠmin;料液相pH:4.0;标准溶液(a):鞣花酸,槲皮素,白藜芦醇的浓度为2.0μgΠmL

表2　葡萄汁样品分析结果

Tab.2　Analyticalresultsofgrapejuicesamples

分析物样品编号

121212

样品中含量

(μΠgΠmL)n.d

3

加标量

(μΠgΠmL)0.1000.1000.1000.1000.1000.100

回收率Π%

83.195.081.983.388.8102.3

RSDΠ%(n=3)8.21.37.51.26.42.3

鞣花酸白藜芦醇

n.d1.31n.d0.52n.d

槲皮素

　　　　　　　注:n.d-未检出;1,2为两种不同品牌的葡萄汁饮料样品

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参考文献

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Determinationofpolyphenolsingrapejuicebyliquid2phasemicroextractioncoupledwithhighperformanceliquidchromatography

HUYu2ling,CHANGBei2bei,LUOXue2junandLIGong2ke(SchoolofChemistryandChemicalEngineering,Sun

3Yat2senUniversity,Guangzhou510275),FenxiShiyanshi,2009,28(8):22～25

Abstract:Anovelmethodforthedeterminationofellagicacid,resveratrolandquercetiningrapejuicebyliquid2phasemicroextraction(LPME)coupledwithhighperformanceliquidchromatography(HPLC)wasdeveloped.There2sultsoftwodifferentmodesofLPMEwerecompared,andthesingledropmicroextractionexhibitedbetterextractionef2ficiency.Effectsofstirringspeed,extractiontime,ionicstrength,andpHwereinvestigated.Theenrichmentfactorsofellagicacid,resveratrolandquercetinwere4814,7914and15518,respectively.ThelinearrangeofthemethodgΠmL.Thedetectionlimitsofellagicacid,resveratrolandquercetinwere01015,010020,wasfrom010050to510μ

010080μgΠmL,andtheRSDswere210%,118%and117%,respectively.Therecoverieswerefrom8119%to10213%forgrapejuicesamples.Themethodwithlittlesolventconsumptionwassimple,fast,sensitiveandsuitableforthedeterminationofpolyphenolsinplantsamples.

Keywords:Liquid2phasemicroextraction;Highperformanceliquidchromatography;GrapeJuice;Polyphenols

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