NGF结合HA对糖尿病大鼠骨缺损愈合影响的研究
目 录
中英文缩写词表------------------------------------------------------------------1 中文摘要 ------------------------------------------------------------------2 英文摘要 ------------------------------------------------------------------4 前言 ------------------------------------------------------------------6 材料与方法---------------------------------------------------------- 8 结果 ------------------------------------------------------------------13 讨论 ------------------------------------------------------------------24 结论 ------------------------------------------------------------------30 参考文献 ------------------------------------------------------------------31 附图 ------------------------------------------------------------------33 综述 ------------------------------------------------------------------42 攻读学位期间发表的论文-----------------------------------------------------48 致谢 ------------------------------------------------------------------49
中英文缩写词表
英文缩写 英文全称
中文全称
NGF nerve growth factor 神经生长因子 STZ streptozotocin 链尿佐菌霉素 GS gelatin sponge 明胶海绵 OC osteocalcin 骨钙素 ALP alkaline osphatase 碱性磷酸酶 CGRP calcitonin gene related peptide 降钙素基因相关肽 HA hyzdroxya Patite 羟基磷灰石 IGF-1 insulin-like growth faetor-I 胰岛素样生长因子 AGES Advanced glycosylation end produets 糖基化终末产物 PTH parathyroid hormone 甲状旁腺腺素 SP substanceP P物质 VIP vasoactive intestinal polypeptide 血管活性肠肽 YNPY neuropeptideY 神经肽
ACAP adenylate cyclase activating polypeptide 腺苷酸环化酶激活肽
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NGF与HA对糖尿病大鼠骨缺损愈合影响的实验研究
中文摘要
研究目的：建立糖尿病大鼠胫骨骨缺损模型，通过比较使用神经生长因子
（nerve growth factor，NGF）、羟基磷灰石（hyzdroxya patite，HA）以及两者联合运用后对骨缺损愈合过程中对大体形态学、影像学、碱性磷酸酶（alkaline osphatase，ALP）、骨痂中Ca含量、组织学等指标的影响，探讨联合运用神经生长因子及羟基磷灰石对糖尿病大鼠骨缺损的疗效与机理 。
材料和方法：
75只健康雄性8周龄SD大鼠，随机分为链脲佐菌素(streptozotoein，STZ）
注射组60只，正常对照组15只，STZ组一次性腹腔注射链脲佐菌素(streptozotoein，STZ）50mg/kg，正常组作为一次性腹腔注射等容量生理盐水，STZ组注射STZ后3天后随机选出血糖浓度高于16.8mmol/L的纳入糖尿病组，血糖未达标者再补充。将糖尿病组随机分为B、C、D、E四组，每组15只。正常组随机选15只血糖正常者为A组正常对照组。5组大鼠均建立右胫骨上段4mm骨缺损模型，按A、B、C、D、E字母顺序分别于骨缺损局部使用，生理盐水、生理盐水、NGF、HA、NGF\\HA。术后第4周、8周、12周各组分别随机抽取5只大鼠静脉采血.进行大体标本、骨缺损部位X线、血清ALP检测、骨痂Ca含量及组织学观察。
结果：术后同一时间，大体观察：糖尿病组B、C、D、E组局部骨缺损处新
生骨组织体积、硬度逐渐增加，空白对照A组愈合优于糖尿病对照B组，差于D、E组；X线片示：观察B、C、D、E组骨缺损骨痂横向与纵向模糊程度逐渐增加，空白对照A组愈合优于糖尿病B、C组，差于D、E组。组织学观察：B、C、D、E组骨小梁成熟度和密度逐渐增高，空白对照A组愈合优于糖尿病B、C组，低于其余组。B、C、D、E组碱性ALP含量依次递增。A、C组于第4周P>0.05，无统计学意义。各组的血清ALP含量于第8周增加达到最高峰，其中E组最高，与其
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它四组比较血清中ALP含量差异具有统计学意义(P<0.05)，ALP于12W回落。各组大鼠新生骨痂Ca含量随时间增加而增加，横向对比各时期由小到大B、C、A、D、E。
结论： NGF与HA联合运用具有良好的诱导成骨作用，使骨细胞增生活跃，
加快糖尿病鼠骨缺损愈合。
关键词：神经生长因子 羟基磷灰石 骨缺损 糖尿病
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Experimental research about the effect of NGF and HA on the
healing of bone defect in diabetic rats
Abstract
Objective: Establish the diabetic rat tibial bone defect model. Compare the effects
of using NGF, HA and the combination of the both on the general morphology and imaging, and the effects on calcium content and ALP in bone defect healing process. And discuss the effects and mechanisms of the combined application of NGF and HA on diabetic rat bone defects. Materials and methods
75 8-week old healthy male SD rats were randomly divided into 60 diabetic group, receiving single dose intraperitoneal injection of 50mg / kg streptozotocin ( streptozotoein, STZ ) and 15 control group , receiving intraperitoneal injection of equal volume saline.3 days after the injection, we choose 60 rats whose blood glucose concentration were higher than 16.8mmol / L into the diabetic group,replenished the rat which blood sugar is not reach the standard. then randomly divided them into group B, C, D, E with 15 rats in each group. We choose 15 rats from the control group as the group A, whose blood sugar is normal .All groups of rats were established as 4mm right upper tibia bone defect model and orderly used saline, saline, NGF, HA, NGF+HA in the bone defect. Post-operation at 4th、8th、12th week, we randomly selected 5 rats from each group to get venous blood sampling. Then we carried out the general specimens observation, X-ray observation of bone defect, calcium content， histological observation and the detection of ALP
Results: Gross observation at the same postoperative time: In diabetes group B, C,
D, E,the bone tissue volume and hardness in local bone defects increased gradually.The healing of control group A is better than group B but worse than group D, E ; X-ray showes: The transverse and longitudinal fuzzy degree of the bone callus in bone defect group B, C, D, E was increased gradually.Group A was better than
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group B but worse than group D, E. Histological observation: The maturity and density of bone trabecular in group B, C, D, E was increased.Group A is higher than group B but less than the remainder of the group.The content of ALP were increased in the order of group B, C, D, E The content of serum ALP in each group reached the peak at 8th week. Comparing to the other four groups,group E was the highest,the difference had statistical significance(p<0.05).ALP fell at 12th week.Calcium content increased over time, increased in the order of groupB、C、A、D、E in every stage.
Conclusion:
defect healing.
NGF composited with HA has a good function in
osteoinduction ,activeing the growth of osteocyte ,speed up the diabetes rat bone
Key words: nerve growth factor; hydroxyapatite; bone defect; diabetes mellitus
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前言
糖尿病致病机理复杂，包括：免疫、微生物感染、自由基毒素、遗传、精神等诸多因素，导致胰岛素抵、胰岛细胞功能减退，机体内水、电解质、糖、蛋白质、脂肪等代谢紊乱综合征，糖尿病会引发全身多系统病变，对骨组织的常见影响包括骨质疏松、骨量减少，这些常导致骨折风险率增加和骨折延迟愈合等。在临床工作中，经常遇到糖尿病患者骨缺损延迟愈合及不愈合的情况，这种现象在实验中也得到了证实。在骨痂愈合早期，原始骨细胞增殖降低，胶原合成障碍，在骨痂愈合晚期，新生骨生物力学特性降低[1]，具体机制目前正积极探索中。糖尿病患者因肿瘤切除、外伤、感染等因素使骨丧失一些骨质，可导致骨缺损，而糖尿病患者的骨愈合慢，不愈合可能性大，如出现骨缺损，其愈合成为临床工作中的难题。目前修复骨缺损的方法主要有:1、自体骨移植，包括带血供的自体骨瓣，自体游离骨移植，骨膜瓣等，但供体来源有限，存在增加患者痛苦及恢复时间，并发症增多等缺点。2、同种异体骨存在植入后容易出现感染及排斥反应等，且加重患者的经济负担，客观上限制了其使用范围[2]。3、人工骨移植，主要有生物陶瓷、羟基磷灰石、自固化水泥等。上述骨缺损治疗方法均有其片面与不足，骨缺损愈合过程中需要多种因子参与，包括：骨形态发生蛋白 2(bone morphogenetic protein-2, BMP-2)、血管内皮细胞生长因子(Vaseular endothelial growth faetor，VEGF)、胰岛素样生长因子-I((insulin-like growth factor-I ,IGF-I)、神经生长因子( nerve growth factor,NGF)。 NGF能通过以下几方面影响骨愈合：1、NGF通过自身诱导作用，使神经纤维长向骨组织中生长；2、神经再生作用； 3、促新血管形成；4、促进炎性反应趋化作
[3]用；5、NGF能促进运动神经元对神经营养物质的合成,能促进肌肉和骨的修复；
6、NGF通过受体传递细胞信息,进一步使细胞磷酸化水平增强,成骨能力增强[4]； 7、血糖升高可促进胰岛素分泌,NGF可使得这一现象得到增强，其机制可能为：细胞自分泌及细胞旁分泌的调节, 从而改善病损区的血液循环[5]。作为新发现的对于骨缺损存在促进作用的细胞活性因子，对它的研究成为热点，但对于糖尿病这类特殊病人的骨缺损修复缺少具体研究，本实验联合运用羟基磷灰石(hyzdroxya Patite ，HA)及神经生长因子（nerve growth factor ，NGF ）来
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修复骨缺损，研究成骨过程中ALP、X线等指标变化，旨在探讨这种新方法能否改善糖尿病骨缺损愈合过程，从而能为临床和科研使用一种新的移植材料提供实验依据。
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材料和方法
1.实验材料
1.1主要试剂
链脲佐菌素(STZ)：美国Sigma公司生产 由长沙新诚生物提供
神经生长因子(NGF)：规格18µg（≥9000AU）/支 厦门北大之路生物工程有限公司 国药准字S20060052 执行标准 YBS01002006。
注射用青霉素钠：规格0.48g（80万单位），中国哈药集团制药总厂生产，国药准字H23021439，产品批号A 100800410
水合氯醛合剂：规格10ml/支，湖南省人民医院药剂科制剂室生产 0.9%生理盐水：规格500ml/瓶，四川科伦药业生产 络合碘：规格500ml/瓶，长沙雨花消毒药有限公司生产 福尔马林溶液：规格500ml/瓶，上海海曲化工有限公司生产 羟基磷灰石生物陶瓷：规格：HAP-II-不规则体（3克）/盒上海倍 尔康生物医学科技有限公司生产 国食药监械（准）字2005第3460001 YZB/国 0931（羟基磷灰石生物陶瓷）沪食药监械生产许可证20000547 钙单元素标准溶液:上海计量科学研究院 甲酸:西陇化工股份有限公司 浓硝酸:广州化学试剂厂
30%过氧化氢:广东光华化学厂有限公司 硝酸铜:西陇化工股份有限公司
1.2主要器械
手术造模器械一套（尖刀片及刀柄、缝线、缝针、弯钳、止血钳、无齿镊、有齿镊、弯剪、眼科剪、2ml注射器、20ml注射器、拉钩）、无菌纱布、一次性无菌巾。
1.3主要仪器设备
酶标仪：美国伯乐公司，#680 移液器：Eppendorf，雷勃 离心机：湖南湘仪公司
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EP管，tip头：湖南碧云天生物
脱水机：武汉俊杰电子有限公司 型号JJ-12J
包埋机：浙江省金华市科迪仪器设备有限公司 型号KD-BM 切片机：上海徕卡仪器有限公司 型号RM2016 冻 台：武汉俊杰电子有限公司 型号JB-L5
摊片机：浙江省金华市科迪仪器设备有限公司 型号KD-P 烤 箱：上海福玛实验仪器有限公司 型号DGX-9003B EPEXDR机(Hologic公司，美国); SIENET SKY系统( siemens公司 ，德国);
DMR+Q550型 QwinLive病理图像分析仪(Leica公司，德国) MK一111光纤压力自控密闭微波消解仪 中国上海
1.4实验动物
75只8周龄健康雄性Sprague-Dawley大鼠，（图1）平均体重为（258.5±15.5）g，由湖南省人民医院动物实验中心提供，无肝肾疾病、手术区创伤、感染或骨骼畸形，也无其他全身疾病，均在标准笼子中饲养，且为同一饲养员喂养，环境温度为25℃，24h昼夜照明节律，以普通大鼠标准饲料喂养，控制饲养食量22g·只
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·d-1，自由饮水。所有操作程序均遵守南华大学大学动物实验准则。
2实验方法
2.1实验动物分组与动物模型的制备
75只健康雄性8周龄SD大鼠，随机分为链脲佐菌素(streptozotoein，STZ）注射组60只，正常组15只，STZ用pH4.2，0.1 mmol/L柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液配成1％的溶液，现用现配。STZ组大鼠一次性腹腔注射链脲佐菌素(streptozotoein，STZ）50mg/kg（图4)，正常组作为一次性腹腔注射等容量生理盐水，STZ组注射STZ后3天后随机选出血糖浓度高于16.8mmol/L纳入糖尿病组，血糖未达标者继续补充，再将糖尿病组随机分为B、C、D、E四组，每组15只。正常组随机选15只为A组正常对照组。成模后定期测定血糖，实验过程中因糖尿病死亡大鼠或血糖达不到上述值者放弃使用，随时补足。
每组大鼠均建立右胫骨中上段4mm骨缺损模型，按A、B、C、D、E字母顺序
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分别于骨缺损局部使用：生理盐水、生理盐水、NGF、HA、NGF\\HA。术后第4周、8周、12周各组分别随机抽取5只大鼠静脉采血.进行大体标本、ALP检测，骨痂Ca含量、骨缺损部位X线及组织学观察。
2.2实验方法
1%的水合氯醛 (30ml/g)腹腔注射麻醉大鼠后，将大鼠右小腿中上段毛剪短，取前外侧直切口，依次将皮肤、筋膜切开，分离肌肉，显露胫骨中上段骨干，横行剪断胫骨中上段，造成约4mm胫骨干骨缺损(图5)，用0.9%生理盐水冲洗缺损区，按实验分组设计方式A、B、C组缺损区不予填充任何填充物，C、D组植入HA（图6），予小夹板固定，逐层缝合肌膜、筋膜，皮肤。术后肌注抗生素48小时，2次/24小时。A组术后第3天开始，在大鼠骨缺损处注射0.1ml生理盐水，每天1次，连续注射7天;B组术后第3天开始，在大鼠骨缺损处注射0.1ml生理盐水，每天1次，连续注射7天，C组于术后第3天开始，在大鼠骨缺损处注射 0.5µgNGF，每天1次，连续注射7天，;D组术后第3天开始，在大鼠骨缺损处注射0.1ml生理盐水，每天1次，连续注射7天;E组（实验组）术后第3天开始，在大鼠骨缺损处注射0.5µgNGF，每天1次，连续注射7天。分别于术后4周、8周和12周各组颈椎脱臼法处死5只动物，取相应骨缺损骨痂标本分别行大体观察、X线片观察、ALP测定，组织学观察,骨痂Ca含量。
3检测指标
3.1大体观察
术后观察不同实验组大鼠饮食、饮水、右下肢伤口以及活动情况，并于4周、8周、12周分别处死大鼠后观察骨折端骨痂生长情况。
3.2 X线观察
术后第4周、8周和12周，处死大鼠后立即采用 EPEX DR机进行拍片，投照条件为球管电压65kV，曝光时间50ms，电流1OmA，球管与大鼠距离110CM。根据Lane一Sandhu法X线摄片评分标准，对各个时期糖尿病大鼠右胫骨骨缺损愈合过程中的骨痴及塑形情况进行评分。
3.3生化检测
处死小鼠前用小镊子夹住小鼠一侧眼球并取出，使球后动静脉断裂出血，试
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管盛住所出血液。所取血样本2000rpm,10min 离心,取上层血清，样本及试剂盒恢复室温,用ELISA法测定血清中ALP含量。
3.4 Ca含量检测
将大鼠处死后，取出右胫骨，以骨痴为中心取出新生组织，剔除表面筋膜，
肌肉、肌键及骨膜，仅保留骨痴，采用微波消解一原子吸收光谱法测定骨痴中的钙，处理如下:称干重后，将骨痴置于三角烧瓶中，加甲酸10ml，加浓硝酸 1.5ml，振荡摇匀，反应3一5min后待冷却，再次加浓硝酸1.5ml，冷却后加30%过氧化氢;将反应物倒入聚四氟乙烯消化杯内，装入外罐内盖紧，在微波消解仪中分两步进行微波消解，得微黄色澄清透明样品溶液，测定。
3.5组织形态学观察
骨缺损部位骨痂组织固定于4%多聚甲醛24 h后取出修整使切面平整，置入梯度酒精脱水、浸蜡包埋。具体脱水和浸蜡包埋步骤如下： （1）75%酒精中脱水过夜； （2）85%酒精中脱水2 h； （3）90%酒精中脱水2 h； （4）95%酒精中脱水1 h； （5）100%酒精Ⅰ中脱水30 min； （6）100%酒精Ⅱ中脱水30min； （7）无水乙醇二甲苯中透明5-10min； （8）二甲苯Ⅰ中透明5-10min；
（9）二甲苯Ⅱ中透明5-10min（观察透明效果）； （10）石蜡Ⅰ中浸蜡1h； （11）石蜡Ⅱ中浸蜡1h； （12）石蜡Ⅲ中浸蜡1h （13）包埋机包埋，修蜡块。
将蜡块置于石蜡切片机上连续切片，片厚4μm。 将切片漂浮于40℃ 温水表面展平，然后用防脱处理过的载玻片捞起，并放进60℃ 烘箱内烘烤，最后将烘好的切片室温保存备用。将制作好的石蜡切片进行HE染色。具体染色工作流程如下：
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（1）二甲苯Ⅰ中脱蜡10 min； （2）二甲苯Ⅱ中脱蜡10 min； （3）100%酒精Ⅰ中脱二甲苯5 min； （4）100%酒精Ⅱ中脱二甲苯5 min； （5）95%酒精中5 min； （6）85%酒精中5 min； （7）75%酒精中5 min； （8）蒸馏水洗去酒精5 min；
（9）苏木素染色3-8 min，流水稍冲洗；
（10）1%盐酸酒精溶液分化30 sec（观察分化效果），流水稍冲洗； （11）1%氨水溶液返蓝30sec，流水稍冲洗； （12）镜检着色满意后入伊红染液染色1-3min； （13）95%酒精Ⅰ中脱水5 min； （14）95%酒精Ⅱ中脱水5 min； （15）100%酒精Ⅰ中脱水5 min； （16）100%酒精Ⅱ中脱水5 min； （17）二甲苯Ⅰ中5 min； （18）二甲苯Ⅱ中10 min； （19）中性树胶封片。
3.6统计学方法
采用SPSS13.O统计软件，实验计量资料以⎯x±S表示， X线、病理组织切
片进行多样本均数的方差分析及两两比较的q检验，先做多方差齐性检验。ALP、Ca含量采用LSD-t检验。检验水准α=0.05以P<0.05 为差异有统计学意义。
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结果
1.大体观察
所有实验SD大鼠术后第1、2天精神差，进食少，躁动。第3、4天起精神
和进食恢复正常，右下肢均有不程度的肿胀，伤口未见流脓渗液等，右下肢跋行，7天后跋行减轻，肿胀消退，未见切口感染、内植物外露、脱出等，无SD大鼠死亡。术后4周，各组大鼠可自由活动，但不同程度跋行，D、E组于骨缺损处可扪及质硬新生物，E组>D组，A、B、C组骨缺损端有微动，新生组织不明显，质地软，大小A与C组无显著差异，均大于B组，B组断端活动明显;取右下肢解剖进行大体观察，骨缺损端呈椭圆形或圆形或不规则型膨胀生长，D、E组骨缺损处新生硬组织以纤维组织与软骨组织混合生长，E组软骨较多，与HA分界不清，骨痂向中央部延伸，A、B、C组以纤维组织为主，混合少量软骨，软骨量A>C>B，B组软骨量极少，以纤维组织为主，假关节活动明显(图7)。术后8周，扪及D、E组新生物较术后4W硬度及体积增加明显，无假关节活动，有骨性组织包绕HA。C、A、B组新生物小，C>A>B；解剖后大体观察，D、E组骨缺损端见骨性骨痴呈梭形生长，HA被包埋，横断见骨痂充满HA孔间隙，C、A、B组各组骨缺损处以软骨组织及少量或中量骨样组织为主，密度依次减小，A、B组仍以纤维组织为主，B组两断端可见硬化骨（图8）。术后12W，D、E组骨缺损处组织硬度较第8W时增强，E组最高，胫骨强度大，C、A胫骨强度较前增加，B组无骨性连接，有假关节活动;解剖观察新生物，D、E组骨缺损端无活动，E组移植物被骨痂完全包埋，与宿主骨界限消失，D组骨痂大部分包埋移植物，软骨组织及骨样组织较前继续增加，A、C组缺损区以骨组织为主，含部分软骨样组织，B组以纤维结缔组织为主，混有少量骨性连接（图9）。
2.X线片观察:
术后4周，E组及D组截骨植入材料区与断端交界处见有新生骨，尤以E组明显。A、B、C组未见明显骨组织形成 (图10)。植入8周，D组新生骨增多，E组明显增多，A组少量骨痂生成，B组仍无骨痂形成，移植物与宿主骨界线清晰(图11)。植入骨12周，A、C组有部分骨痂连接，D、E组骨痂体积大，与宿主骨融
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合，周围新生骨痴包裹超过E大于D组，E组基本愈合(图12)。骨愈合X线评分采用Lane一San曲u法评分标准(表1)，放射学检查评分结果方差分析见(表2)
表1 Lane-Sandhu 法X线摄片评分标准
项目 评分 骨形成 无骨形成 0% 0 骨形成占缺损 25% 1 骨形成占缺损 50% 2 骨形成占缺损 75% 3 骨连接 骨折线清楚 0 骨折线部分存在 2 骨折线消失 4 骨塑性 未见塑形 0 骨髓腔形成 2
皮质骨塑形 4
表2 放射学检验评分结果方差分析(⎯x±S)n=5
分组 4周 8周 12周
A组（空白对照组） 1.4±0.24 2.00±0.31 2.60±0.24 B组（糖尿病对照组） 0.20±0.20 0.40±0.24 0.60±0.24 C组（糖尿病NGF组） 0.6±0.44 1.20±0.20 1.60±0.24 D组（糖尿病HA组） 3.2±0.20 6.80±0.20 7.60±0.24 E组（糖尿病NGF/HA组） 4.4±0.24 9.6±0.24 10.60±0.24 P值 <0.05 <0.05 <0.05
先行多个方差的齐性检验，证明此4组资料的方差齐，即进行方差分析，显示5组各时期的组织学评分结果有显著性差异。故进一步进行两两比较的q检验。结果见下表3。
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表3 两两比较q检验的P值
对比组 4周 8周 12周 A:B <0.001 <0.001 <0.001 A:C <0.05 <0.05 <0.05 A:D <0.001 <0.001 <0.001 A:E <0.001 <0.001 <0.001 B:C <0.05 <0.05 <0.05 B:D <0.001 <0.001 <0.001 B:E <0.001 <0.001 <0.001 C:D <0.001 <0.001 <0.001 C:E <0.001 <0.001 <0.001 D:E <0.001 <0.001 <0.001
从表3中显示，E组与A、B、C、D组在各时期均有显著差异，A组与B组各时期均有显著差异，B与C、D、E各时期均有显著差异，结果见下图（A）。
图（A）放射学评分结果
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上述结果表明：1、糖尿病鼠骨愈合差于空白对照组；2 NGF及HA单独使
用均有促进糖尿病鼠骨愈合的作用；3、NGF与HA结合使用后，对糖尿病鼠骨缺损愈合相互促进的加成作用。
3 碱性磷酸酶检测
术后第4周血清中ALP含量大小由小到大依次B、C、A、D、E，E组与其他组比较增加明显，具有统计学意义。术后第8周，ALP检测结果均高于第4周，仍为E组最高，D、A、C、B逐渐减小，术后12周ALP含量较第8周出现下降，E组最高，D、A、C、B逐渐减小。第8、12周A、C组无统计学差异（P >0.05），其余各组间比较血清ALP含量差异有统计学意义（P <0.05）。
表4 ALP检验评分结果方差分析(⎯x±S)n=5 U/L
分组 4周 8周 12周
A组（空白对照组） 120.53±3.66 121.94±3.07 97.57±2.21 B组（糖尿病对照组） 80.20±2.44 92.26±2.46 80.87±1.83 C组（糖尿病NGF组） 107.43±2.42 116.51±2.99 106.60±2.66 D组（糖尿病HA组） 144.88±6.02 160.15±5.33 143.13±3.45 E组（糖尿病NGF/HA组）203.84±8.66 231.20±4.02 193.49±4.86 P值 <0.05 <0.05 <0.05
根据所得数据采用spssv13.0处理，多个样本均数间比较采用方差分析, 多个样本均数间两两比较采用LSD-t检验。检验水准α=0.05,结果表5：
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表5第4周 血清ALP检测结果
时间 组别 例数 检验值 P值 4周 A与B 10 LSD-t= 7.71 P=0.000 4周 A与C 10 LSD-t= 2.50 P=0.021 4周 A与D 10 LSD-t= -4.66 P=0.000 4周 A与E 10 LSD-t=-15.93 P=0.000 4周 B与C 10 LSD-t=-5.21 P=0.000 4周 B与D 10 LSD-t= -12.37 P=0.000 4周 B与E 10 LSD-t= -23.63 P=0.000 4周 C与D 10 LSD-t= -7.16 P=0.000 4周 C与E 10 LSD-t=-18.43 P=0.000 4周 D与E 10 LSD-t= -11.27 P=0.000 4周 A与B、C、D、E 25 F值=160.10 P=0.000
注:A为正常对照组；B为糖尿病对照组；C为糖尿病NGF组；D为糖尿病HA组；E组为糖尿病NGF\\HA组
由表5可看出E组与其他组比较均有显著性差异，A组与B组各有显著差异，B与C、D、E均有显著差异。
表6 第8周 血清ALP检测结果
时间 组别 例数 检验值 P值 8周 A与B 10 LSD-t=5.65 P=0.000 8周 A与C 10 LSD-t=1.03 P=0.313 8周 A与D 10 LSD-t=-7.28 P=0.000 8周 A与E 10 LSD-t=-20.81 P=0.000 8周 B与C 10 LSD-t=--4.62 P=0.000 8周 B与D 10 LSD-t= -12.93 P=0.000 8周 B与E 10 LSD-t= -26.46 P=0.000 8周 C与D 10 LSD-t= -8.31 P=0.000 8周 C与E 10 LSD-t=-21.84 P=0.000 8周 D与E 10 LSD-t=-15.53 P=0.000
8周 A与B、C、D、E 25 F值=214.06 P=0.000 注:A为正常对照组；B为糖尿病对照组；C为糖尿病NGF组；D为糖尿病HA组；E组为糖尿
17
病NGF\\HA组
由表6可看出E组与其他组比较均有显著性差异，A组与B组有显著差异，A
与C组无显著性差异，B与C、D、E均有显著差异。
表7第12周 血清ALP检测结果
时间 组别 例数 检验值 P值 12周 A与B 10 LSD-t=3.70 P=0.001 12周 A与C 10 LSD-t=-2.00 P=0.059 12周 A与D 10 LSD-t=-10.10 P=0.000 12周 A与E 10 LSD-t=-21.27 P=0.000 12周 B与C 10 LSD-t= -5.71 P=0.000 12周 B与D 10 LSD-t= -13.80 P=0.000 12周 B与E 10 LSD-t= -24.97 P=0.000 12周 C与D 10 LSD-t= -8.10 P=0.000 12周 C与E 10 LSD-t=-19.27 P=0.000 12周 D与E 10 LSD-t-=-11.17 P=0.000 12周 A与B、C、D、E 25 F值=198.01 P=0.000 注:A为正常对照组；B为糖尿病对照组；C为糖尿病NGF组；D为糖尿病HA组；E组为糖尿病NGF\\HA组
由表7可看出E组与其他组比较均有显著性差异，A组与B组有显著差异，A与C组无显著性差异，无统计学意义，B与C、D、E均有显著差异. 各时期ALP值变化如下图B。
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图B 各个时期ALP检测结果 4.Ca含量检测
术后各时间点横向观察糖尿病组B、C、A、D、E骨痴组织中Ca含量依次升
高，A组高于B组。纵向观察各组骨痴组织中Ca含量均随时间的增加而增加。A、B、C、D、E各组间比较差异均有统计学意义（P<0.05），见表8：
表8术后各组间比较骨痂钙含量mg/g (⎯x±S)n=5
分组 4周 8周 12周
A组（空白对照组） 158.79±2.26 175.68±2.30 179.59±4.94 B组（糖尿病对照组） 115.21±2.13 121.26±2.10 136.13±4.53 C组（糖尿病NGF组） 135.05±2.78 151.29±2.18 165.40±2.30 D组（糖尿病HA组） 175.78±3.59 186.38±3.96 202.30±2.49 E组（糖尿病NGF/HA组）193.73±2.99 204.16±2.56 221.65±4.50 P值 <0.05 <0.05 <0.05 根据所得数据采用spssv13.0处理，多个样本均数间比较采用方差分析, 多个样本均数间两两比较采用LSD-t检验。检验水准α=0.05,结果表9：
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表9 各钙含量时期两两比较P值
对比组 4周 8周 12周 A:B <0.001 <0.001 <0.001 A:C <0.001 <0.001 <0.05 A:D <0.001 <0.05 <0.001 A:E <0.001 <0.001 <0.001 B:C <0.001 <0.001 <0.05 B:D <0.001 <0.001 <0.001 B:E <0.001 <0.001 <0.001 C:D <0.001 <0.001 <0.001 C:E <0.001 <0.001 <0.001 D:E <0.001 <0.001 <0.05
表9可看出E组与其他组各个时期组织学均有显著性差异，B组与C、D、E各时期均有显著性差异，A组与B组各时期均有显著性差异,各时期骨痂中钙含量变化见下图C ：
图C 各个时期骨痂钙含量检测结果
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5.组织学观察
术后4周E组与D组移植物与宿主骨交界处有软骨细胞及成骨细胞生长，移
植物内有血管生长,均匀分布,无炎性细胞浸润,无异物排斥反应。E组有明显成骨细胞及嗜酸性基质，成骨活跃，E组成骨细胞、纤维母细胞及血管生长量均多于D组,A、B、C组术后4周断端内以纤维结缔组织及少量软骨细胞填充，见大量纤维素，血管少，软骨细胞及血管A组最多，C组次之，B组最少（图13）。术后第8周，E组以成骨细胞为主，可见成熟熟小梁状骨，有骨陷窝细胞生长，呈板状骨排列，由编织骨向板层骨过渡，D组组新生骨继续向中央生长，成骨程度差于E组。B组骨缺损处仍见大量成纤维细胞生长，见少量成骨细胞。A组以成骨细胞生长为主，混合纤维细胞，C组成骨程度介于A组、B组之间，（见图14）。术后第12周，E组骨小梁排列整齐、均匀，皮质骨形成，骨小梁进一步成熟，沿长轴排列，板层结构明显，可见骨髓腔隙形成，见红细胞，D组呈均匀性的成骨现象，成骨梯度消失，骨化程度低于E组，B组仍然以纤维细胞生长为主,骨端骨细胞使骨髓腔封闭，A组C组少量成骨细胞增生（图15）。
根据Lane一Sandhu组织学评分法(表10)，对A、B、C、D、E组的病理组织HE染色涂片进行组织学评分，结果及方差分析见（表11）
表10 Lane-Sandhu组织学评分标准
项目 评分 骨连接 无连接 O 纤维连接 1 骨与类骨连接 2 骨连接 3 骨干完全再生 4 松质骨 无骨细胞活性 0 新骨早期聚集 1 有活性的新骨聚集 2 松质骨正在改造 3 松质骨完全改造 4 皮质骨 无皮质骨生长 0 皮质骨生长的早期表现 1 皮质骨正在形成 2 大部分被改造 3 完全骨形成 4
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表11 组织学检验评分结果方差分析(⎯x±S)n=5
分组 4周 8周 12周
A组（空白对照组） 2.20±0.20 3.40±0.24 3.80±0.37 B组（DM对照组） 0.60±0.24 1.00±0.32 1.40±0.24 C组（DM/NGF组） 1.40±0.24 2.20±0.20 2.60±0.40 D组（DM/HA组） 3.40±0.24 7.80±0.37 8.80±0.37 E组（DM/NGF/HA组） 4.40±0.24 9.60±0.24 11.00±0.32 P值 <0.05 <0.05 <0.05
先行多个方差的齐性检验，证明此4组资料的方差齐，即进行方差分析，显示5组各时期的组织学评分结果有显著性差异,进行两两比较的q检验见表12.
表12 两两比较q检验的P值
对比组 4周 8周 12周 A:B <0.001 <0.001 <0.001 A:C <0.05 <0.05 <0.05 A:D <0.05 <0.001 <0.001 A:E <0.001 <0.001 <0.001 B:C <0.05 <0.05 <0.05 B:D <0.001 <0.001 <0.001 B:E <0.001 <0.001 <0.001 C:D <0.001 <0.001 <0.001 C:E <0.001 <0.001 <0.001 D:E <0.05 <0.001 <0.001
从表12可看出E组与其他组各个时期组织学均有显著性差异，B组与C、D、E各时期均有显著性差异，A组与B组各时期均有显著性差异。C、D、E组之间各时期均有显著性差异,结果见图D。
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图D 组织学检测评分结果
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讨 论
糖尿病致病机理复杂，包括：免疫、微生物感染、自由基毒素、遗传、精神
等诸多因素，导致胰岛素抵、胰岛细胞功能减退，机体内水、电解质、糖、蛋白质、脂肪等代谢紊乱综合征，临床上以高血糖为主要特点。作为一直常见病、多发病，糖尿病患者因严重外伤、肿瘤、感染等诸多原因导致的骨缺损，其骨愈合一直是骨科医师面临的棘手问题。因为糖尿病患者骨愈合过程受到高血糖所导致的一系列生理及病理改变，如：电解质及内分泌紊乱、微血管病变、骨生长因子缺乏等，导致糖尿病患者骨愈合愈合过程较正常骨缺损愈合时间更长，出现不愈合可能性加大，故探索一种针对糖尿病患者骨缺损的，且经济、方便、有效的修复方法是目前研究需要解决的问题。
传统的骨缺损治疗主要有自体骨移植及同种异体骨移植，可是这两种方式均有缺点[6]：自体骨虽然生物相容性好，但取自体骨会给患者带来额外的创伤及痛苦，延长愈合时间；同种异体骨解决了增加患者痛苦的问题，但其因抗原差异，可能存在免疫排斥反应。人工骨运用于临床时间长，没有抗原差异，不存在免疫排斥反应，但其因为缺乏骨愈合所需的生长因子，故促进骨愈合效果不佳。于是学者们在实验研究中将人工骨与某些可促进骨生长的因子结合，增强其骨愈合能力，以达到替代其它的移植骨材料的目的。HA其化学成分与人类骨骼相似，且拥有多微孔结构，能为骨缺损愈合过程中血管、神经、骨沉积提供良好的条件，是经典而有效的骨桥接材料。糖尿病可影响微循环血运，使骨组织血管分布减少，增加毛细血管通透性，改变血管周围基质组成成分及含量，对骨愈合产生不利影响。糖尿病进展过程中使微血管病变，会加重骨营养障碍，引起骨缺血坏死[7]。高血糖亦可抑制胰岛素样生长因子-I((insulin-like growth factor-I ,IGF-I)的合成和释放，IGF有刺激成骨细胞形成、分化功能，刺激胶原合成，最终促进骨基质的形成[8]，NGF促进新生血管形成，使骨缺损部位的血液供应改善，进一步使神经再生，促进骨折愈合，神经肽可刺激IGF形成。对于糖尿病患者的骨缺损治疗，同时将将NGF与HA联合运用，发挥NGF的神经诱导诱导、血管形成、成骨作用及HA的骨传导、骨诱导作用，相互促进，以达到提高临床糖尿病骨缺损治疗的疗效及治愈率。
24
一 糖尿病鼠的骨代谢异常及其机制
经STZ注射后的糖尿病SD大鼠会出现骨和矿物质代谢异常，造成成骨细胞
及成骨量减少，其可能的因素包括:
1钙及维生素D代谢异常 由于高血糖、肾血流动力学的改变及渗透性利
尿，导致肾小管对钙、磷重吸收减少，排泄增加，小肠璧对钙的主动转运动收到影响。糖尿病鼠的血液1，25(OH)2D3也常降低，雄鼠较雌鼠明显。实验证明胰岛素可激活肾1a羟化酶，活性VitD3在骨缺损骨愈合过程中起很重要的促进作用，而在糖尿病鼠机体含量不足，导致其低水平的原因可能是低水平的肾1a羟化酶活性减退及胰岛素降低有关。大鼠机体在糖尿病状态时1，25(OH)2D3减少，可能与血维生素D结合蛋白降低存在相关性。
2胶原合成障碍 骨的矿化是个十分复杂的过程，其中胶原合成骨基质是其
中十分重要的一部分。体内蛋白质及氨基酸的摄取、合成对胰岛素有依赖作用，糖尿病时胰岛素水平降低，影响胶原合成，胶原合成还可因血糖升高导致的对胶原的非酶促糖基化作用而降低，最终使骨脆性增加。
3成骨细胞功能不足 骨缺损愈合过程中，任何影响成骨细胞的发育的因素
都将愈合，糖尿病鼠血糖的升高对骨细胞有刺激作用，相反，因糖尿病时的骨结构改变，高血糖对钙摄取有抑制作用[9]。骨胶原蛋白上在高血糖条件时，生成增加的糖基化终末产物容易沉积在骨胶原蛋白上，而胶原蛋白对骨细胞吸附作用减小，进而影响成骨细胞的分化和增殖及功能
[10]
，并可使如肿瘤坏死因子-a、白细
胞介素一6[11]、一氧化氮分泌[12]等细胞因子活化，促进破骨细胞分化，成熟，活性其增强，骨生成与骨溶解的的平衡被打破，导致骨愈合延迟甚至不愈合。成骨细胞的功能低下、数量不足与胰岛素不足、IGF-1有关，胰岛素和IGF-1结合与成骨细胞表面的受体，胰岛素和IGF-1与受体结合后通过信息传导到细胞内，通过DNA表达效应，促进成骨细胞生成。高萍等[13]研究发现胰岛素与IGF-I的受体在功能与结构上相似，它们的分子序列亦相似，骨细胞生长分化依赖IGF-I的促进作用。
二、糖尿病对骨缺损愈合的影响
骨愈合代谢过程中胰岛素有极其重要的作用，机体胰岛素下降或胰岛素抵
25
抗，可导致骨缺损的不愈合。其表现为：1、胰岛素通过识别成骨细胞表面受体信号传导一系列反应，使成骨细胞功能增强、数量增加，并生成骨基质及胶原；2、25-经化酶可被胰岛素激活，使肾近曲小管1，25(OH)2D3合成增加；3、胰岛素能抑制腺苷酸环化酶、cAMP等，而cAMP有刺激骨质吸收的作用。总之，糖尿病是胰岛素低下通过上述因素影响骨愈合，最后导致I型胶原合成及成骨细胞数量不足，因1，21(OH)2D3不足导致消化道对钙磷吸收减少，排出增加，因cAMP含量不受抑制，骨溶解增加，沉积减小、矿化不足。
高血糖可通过多种途径干扰骨的代谢。高血糖导致渗透性利尿，使尿液中带走大量钙和磷等骨形成必须的矿物质，内分泌系统通过负反馈作用，甲状旁腺代偿性增生，进一步功能亢进，血钙升高，骨质中的钙进入血液，骨缺损愈合便缺少必需的钙。研究表明，不同剂量的葡萄糖可不同程度增加破骨细胞活性，血糖越高破骨细胞越活跃。糖尿病发展过程中，AGEs可通过两种途径影响骨愈合：1在骨胶原的表达增加，直接改变胶原的各种特性，使成骨细胞在胶原中受到抑制，骨强度降低。2 影响免疫系统，刺激单核巨噬细胞IL-6、IL-1的生成，后者能增强破骨细胞的活性，骨吸收增加，影响骨愈合。
James[14] 等发现，糖尿病SD鼠骨折后，其骨折愈合时间较非糖尿病组鼠骨折愈合时间长，骨痂强度差。Beam等[15]对糖尿病大鼠骨折后愈合过程中骨痴成骨细胞活性剂数量进行研究，证明骨痴中细胞活性较对照组降低，糖尿病抑制了细胞增殖。实验证明糖尿病骨愈合过程OC在骨痂中表达低下，成骨细胞转化能力差[16]。有学者在骨折或骨缺损局部使用如TGF-ß 1、bFGF等生长因子，均有不同程度促进骨愈合的作用。骨生长因子如FGF、PDGF、IGF一1、IGF一2、TGF在糖尿病鼠骨折、骨缺损部位减少是导致骨愈合难的主要因素。有学者发现在骨缺损部位存在NGF，并对骨愈合存在促进作用。
糖尿病可使微血管病变，加重骨营养障碍，引起骨缺血坏死
[17]
。微血管病变
影响骨组织周围及内部血管分布，其通透性增加亦可诱导毛细血管周围基质成分变化而影响骨愈合。研究证明糖尿病进展过程中，容易导致微血管等并发症，糖尿病患者骨量进一步丢失。
本实验中，大鼠骨缺损修复第4周，A组与B组对比在ALP含量、骨痂Ca含量、组织学观察均存在显著性差异（P<0.01），A组较B组ALP含量明显增高，
26
HE染色见软骨细胞数量明显增多。骨缺损第8周，A组与B组比较，ALP含量、骨痂Ca含量明显增高、HE染色见成骨细胞数量明显增多、X线评分骨痂形成A多余B组（P<0.01），骨缺损第12周，A组与B组比较，ALP含量、骨痂Ca含量明显增高、HE染色见成骨细胞数量明显增多、X线评分骨痂形成A多余B组（P<0.01）。实验说明糖尿病鼠骨缺损受高血糖影响，其愈合慢于正常鼠骨缺损愈合，且骨细胞数量叫正常组低。
目前对糖尿病骨缺损骨愈合的研究主要集中在以下4个方面:1、局部或全身运用某些骨骼生长因子促进糖尿病骨缺损动物模型的愈合;2、对糖尿病动物骨缺损愈合的力学研究;3、糖尿病骨缺损动物模型对不同填充材料局部反应及组织生长情况的观察。4、对糖尿病骨缺损动物愈合细胞生物学研究。但糖尿病是全身性疾病，糖尿病进展对心、肾、血管、骨骼等多器官及多组织均产生不同影响，其相互影响十分复杂，对骨缺损愈合的影响要完全诠释难度较大，需进一步研究。
三、 神经生长因子（NGF）对骨缺损愈合的作用
在动物体内最早发现的神经营养因子是NGF。神经嵴的神经元支配的靶组织是神经生长因子主要产生来源，它被神经元轴突摄取后运输到胞体，其生物学效应是通过通过调节基因转录而发挥作用。Frenkel在对鸡的胚胎研究过程中发现在软骨和骨细胞中均内含有NGF ,这也是第一次让人们认识到骨中NGF可能对骨细胞生长起作用。胚胎骨形成的一系列过程,与骨缺损愈合有相似之处，NGF存在于骨组织生长旺盛及新生骨细胞活跃的骨痂中,它的实现是通过诱导神经纤维长入胚胎骨组织和骨痂中而实现的
[18-19]
。
NGF细胞表面存在两种可以互相影响的受体，分别为低亲和力与高亲和受体。通过p75 NTR调节神经细胞与血管内皮细胞表达和特异性膜受体TrkA的信号转导的双重影响作用下，NGF对新生骨组织的血管及神经起到积极的诱导作用,并在骨愈合过程中,起到调节作用。神经生长因子在动物体内的分布，总是与交感及感觉神经分布密度较高的组织相关，同时与mRNA含量亦存在数量依赖关系。NGF在不同组织中表达不同[20]。骨组织由自主神经与感觉神经共同支配，研究表明失神经支配的骨缺损的生物力学性能差，表明骨痂的成分和结构改变。成骨细胞及骨祖细胞等产生的NGF 可诱导神经纤维长入骨痂并释放神经肽( CGRP、SP 、VIP 、NPY、ACAP、TH、PGP9.5 等),后者可抑制骨的吸收，刺激骨细胞分化、成
27
熟，促进骨生成。其中CGRP能通过促cAMP形成[21]及与破骨细胞受体相结合的两歌方面达到抑制破骨细胞骨吸收的效果[22]。破骨细胞表面存在神经激肽1受体(NK1-Rs)，SP可与之其结合以发挥调节骨吸收作用[23]。IGF-1是成骨过程中重要的活性因子，对促进骨愈合有促进作用，而高血糖抑制IGF的合成和释放，是对骨愈合的负面影响。神经肽通过刺激IGF-1mRNA表达，使成骨细胞IGF-1生成量增加，是神经生长因子对骨愈合促进因素之一。
骨缺损愈合很大程度上依赖于损伤区血供情况的好坏,因骨缺损导致骨膜丧失,且糖尿病导致微血管病变，进一步导致局部微循障碍,对骨愈合有不良影响。目前研究发现NGF可促进新生血管形成，Lazarovivi等[24]将不同剂量的NGF与人重组VEGF、人重组bFGF进行实验比较，发现NGF与前者有相似的促血管生成效应，且这种效果可被NGF阻滞剂阻断，因此可见NGF对骨缺损愈合过程中新生血管的形成具有重要意义。
总之NGF的生物学效应主要表现在神经再生作用、促新血管形成、促进运动神经元对神经营养物质的合成、促进骨骼肌钙泵活性的恢复、细胞间信息传递的作用、增强葡萄糖引起的胰岛素分泌作用等方面。其中NGF对于糖尿病导致的毛细血管内皮细胞生长抑制及低水平胰岛素对骨缺损愈合造成的不利影响有相反的作用,NGF最终对促进糖尿病骨缺损的愈合起到重要作用.
本实验中，大鼠骨缺损修复第4周，C组与B组对比在ALP含量、骨痂Ca含量、组织学观察评分均存在显著性差异（P<0.05），C组较B组ALP含量、骨痂Ca含量明显增加，HE染色见软骨细胞增生活跃、血管生成多。骨缺损第8周，C组与B组比较，前者ALP含量、骨痂Ca含量明显较高、HE染色见成骨细胞数量明显多、X线评分骨痂形成C多于B组（P<0.05），骨缺损第12周，C组与B组比较，ALP含量、骨痂Ca含量、HE染色见成骨细胞数量、X线评分骨痂生成量存在显著差异（P<0.05），C组均大于B组。D与E组比较术后第4、8、12周，两组动物骨痂形成量、成骨细胞数目及ALP含量及影像学评分均存在显著差异（P<0.05），E组均大于D组，实验说明NGF对糖尿病鼠骨缺损愈合有促进作用。
四 羟基磷灰石生（HA）
上世纪70年代，研究发现珊瑚骨的空隙结构与人类骨骼相似，于是学者们开始了对珊瑚骨材料在医学上的研究。珊瑚骨有多孔结构，在骨修复的过程中这
28
些空隙利于宿主骨细胞、纤维组织长入，且珊瑚骨与骨组织成分相似，有较强亲和力及良好的骨传导性[25-27]。HA生物陶瓷为有多孔的支架结构，其孔隙率高达百分之七十，为骨组织生长过程中组织及细胞提供了良好的生长环境。HA的的成分与动物骨骼相似，主要为钙和磷，这两种离子在植入后可缓慢溶解于周围组织，并与骨组织的钙、磷离子形成共价键，周围骨原细胞与HA内的钙、磷离子紧密结合后，起到引导作用，从而使骨原细胞长入HA，逐渐转化成骨细胞并替代HA[28]。HA植入后新生骨痂生不仅长于材料孔隙内，表面也存在覆盖，其内外骨组织可精密结合。随时间延迟，HA本身开始降解，钙、磷等离子解离出来，人工骨的小梁变细，逐渐消失，但这时间较长，约32~60周。人工骨中心降解最快，而皮质区成骨最明显。[29]
总之HA来源丰富，与人体骨组织结构与成分相似，有适宜的孔间隙，无抗原性，无炎性细胞浸润，有良好的组织相容性[30],能为新生骨提供良好的骨组织生长环境，利于血管长入、钙质沉积、骨细胞增长，成骨潜能已被证实。
本实验中，D、E组均使用HA，而A、B、C组未使用。在骨缺损愈合过程中，第4、8、12周D、E组大鼠在ALP、组织学细胞评分、X线骨痂形成评分及骨痂Ca含量与A、B、C均存在显著差异，具有统计学意义（P<0.01），D、E组成骨能力均明显大于A、B、C任何一组，说明HA对骨缺损愈合起到骨传导、促进骨愈合的作用。
五 NGF与HA的联合运用
糖尿病鼠骨缺损因电解质紊乱、胰岛素低下、微血管病变、成骨细胞功能低下、生长因子缺乏等多方面因素导致骨愈合困难，是目前研究的难题。骨缺损愈合需要多种生长因子及适宜的骨填充材料。bFGF、TGF一p、IGF、EGF等均在骨折愈合的不同阶段起着重要作用。NGF对破骨细胞的骨吸收有抑制作用；促进新生血管生成；增强胰岛素分泌,而前述胰岛素是促进骨愈合的因素；促进神经的芽生，对神经纤维长入骨组织有明显的诱导作用,并进一步促进骨缺损处骨母细胞的分化成熟。HA具良好的组织相容性，无排异反应，一定的机械强度，适宜的孔径，是骨缺损良好的填充材料。本实验将HA与NGF联合运用，二者相辅相成，为骨缺损愈合提供良好的生长条件及促进骨细胞生成的因子，是较为理想的组合。
29
本实验中影像学、组织学、ALP、骨痂Ca含量观察结果显示，各组成骨能力依次为E>D>A>C>B,E组（HA/NGF）的成骨效应在第4、8、12周明显优于其他组（P<0.001），其新生骨痂生成早、体积大、皮质骨及骨髓腔形成最早，组织学见其4周软骨细胞生成最多，8周大量成骨细胞，12周时骨小梁排列整齐、均匀，皮质骨形成，均优于各组，较D组亦有明显差异（P<0.01），同时C组与B组比较，各时期其ALP及组织学评分均高于B组，骨愈合强于B组，说明NGF有促进骨愈合的作用。E组高于D组，说明NGF的促骨生长作用与HA的股传导具有协同作用。同时第4、8、12周，使用了NGF的C、E组组织学观察其血管生成与B组均存在显著差异（P<0.01），说明NGF有促进新生血管形成的作用。X线影像学显示E组与各时期新生骨均多余其他组，12周时植入骨与自体骨融合最好，分界线基本消失,均说明HA/NGF组有较好的促骨缺损愈合的作用。
本实验以HA为基础，结合NGF对糖尿病鼠骨缺损愈合起到良好的促进效应，那可设想HA与多种骨生长因子联合应用是否任然具有协同作用？多种因子间作用机制与原理如何？NGF性质不稳定，在体内容易分解，是否能寻求一种使NGF与HA结合的同时，控制NGF缓慢缓释的物质，以进一步增加其临床价值？
结 论
NGF与HA联合运用具有良好的诱导成骨作用，使骨细胞增生活跃，加快糖尿
病鼠骨缺损愈合。
30
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32
附图
实验动物及试剂
附图（1）8周龄SD大鼠 附图（2）神经生长因子
附图（3）羟基磷灰石 附图（4）链脲佐菌素
33
骨缺损模型建立
图（5）骨缺损模型：右胫骨中上段 图（6）骨缺损中植入羟基磷灰石
4mm缺损
术后标本大体观察
图（7）：术后第4周大体形态观察
A、B、C组以纤维组织为主，D、E组骨缺损处新生硬组织以纤维组织与软骨组织混合生长，E组软骨较多，与HA分界不清，骨痂向中央部延伸.
A
B
C
D
E
34
A
B
C
D
E
图（8）术后第八周大体形态观察
C、A、B组各组骨缺损处以软骨组织及少量或中量骨样组织为主，密度依次减小，A、B组仍以纤维组织为主，B组两断端可见硬化骨，D、E组骨缺损端见骨性骨痴呈梭形生长，HA被包埋。
图（9）术后第十二周大体形态观察
A、C组缺损区以骨组织为主，含部分软骨样组织，B组以纤维结缔组织为主，无骨性连接。D、E组骨缺损端无活动，E组移植物被骨痂完全包埋，与宿主骨界限消失，D组骨痂大部分包埋移植物，软骨组织及骨样组织较前继续增加。
A
B
C
D
E
35
术后X线观察结果
术后X线观察结果
D
E
A
B
C
图（10） 术后4周X线观察
A、B、C组未见明显骨组织形成，E组及D组截骨植入材料区与断端交界处见有模糊新生骨影，尤以E组明显。
36
A B C
D E
图（11）术后8周X线观察
A组少量骨痂生成，B组仍无骨痂形成，移植物与宿主骨界线清晰，C组骨痂量少，与A组无明显差异，D组新生骨增多，E组明显增多。
37
A B C
D E
图（12）术后12周X线观察
A、C组有部分骨痂连接，B组仍未见明显骨痂，D、E组骨痂体积大，与宿
主骨融合，周围新生骨痴包裹超过E大于D组，E组基本愈合，羟基磷灰石未完全吸收。
38
A
B
C C
D
E
图（13）术后第四周 HE染色×100
A、B、C组术后4周断端内以纤维结缔组织及少量软骨细胞填充，见大量纤
维素，血管少，软骨细胞及血管A组最多，C组次之，B组最少。E组与D组移植物与宿主骨交界处有软骨细胞及成骨细胞生长， E组有明显成骨细胞及嗜酸性基质，成骨活跃，E组成骨细胞、纤维母细胞及血管生长量均多于D组。
39
A B
C D
E
图（14）术后第8周HE染色×100
A组以成骨细胞生长为主，混合纤维细胞，C组成骨程度介于A组、B组之间，B组骨缺损处仍见大量成纤维细胞生长，见少量成骨细胞。E组以成骨细胞为主，可见成熟熟小梁状骨，有骨陷窝细胞生长，呈板状骨排列，由编织骨向板层骨过渡，D组组新生骨继续向中央生长，成骨程度差于E组。
40
A
B
C
D
E
图（15）术后第12周HE染色×100
A组C组少量成骨细胞增生，B组仍然以纤维细胞生长为主, D组呈均匀性
的成骨现象，成骨梯度消失，E组骨小梁排列整齐、均匀，皮质骨形成，骨小梁进一步成熟，沿长轴排列，板层结构明显。
41
综述
神经生长因子对糖尿病患者骨缺损治疗的影响 糖尿病的代谢紊乱主要体现在胰岛素抵抗或胰岛素分泌不足，血糖升高，
进一步可影响全身多处组织与器官，包括肾脏、神经、骨等等。各种原因如外伤、肿瘤等导致的骨骼的完整性遭到破坏，称为骨缺损。目前随着人口老龄化加快及生活水平的提高，DM的发病率逐年递增，在庞大的人口基数基础之上，众多的糖尿病患者，如果出现了骨折或是骨缺损，在治疗方面延迟愈合率或不愈合率高，成为临床医师所面临的难题。
1糖尿病骨缺损愈合的相关因素
糖尿病骨缺损难以愈合的原因一直倍受国内外学者的关注，近年以来，国内外对其病因研究，主要集中在以下几个方面:
1.1电解质及内分泌紊乱 目前，国内外部分学者认为由于糖尿病患者尿
液中含糖量增加，使得渗透性利尿作用增强，渗透性利尿可使磷、钙、镁等离子重吸收减少，缺乏基本的骨组成元素，骨质出现疏松，影响成骨细胞的骨化及骨缺损愈合。而低钙、低镁对甲状旁腺的负反馈作用，使甲状旁腺激素 (parathyroid hormone，pTH)分泌增加，升高血钙，溶骨增强。糖基化终末产物(Advanced glyeosylation endproduets，AGEs)形成增加与血糖过高有关，AGEs可以导致生长因子粘附到骨细胞的过程障碍及骨的原始细胞分化受损，同时破骨细胞对白介素一6的吸收增加，并可提高破骨细胞活性，加速骨吸收。胰岛素可促进骨细胞内氨基酸蓄积，使骨细胞核苷合成增加，进而促进钙沉积。在糖尿病发展过程中，胰岛B细胞功能受损，胰岛素分泌不足，骨基质转换、成熟障碍，钙镁等离子进一步流失，骨质疏松加重。 胰岛素分泌匮乏或完全丧失，机体难以利用1.25(OH)D3 ，导致骨钙素(osteocakin，OC)的低水平，影响骨愈合。
1.2微血管病 在骨愈合过程中，微血管的分布及状态对骨愈合产生重大影
响，而糖尿病导致的微血管病变，使新生骨组织周围血管分布减少，同时毛细血管通透性改变，使毛细血管周围基质成分及数量发生变化，对骨重建产生不利影
42
响。糖尿病进展过程中使微血管病变，血流量供应不足，骨细胞营养障碍，最终导致骨坏死。
1.3 多种生物活性因子 随着细胞生物学与分一子生物学的研究进展，影
响骨代谢的细胞因子在骨折愈合过程中的作用受到重视。以往研究表间充质细胞可在骨形态发生蛋白-2(bone morphogenetic protein-2, BMP-2)的刺激下分化为成软骨细胞和成骨细胞，诱导新骨形成;血管内皮细胞生长因子(Vaseular endothelial growth faetor，VEGF)在骨修复过程起到重要作用;胰岛素样生长因子-I((insulin-like growth factor-I ,IGF-I)分别作用于：成骨细胞的前体细胞及成骨细胞，分布通过刺激成骨细胞成熟、促进其分化功能，增加胶原合成，最终促进骨生长及愈合。护骨素（OPG）、护骨素配体（OPGL）及肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体（TRAIL）已证实是破骨细胞活化的诸多因素中的三个。糖尿病使OPG含量减少，其他二者增加，从而活化破骨细胞，增强骨吸收，影响骨愈合
[1]
。研究发现高糖环境下，血清中IL一6、IL一1水平均这些因子之前具有相
互促进的作用，对破骨细胞的分化及激活起促进作用，加速骨质溶解吸收[2]。 骨组织中含有降钙素基因相关肽(calcitonin gene related peptide,CGRP)、P物质(substanceP,SP)、血管活性肠肽 (vasoactive intestinal polypeptide,VIP)、神经肽(neuropeptideY,YNPY)和腺苷酸环化酶激活肽( adenylate cyclase activating polypeptide , ACAP) 等多种神经肽类，NPY为交感神经递质，VIP为副交感神经递质，这两类递质可不同程度的作用于成骨细胞与破骨细胞而产生生物学效应。糖尿病患者已证实其CGRP水平因微血管病
[3]
变而出现降低。骨细胞生长活跃的组织中，CGRP水平一般较高，骨细胞和破骨
细胞的分化、成熟、活性均受CGRP影响，对骨缺损愈合有很大意义。降钙素基因相关肽免疫阳性神经纤维含CGRP，它来源于感觉神经且主要分布在代谢活跃的骨结构中，而骨不连组织中却缺乏感觉神经纤维的支配。
骨缺损愈合修复过种中，局部存在神经生长因子( nerve growth factor,NGF)，及其受体表达[4-6]，局部或全身增加内源性或外源性NGF，对骨缺损具有加速修复作用。NGF于1953年被发现,对调节动物体内神经元生长、发育、分化起着促进与调控作用[7]，，进一步研究发现其对骨愈合亦有促进作用。
43
2 神经生长因子对骨愈合的影响
2.1 NGF结构 NGF是由3种不同类型的蛋白质组成的复合物,NGF细胞表面
有两种受体: 低亲和力受体及高亲和力受体,高亲和力受体，高亲和力受体参与调节神经元细胞的存活与凋亡。低亲和与高亲和受体产生的效应可相互影响，起
[8]
到限制或者促进作用。NGF可通过对上述受体的信号转导，调节对血管内皮细
胞、神经细胞受体的亲和力，在骨缺损愈合过程中，使神经纤维及微血管伸入新生骨细胞及组织中，加速骨愈合。
2.2 NGF的生物学效应 NGF生物学效应广泛,主要表现在以下几个方面:
①对骨痂处的神经纤维诱导，使其长入，促进骨愈合；②作用于再生轴突表面的受体，介导其再生长与趋化 ；③使微血管平滑肌内钙离子减少，平滑肌松弛，血管管径变大，血流量增加； ④促进白细胞介素等炎性因子趋化；⑤NGF存在于骨骼肌中[9],各种神经营养物质的合成与NGF对神经元细胞的促进作用有关。张贵春等[10]研究证实NGF对加速肌肉组织、骨组织的修复；⑥注入机体或自身产生的NGF均对NGF受体有亲和力,能够将细胞之间信息相互传递,从而增强骨细胞磷酸化及骨化能力；⑦NGF被证实可使机体对高糖的敏感性增强,增加胰岛素分泌[11]。
2.3神经生长因子在骨组织中的表达 在不同的组织中，NGF类型不同，
且有不同的反应性和表达[12]。骨组织受感觉、运动神经支配，实验证明在神经损伤后，其支配区骨组织的愈合慢，虽然骨痂体积未见减小，但其强度均较神经未损伤者差，表明骨痂内成分出现了变化。研究表明，在骨缺损区神经纤维的生长障碍，含量少或完全缺乏，可能是骨缺损不愈合的重要因素[13]。研究发现骨痂中存在含有CGRP、SP、VIP及NPY等神经因子的肽能神经纤维，且这些神经纤维生长分布与骨生成活跃区域有关。同时在体外培养试验中，也发现神经生长因子的信使RNA存在于成骨细胞系中，因此骨细胞及骨组织的修复，神经生长因子起着十分重要的作用
[14]
。
2.4 神经生长因子在糖尿病骨缺损修复中的作用 糖尿病可导致的微
血管病变，使血流量改变，新生骨组织周围血管分布减少，同时毛细血管周围基质成分及数量发生变化，对骨重建产生不利影响。NGF促进新生血管形成，使骨缺损部位的血液供应改善，进一步使神经再生，促进骨折愈合。IGF对骨愈合有
44
积极促进作用，而高血糖抑制其合成和释放。章冬梅等[15]研究发现，糖尿病患者机体内IGF-l含量较比明显低于对照组，IGF含量减少，骨密度亦减小。王新等
[16]
研究发现神经肽可刺激IGF-1mRNA表达，从而促进成骨细胞分泌IGF-1，是神
经生长因子对骨愈合因素之一。Letic-Gavrilovic等[17]在骨折处局部运用NGF-β，可提高成骨细胞活性及成骨强度。
3 神经生长因子与支架材料结合在骨缺损治疗进展
糖尿病患者的骨缺损愈合较正常患者时间更长，不愈合几率更大，需要更完
善的支架材料，并且与适宜的促骨愈合生长因子结合，提高骨愈合能力。考虑临床使用过程中方便，经济，有效，需要适宜的缓释材料及支架材料。在临床及实验研究中常需将细胞因子与具有骨诱导特性、无排异反应的生物支架复合,达到骨诱导与骨传导的作用。常用的材料有自体及异体骨、磷酸三钙和羟基磷灰石人工骨、聚乳酸、 聚羟基乙酸等多聚物人工骨、胶原、纤维蛋白复合人工骨等，并都有临床运用。在实际运用中各有优缺点：象疾病传播、强度不够、材料处理困难、缺少细胞长入的合适的孔隙、材料来源受限等等。磷酸钙水泥(calcium phosphatecement, CPC)作为NGF 的载体，CPC降解速率慢于骨形成率，其降解产物对成骨细胞及其前体细胞有轻微的抑制作用[18] 。NGF容易失活，为保持其活性和局部有效浓度，以达到局部NGF能持续性释放并产生生物学效应的目的，需寻求一种支架材料同时具有保持NGF活性并能缓慢释放以达到其促骨愈合的作用。
4 展望
糖尿病患者骨缺损愈合慢，不愈合率或延迟愈合率高，是临床医师所面临
的难题。现今对糖尿病患者合并各种原因导致的骨缺损愈合问题，已做了初步的探讨与研究，这类特殊群体骨愈合过程，局部骨痴组织中多种细胞因子明显降低、分泌紊乱及电解质失衡等一系列因素导致成骨细胞增殖下降。NGF对体内多种组织器官均有影响，对骨缺损后骨愈合起着促进作用。内源性与外源性NGF结构、功能及活性大致相同,而目前NGF制剂已早用于临床，动物实验及临床无明显不良反应。NGF是生物制品,与化学合成药品有所不同,它具有副作用少、高效、安全且无抗体产生的诸多优点,易于临床推广使用。目前的骨缺损填充载体材料存在许多不足之处：无机材料不容易塑形，诱导成骨能力不强;高分子聚合材料，降
45
解速度难以调控，且生物相容性差；同种异体骨来源少、可能引起免疫反应，安全性难以保障;各种克服上述缺点复合材料仍在研究过程中。载体材料在实验研究领域已经显示出了积极的作用和相当大的发展前景，但是在进入临床应用之前，尚有很多问题需要解决。为了准确地评价。研究生长因子网络的作用以及各种因子之间的相互关系，如何联合应用诸生长因子，使其在治疗骨折、骨缺损中更好地发挥协同作用，须深入探讨;同时，寻找合适的载体、载体与生长因子的复合方法、剂量以及如何保持生长因子的活性等都需要进一步研究。
46
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攻读学位期间发表的论文及所获奖励
曾鸣 王愉思 神经生长因子对糖尿病患者骨缺损治疗的影响 临床医学研究
2012, 29(3) ：571—573
48
致 谢
弹指一挥间，研究生三年的时光飞逝而过，谨借此论文完成之际，谨向那些给予我帮助和指导的人们表示衷心的谢意。
学海无涯师恩难忘，向尊敬的导师王愉思教授表示衷心的感谢。感谢王老师三年来在我的学习、工作和生活中的谆谆教诲和无微不至的关怀，导师善良的品质，精湛的医术，高尚的医德，严谨的治学态度使我受益匪浅，他的精神将成为我人生中的启明灯，指向标。
衷心感谢南华大学学校领导和南华大学研究生院全体院领导和老师对我一 如既往的关怀和教育！
衷心感谢湖南省人民医院骨科王家让主任、黄象望主任、李晓声主任、刘宏主任对学生的指导，特别感谢刘宝荣教授三年来对我学习、工作和生活的热忱支持和无私帮助！感谢阎戈副教授、魏磊平副教授、康亦峰副教授及骨外科全体医护人员对我的关心与指教。对在骨外科这个积极进取、团结活泼的大集体中我度过了充实而又愉快的两年余，期间学到的知识让我受益终生！
感谢实验室、放射科的各位老师对学生全力支持，感谢同学李硕夫、王常元、黄焱、常磊、刘晶、张建武、陶功稆，师弟刘波、戴畅对我的无私帮助！感谢三年来与我风雨同舟的同学、朋友们，感谢你们在学习、生活和工作中给予我的诸多关心和帮助。
最后，衷心的感谢我的父母和家人，感激他们多年来对我一如既往的关心、支持与付出。
最后愿师生情谊地久天长。
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