VEGF基因修饰兔骨髓间充质干细胞的研究

中国组织工程研究与临床康复第　２眷第　２　劳２００８—０３一ｌ８出版　胁ｆｃＭ　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆＣｌｉｎｉｃａｌ　Ｒｅｈａｂｉｌｉｔａｔｉｖｅ　Ｔｉｓｓｕｅ　Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ　ＭⅡ　＾１８．２００８　Ｖｏ１．１２　Ｎｏ　１２　Ｓｔｕｄｙ　ｏｆ　ＶＥＧＦ　ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ　ｏｎ　ｒａｂｂｉｔ　ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ　ｓｔｅｍ　ｃｅｌｌｓ＊冰☆　ｘｕ　Ｓｏｎｇ—ｂａｉ’Ｚｈａｏ　Ｇａｎｇ’Ｚｈａｏ　Ｈｏｎｇ—ｇｕａｎｇ　，Ｘｕ　Ｋａｎ’Ｙｕ　Ｈｏｎｇ—ｑｕａｎ’Ｈｏｕ　Ｙｉ。　，，，，Ａｂｓｔｒａｃｔ　ＢＡＣＫＧＲ０ＵＮＤ：Ｖａｓｃｕｌａｒ　ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ　ｇｒｏｗｔｈ　ｆａｃｔｏｒ（ＶＥＧＦ１　ｉｓ　ａ　ｖｅｒｙ　ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ　ｗａｙ　ｔｏ　ｍａｋｅ　ｔｉｓｓｕｅ　ｅｎｇｉｎｅｅｒ　ｂｏｎｅ　ｖａｓｃｕｌａｒｉｚａｔｉｏｎ．　。Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ　Ｎｅｕｒｏｓｕｒｇｅｒｙ，　ｏｆ　Ｈｏｗｅｖｅｒ，ｂｅｃａｕｓｅ　ｏｆ　ｅｘｐｅｎｓｉｖｅ　ａｎｄ　ｓｈｏｒｔ　ｈａｌｆ－ｌｉｆｅ，ＶＥＧＦ　ｃａｎｎｏｔ　ｍａｉｎｔａｉｎ　ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ　ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ　ｉｎ　ｂｌｏｏｄ　ａｆｔｅｒ　ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ．Ｔｏ　ｒｅｓｏｌｖｅ　ｔｈｅ　ｐｒｏｂｌｅｍ　ｅｆｆｅｃｔｉｖｅｌｙ，ｇｅｎｅ　ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ　ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ　ｉｓ　ｕｓｅｄ　ｉｎ　ｔｈｉｓ　ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ　ｔｏ　ｔｒａｎｓｆｅｒ　ｈｕｍａｎ　ＶＥＧＦ　ｉｎｔｏ　ｓｅｅｄ　ｃｅｌｌｓ—ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ　ｓｔｅｍ　ｃｅｌｌｓ（ＭＳＣｓ）ｏｆ　ｔｉｓｓｕｅ　ｅｎｇｉｎｅｅｒ　ｂｏｎｅ　ａｎｄ　ｔｏ　ｍａｋｅ　ｉｔ　ｓｅｃｒｅｔｅ　ＶＥＧＦ　ｗｈｉｃｈ　ｃｏｕｌｄ　ｖａｓｃｕｌａｒｉｚｅ　ｂｏｎｅ．　ＯＢＪＥＣＴＩＶＥ：Ｔｏ　ｅｘｐｌｏｒｅ　ｔｈｅ　ｐｏｓｓｉｂｉｌｉｔｙ　ｏｆ　ｈｕｍａｎ　ｖａｓｃｕｌａｒ　ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ　ｇｒｏｗｔｈ　ｆａｃｔｏｒ　ｌ　６５（ＶＥＧＦ㈨）ｔｏ　ｔｒａｎｓｆｅｃｔ　ｒａｂｂｉｔ　ＭＳＣｓ，ａｎｄ　ｅｓｔａｂｌｉｓｈ　ｔｈｅ　ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ　ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ　ｏｆ　ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ　ｔｉｓｓｕｅ　ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ　ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ　ａｎｄ　ｔｈｅ　ｔｒｅａｔｍｅｎｔ　ｏｆ　ｊｓｃｈｅｍｉｃ　ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ．　ＤＥＳＩＧＮ：Ｏｂｓｅｒｖａｔｉｏｎ　ｃｏｎｔｒｏｌ　ｔｒａｉｌ．　ＳＥＴＴＩＮＧ：Ｆｉｒｓｔ　Ｈｏｓｐｉｔａｌ　ｏｆ　Ｊｉｌｉｎ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　ａｎｄ　Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ　ｏｆ　Ｆｒｏｎｔｉｅｒ　Ｍｅｄｉｃａｌ　Ｓｃｉｅｎｃｅｓ　ｏｆ　Ｊｉｌｉｎ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ．　ＭＡＴＥＲＩＡＬＳ：Ｔｈｅ　ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ　ｗａｓ　ｃｏｎｄｕｃｔｅｄ　ｉｎ　ｔｈｅ　Ｋｅｙ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（ＢＳＬ．２１　ｏｆ　Ｆｒｏｎｔｉｅｒ　Ｍｅｄｉｃａｌ　Ｓｃｉｅｎｃｅｓ　ｏｆ　Ｊｉｌｉｎ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　ｂｅｔｗｅｅｎ　Ｊｕｎｅ　２００３　ａｎｄ　Ａｕｇｕｓｔ　２００４．Ｈｅａｌｔｈ　Ｎｅｗ　Ｚｅａｌａｎｄ　ｗｈｉｔｅ　ｒａｂｂｉｔｓ，４．０　５　０　ｍｏｎｔｈｓ　ｏｌｄ，ｗｅｉｇｈｉｎｇ　２．５—３．５　ｋｇ．ｈａｌｆ　ｍａｌｅ　ａｎｄ　ｈａｌｆ　ｆｅｍａｌｅ，ｗｅｒｅ　ｐｒｏｖｉｄｅｄ　ｂｙ　Ａｎｉｍａｌ　Ｃｅｎｔｅｒ　ｏｆ　Ｊｉｌｉｎ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ．Ｔｈｅ　ｒａｂｂｉｔｓ　ｗｅｒｅ　ｈａｎｄｌｅｄ　ｕｎｄｅｒ　ａｓｅｐｓｉｓ　ａｎｄ　ａｎｅｓｔｈｅｔｉｚｅｄ　ｃｏｎｄｉｔｉｏｎ　ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｉｎｇ　ｔｏ　ｔｈｅ　ａｎｉｍａｌ　ｅｔｈｉｃａｌ　ｓｔｎａｄａｒｄ．Ｍｅｄｉｃｉｎｅ　ａｎｄ　ｒｅａｇｅｎｔｓ：Ｈａｍ　Ｆ　ｌ　２　ｃｕｌｔｕｒｅ　ｍｅｄｉａ（Ｇｉｂｃｏ，Ｕ．Ｓ），ＭＴＴ（Ｓｉｇｍａ，Ｕ．Ｓ）　ＰＬＸＳＮＫＤＲｐ—ＶＥＧＦＩ６５　ａｎｄ　ｐｃＤＮＡ　３．０　ｖｅｃｔｏｒｓ　ｗｅｒｅ　ｐｒｅｐａｒｅｄ　ｉｎ　ｔｈｅ　ｐｒｅｓｅｎｔ　ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ．ＥＬＩＳＡ　ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ　ｋｉｔ（Ｊｉｎｇｍｅｉ　ｃｏｍｐａｎｙ．　Ｓｈｅｎｚｈｅｎ），ＤＨ５Ⅱ，ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ　ｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅｓ　Ｂａｍ　Ｈ　Ｉ，Ｘｈｏｌ　Ｉ，Ｈｉｎｄ　ＩＩＩ，ＥｃｏＲ　Ｉ　ａｎｄ　ｓｔａｎｄａｒｄ　ＤＮＡ　ｍｏｌｅｃｕｌｅ（Ｐｒｏｍｅｇａ，　Ｕ．Ｓ１　ｗｅｒｅ　ａｌｓｏ　ｕｓｅｄ　ｉｎ　ｔｈｉｓ　ｓｔｕｄｙ．　ＭＥＴＨＯＤＳ：Ｒａｂｂｉｔｓ’ＭＳＣｓ　ｗｅｒｅ　ｓｅｐａｒａｔｅｄ　ａｎｄ　ｃｕｌｔｉｖａｔｅｄ．Ｔｈｅ　ｐｃＤＮＡ　３．０．ｈＶＥＧＦ１６５　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｖｅｃｔｏｒ　ｗａｓ　ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｅｄ　ａｎｄ　ｉｄｅｎｔｉｉｆｅｄ．ｐｃＤＮＡ３．０一ＶＥＧＦ１６５　ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｖｅｃｔｏｒ　ｗａｓ　ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｅｄ，ｔｈｅ　ｖｅｃｔｏｒ　ｗａｓ　ｕｓｅｄ　ｄｉｒｅｃｔｌｙ　ｔｏ　ｔｒａｎｓｆｅｃｔ　ＭＳＣｓ．Ｔｈｅ　ｃｕｌｔｕｒａｌ　ｓｕｐｅｒｎａｔａｎｔ　ｔｈｅｎ　ｗａｓ　ｃｏｌｌｅｃｔｅｄ　ａｎｄ　ｔｈｅ　ｓｏｌｕｂｌｅ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｏｆ　ｈｕｍａｎ　ＶＥＧＦ　ｇｅｎｅ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｗａｓ　ａｎａｌｙｚｅｄ　ｗｉｔｈ　ＥＬＩＳＡ　ｍｅｔｈｏｄ　Ｔｈｅ　ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ　ｃａｐａｂｉｌｉｔｙ　ｏｆ　ｈｕｍａｎ　ｕｍｂｉｌｉｃａｌ　ｖｅｉｎ　ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ　ｃｅｌｌｓ（ＨＵＶＥＣ１　ｓｔｉｍｕｌａｔｅｄ　ｂｙ　ｔｈｅ　ｓｕｐｅｒｎａｔａｎｔ　ｗａｓ　ｍｅａｓｕｒｅｄ　ｗｉｔｈ　ＭＴＴ　ｍｅｔｈｏｄｓ．ｕｎｔｒｅａｔｅｄ　ＭＳＣｓ　ａｎｄ　ｐｃＤＮＡ３．０　ｔｒａｎｓｆｅｃｔｅｄ　ＭＳＣｓ　ｗｅｒｅ　ｕｓｅｄ　ａｓ　ｃｏｎｔｒｏｌ　ｇｒｏｕｐｓ　ＭＡＩＮ　０ＵＴＣ０ＭＥ　ＭＥＡＳＵＲＥＳ：（１）Ｒｅｓｕｌｔ　ｏｆ　ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ　ｅｎｚｙｍｅ　ｄｉｇｅｓｔｉｏｎ　ａｎｄ　ＤＮＡ　ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ　ｐｌａｓｍｉｄ　ｐｃＤＮＡ３．０一ＶＥＧＦＩ６５；　ｔｈｅ　ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ　ｏｆ　ｈｕｍａｎ　ＶＥＧＦＩ６５　ｐｒｏｔｅｉｎｓ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｔｒａｎｓｆｅｃｔｅｄ　ＭＳＣｓ　ａｎａｌｙｚｅｄ　ｂｙ　ＡＢｅ—ＥＬＩＳＡ；⑧ＭＴＴ　ｍｅｔｈｏｄ　ｗａｓ　ｕｓｅｄ　ｔｏ　ｄｅｔｅｃｔ　ｔｈｅ　ｅｆｆｅｃｔｓ　ｏｆ　ＭＳＣｓ　ｃｕｌｔｕｒｅ　ｓｕｐｅｒｎａｔａｎｔ　ｔｒａｎｓｆｅｃｔｅｄ　ｗｉｔｈ　ＶＥＧＦ】６５　ｏｎ　ＨＵＶＥＣ　ｃｅｌｌｓ　ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ　ａｂｉｌｉｔｙ．　ＲＥＳＵＬＴＳ：　）Ｒｅｓｕｌｔ　ｏｆ　ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ　ｅｎｚｙｍｅ　ｄｉｇｅｓｔｉｏｎ　ａｎｄ　ＤＮＡ　ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ　ｐｌａｓｍｉｄ：Ｔｈｅ　ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｅｄ　ｐｌａｓｍｉｄ　ｗａｓ　ｄｉｇｅｓｔｅｄ　ｗｉｔｈ　Ｈｉｎｄ　ＩＩＩ　ａｎｄ　ＸＨｏｌ　Ｉ．ａｎｄ　ｔｈｅｎ　ｔｗｏ　ｐｉｅｃｅｓ　ｆｒａｇｍｅｎｔｓ　ｗｅｒｅ　ｊｓｏｌａｔｅｄ　ｗｉｔｈ　ａｇａｒｏｓｅ　ｇｅｌ　ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ．ｗｈｉｃｈ　ｗａｓ　ａｃｃｏｒｄａｎｃｅ　ｗｉｔｈ　ｅｘｐｅｃｔｅｄ　ｒｅｓｕｌｔｓ．Ａｎｄ　ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ　ｒｅｓｕｌｔｓ　ｓｈｏｗｅｄ　ｔｈａｔ　ｐｃＤＮＡ３，０一ＶＥＧＦ】６５　ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｖｅｃｔｏｒ　ｗａｓ　ｓｕｃｃｅｓｓｆｕｌｌｙ　ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｅｄ．（２）ＡＢＣ—ＥＬＩＳＡ　ｍｅｔｈｏｄ：Ｃｏｍｐａｒｅｄ　ｗｉｔｈ　ｔｈｅ　ｃｏｎｔｒｏｌ　ｇｒｏｕｐ，ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｈｕｍａｎ　ＶＥＧＦ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｉｎ　ｔｈｅ　ｓｕｐｅｒｎａｔａｎｔ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｃｕｌｔｕｒｅｄ　ｃｅｌｌｓ　ｉｎｃｒｅａｓｅｄ　ｓｊｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙ　ａｆｔｅｒ　ｔｈｅ　ＭＳＣｓ　ｗｅｒｅ　ｔｒａｎｓｆｅｃｔｅｄ　ｗｉｔｈ　ｐｃＤＮＡ３．０一ＶＥＧＦ　６５　ｆｏｒ　２４，４８，７２　ｈｏｕｒｓ（Ｐ＜０．０５１．　ＭＴＴ　ｍｅｔｈｏｄ　ｗａｓ　ｕｓｅｄ　ｔｏ　ｄｅｔｅｃｔ　ｔｈｅ　ｅｆｆｅｃｔｓ　ｏｆ　ＭＳＣｓ　ｃｕｌｔｕｒｅ　ｓｕｐｅｒｎａｔａｎｔ　ｔｒａｎｓｆｅｃｔｅｄ　ｗｉｔｈ　ＶＥＧＦ　ｌ　６５　ｏｎ　ＨＵＶＥＣ　ｃｅｌｌｓ　ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ　ａｂｉｌｉｔｙ．Ｔｈｅ　ｒｅｓｕｌｔｓ　ｓｈｏｗｅｄ　ＭＳＣｓ　ｓｕｐｅｒｎａｔａｎｔ　ｔｒａｎｓｆｅｃｔｅｄ　ｗｉｔｈ　ＶＥＧＦｌ６５（２％，４％，　８％，ｌ　６％，ａｎｄ　３２％１　ｈａｄ　ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ　ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｃｅ　ｉｎ　ｐｒｏｍｏｔｉｎｇ　ＨＵＶＥＣ　ｃｅｌｌｓ　ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ　ｒａｔｅ　ｃｏｍｐａｒｅｄ　ｗｉｔｈ　ｔｈｅ　ｎｏｒｍａｌ　ｃｏｎｔｒｏｌ（Ｐ　＜０．０５）．　Ｃ０ＮＣＬＵＳ１０Ｎ：Ｈｕｍａｎ　ＶＥＧＦ　ｇｅｎｅ　ｃａｎ　ｂｅ　ｓｕｃｃｅｓｓｆｕｌｌｙ　ｔｒａｎｓｆｅｃｔｅｄ　ｉｎｔｏ　ＭＳＣｓ　ａｎｄ　ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ　ｅｆｆｅｃｔｉｖｅｌｙ．　ｍｏｎｔｈｓ　ｏｌｄ，ｗｅｉｇｈｉｎｇ　２．５—３．５　ｋｇ，ｈａｌｆ　ｍａｌｅ　ａｎｄ　ＩＮＴＲＯＤＵＣＴＩＯＮ　ｈａｌｆ　ｆｅｍａｌｅ，ｗｅｒｅ　ｐｒｏｖｉｄｅｄ　ｂｙ　ａｎｉｍａｌ　ｃｅｎｔｅｒ　ｏｆ　Ｊｉｌｉｎ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ．Ｔｈｅｙ　ｗｅｒｅ　ｒａｉｓｅｄ　ａｔ　ａｃｃｏｒｄｉｎｇ　ｔｏ　ｔｈｅ　Ｖａｓｃｕｌａｒ　ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ　ｇｒｏｗｔｈ　ｆａｃｔｏｒ（ＶＥＧＦ１　ｉｓ　ａ　ｒｕｌｅ　ｏｆ　ａｎｉｍａｌ　ｒａｉｓｅ．　ｖｅｒｙ　ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ　ｗａｙ　ｔｏ　ｍａｋｅ　ｔｉｓｓｕｅ　ｅｎｇｉｎｅｅｒ　ｂｏｎｅ　ｖａｓｃｕｌａｒｉｚｅｄ　－Ｊ１Ｍｅｄｉｃｉｎｅ　ａｎｄ　ｒｅａｇｅｎｔｓ　．Ｈｏｗｅｖｅｒ．ｂｅｃａｕｓｅ　ｏｆ　ｉｔｓ　ｓｈｏｒｔ　ｈａｌｆ－ｌｉｆｅ，ＶＥＧＦ　ｃｏｕｌｄ　ｎｏｔ　ｍａｉｎｔａｉｎ　ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ　Ｈａｍ　Ｆ１　２　ｃｕｌｔｕｒｅ　ｍｅｄｉａ（Ｇｉｂｃｏ，Ｕ．Ｓ），ＭＴＴ（Ｓｉｇｍａ，　ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ　ｉｎ　ｂｌｏｏｄ　ａｆｔｅｒ　ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ”　．Ｉｔ　ｉｓ　Ｕ．Ｓ）ＰＬＸＳＮＫＤＲｐ—ＶＥＧＦ　ａｎｄ　ｐｃＤＮＡ　３．０　ａｌｓｏ　ｖｅｒｙ　ｅｘｐｅｎｓｉｖｅ．Ｔｏ　ｒｅｓｏｌｖｅ　ｔｈｅ　ｐｒｏｂｌｅｍ　ｖｅｃｔｏｒｓ　ｗｅｒｅ　ｐｒｅｐａｒｅｄ　ｉｎ　ｔｈｅ　ｐｒｅｓｅｎｔ　ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ．　ｅｆｆｅｃｔｉｖｅｌｙ，ｇｅｎｅ　ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ　ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ　ｗａｓ　ｕｓｅｄ　ＥＬＩＳＡ　ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ　ｋｉｔ　ｗａｓ　ｐｒｏｖｉｄｅｄ　ｂｙ　Ｊｉｎｇｍｅｉ　ｉｎ　ｔｈｉｓ　ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ　ｔｏ　ｔｒａｎｓｆｅｒ　ｈｕｍａｎ　ＶＥＧＦ　ｉｎｔｏ　Ｃｏｍｐａｎｙ，　Ｓｈｅｎｚｈｅｎ；ＤＨ５　Ｑ　，　ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ　ｓｅｅｄ　ｃｅｌｌｓ—ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ　ｓｔｅｍ　ｃｅｌｌｓ（ＭＳＣｓ）ｏｆ　ｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅｓ　Ｂａｍ　Ｈ　Ｉ．Ｘｈｏｌ　Ｉ。Ｈｉｎｄ　ＩＩＩ，　ｔｉｓｓｕｅ　ｅｎｇｉｎｅｅｒ　ｂｏｎｅ　ａｎｄ　ｔｏ　ｍａｋｅ　ｉｔ　ｓｅｃｒｅｔｅ　ＶＥＧＦ　ＥｃｏＲ　Ｉ．ａｎｄ　ｓｔａｎｄａｒｄ　ＤＮＡ　ｍｏｌｅｃｕｌｅ　ｂｙ　Ｐｒｏｍｅｇａ，　ｗｈｉｃｈ　ｃｏｕｌｄ　ｖａｓｃｕｌａｒｉｚｅ　ｂｏｎｅ．Ｔｈｅ　ｐｒｅｓｅｎｔ　ＩＪ．Ｓ．　ｅｘｐｌｏｒａｔｉｏｎ　ｗｉｌｌ　ｏｆｌｆｅｒ　ｕｓｅｆｕｌ　ｗａｙ　ｔｏ　ｃｏｎｓｔｒｕｃｔ　ｖａｓｃｕｌａｒｉｚｅｄ　ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ　ｔｉｓｓｕｅ　ａｎｄ　ｔｒｅａｔ　ＣＯｎｓｔｒｕ　ｔｌＯｎ　ａｎｄ　ｌｄｅｎｔｌｆ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徐松柏w．z等VEGF基嘲修饰兔骨髓闻充硬于细№的研究R~Rwwglc何c。mVEGF．65．Theresearchcouldestablishthebasisforconstructingvascularizedengineeringtissue，implantationrepairandischemicdiseasetreatment．VEGF】65inthepresentexperimentwasakindofsecretaryprotein，whichhastheactivityofbindingwithheparin．50％OfVEGFissecretedtothecelloutsideasaresolublestyleandtherestpartbondtothecellsurfaceandextracellulart“marix…‘‘．TheResolubleandinsolublepatternofVEGF．6swasfittedtoadiustvesselformation．Whenthebodyneedsit．VEGFexistedmostlyasresolubletype．whilewhenvesselformationexcessively，VEGFbindstobasementmembraneasinsolubletypeanddecreasesthesideeifectstothebody．InthepresentreportsVEGFusedingenetransfectionitlvitroprincipallywasVEGF…‘…．65．Whetherthetransfectedgenecouldexpresseffectivelyandgeneexpressionproductshaveactivitieswasthecriticalpointofthepresentexperiment．ELISAresultsofculturalsupernatantoftheVEGF．65transfectedcellsshowedthatVEGF。65proteinincreasedafterMSCswastransfectedwithVEGFl65byliposome．TheVEGFl65proteinexpressionlevelreachedtothetopat24hoursaftertransfectionandthenshoweddecreasingtendency．andtheprotein1eveldecreasedobviouslyatthetwelfthgenerationafterscreening．Theseresults：howedthatVEGFl65proteincouldbeexpressedhighlyinMSCscellstransfectedwithpcDNA30一．VEGFt65andespeciallyasthetransientexpression．VEGFcouldpromotetheproliferationofvesselendothelialcells．sothegenetransfectedcellsexpressionproductsactivitiescouldbedetectedbymeasuringtheeffectsofsupernatantofMSCstransfectedwithVEGFgenetovesselendothelialcells．ThepresentexperimentchoseDlSCUSSl0NHUVECceIlsastheeffectceI】s．TheresultsshowedthatculturalsupernatantcouldpromotetheproliferationofSeedcellwastheoneofthefocusesinboneengineering．HUVECcells．ItprovedthattheexpressionproductsofTheidealseedeellshouldhavethefollowingconditions…0：VEGFgene—transfectedcellshavethebiologicalactivityofUjcertainboneformationability；②easilyacquired；⑨VEGF．A11theseresultsshowedthatVEGFgenetreatmentquickproliferationabilityinvitro；㈤stablebiologicaltakeefectsinfacilitatingvesselproduction．characteri，lvitroculture．MSCscellshastheadvantageofThepresentexperimenttransfectedVEGFl65geneintoboneformingpotentialityenetrasfectiontechni，easilyacquired，easilyprickingMSCscellswithgquesuccessfullyandgottenVEGFexpressedhighlyinsupernatantof，litfletrauma．amplesource，whichhasbeenthel65proteintoeenrreseransemphasisftissugineearch’…’fectedcells．VEGFj~sproteinstillexpressedhighlyin．VEGFwhietwelfthenerationafterscreenedwithG418．ThechfirstfoundbyFerraraandGospodarowicz0IUIthgexproductsofthosecellstransfectedwithVEiGFn1989wasakindofglucoproteinseparatedfromcattlpressionehastheVEGFl65biologicalcharacterandcouldobviouslypituitaryglandfolliclestellatecells．Itcouldfacilitatefacilitatevesselendothelialcellsproliferation．vascularendothelialcellsgrowthandinducebloodvesselproduction．AmongthepresentmostknowngrowthfactorsREFERENCES(suchasbFGFandPDGF)，VEGFhasthemostpowerfuln”’…vesselproductioabilityD．VEGFcouldmaintainvesseleCoppiPDeloD，FarrugiaL，etalAngiogenicgenemodifiedlimusclecellsforenhancementoftissueformaifonTissueEnnormashapeandntegritypromotevesselpermeabilityg2005：ll，，(78、：10341044facilitateendotheliajcellprolircrationandvesselproduction．BetzVM，BetzOB．HarrisMB，etaIBone[issueengineeringandWhilductionIeepairbygenetherapyFrontBiosci2008：l(13)：833vesselproductioneffectsofothervesselpro841AwadHA．Zhan．RenoDGetaRtfactorswereimplementedthroughcompletelgXyldslSchwarzEM．ccenyorpartlyadvancesingenedeliveryforstructuralbonealIograftsTissueEngd。‘‘。、”enhancingVEGFproteinexpressionanproduction2007：13(8)：19731985．RABVEGF：anessentialmediatorofbothanecentstudigiogenesisesshowedthatVEGFproteininjectiDaiJ．Rabieonorgeneandendoch0『1dralossification．JDentRes2006；86(10)：937950treatmenthasbrightfutureintissuerepairandvesselJlaXJ．LiuL．GongSL，eta1．ConstructionofrecombinantDNA16djnregenerationl131encoghumanvascularendothelialgrowthfactoranditsexpression．invitro．Jin¨DaxueXuebao：YixueBan2002；28(11：11一l3Basedontheabovementionedcharacteristics．thepresentLtiXWangR．CultureandidentifytheendothelialcellsofhumanexperimentchoseMSCsasthetargetcellofgeneimportumbilicalveill．WeiShengYahJiu2001：30(3)：l88一189，ngTFXiaR丫YangCH．eta1StudyofgelatinizedmarrowstromawhichconIdpromoteexpressionofVEGFproteiGonandosteoblastsand[rueboneceramicactivebone．ChinJTraumatoIvascularizationoftissueengineeringbonebyimported2005：8(2)：9l一95ISSN16738225CN2l。l539，RCODEN：ZLKHAH2389维普资讯 http://www.cqvip.com

ｗｗｗ．ｚｇｌｃｋｉｆ．ｃｏ　８　Ｍａｏ　Ｘ，Ｃｈｕ　ＣＬ，Ｍａｏ　Ｚ，ｅｔ　ａ１．Ｔｈｅ　ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ　ａｎｄ　ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｎｇ　ｔｉｓｓｕｅ　ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ　ｂｏｎｅ　ｂｙ　ｓｅｅｄｉｎｇ　ｏｓｔｅｏｂｌａｓｔｓ　ｆｒｏｍ　ｄｉｆｆ．ｅｒｅｎｔｉａｔｅｄ　ｒａｔ　ｍａｒｒｏｗ　ｓｔｒｏｍａｌ　ｓｔｅｍ　ｃｅｌｌｓ　ｏｎｔｏ　ｔｈｒｅｅ—ｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌ　ｐｏｒｏｕｓ　ｎａｎｏ．ｈｙｄｒｏｘｙｌａｐａｔｉｔｅ　ｂｏｎｅ　ｍａｔｒｉｘ　ｉｎ　ｖｉｔｒｏ．Ｔｉｓｓｕｅ　Ｃｅｌｌ　２ｏｏ５：　３７（５）：３４９—３５７　９　Ｃｈａｍｂｅｒｌａｉｎ　Ｇ　Ｆｏｘ　Ｊ，Ａｓｈｔｏｎ　Ｂ，ｅｔ　ａ１．Ｃｏｎｃｉｓｅ　ｒｅｖｉｅｗ：ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ　ｓｔｅｍ　ｃｅｌｌｓ：ｔｈｅｉｒ　ｐｈｅｎｏｔｙｐｅ，ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ　ｃａｐａｃｉｔｙ，ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ　ｆｅａｔｕｒｅｓ．ａｎｄ　ｐｏｔｅｎｔｉａｌ　ｆｏｒ　ｈｏｍｉｎｇ．Ｓｔｅｍ　Ｃｅｌｌｓ　２００７；２５（１１）：２７３９—２７４９　１０　Ｆｅｒｒａｒａ　Ｎ，Ｈｅｎｚｅｌ　ＷＪ．Ｐｉｔｕｉｔａｒｙ　ｆｏｌｌｉｃｕｌａｒ　ｃｅｌｌｓ　ｓｅｃｒｅｔｅ　ａ　ｎｏｖｅｌ　ｈｅｐａｒｉｎ．ｂｉｎｄｉｎｇ　ｇｒｏｗｔｈ　ｆａｃｔｏｒ　ｓｐｅｃｉｆｉｃ　ｆｏｒ　ｖａｓｃｕｌａｒ　ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ　ｃｅｌｌｓ．　Ｂｉｏｃｈｅｍ　Ｂｉｏｐｈｙｓ　Ｒｅｓ　Ｃｏｍｍｕｎ　ｌ９８９；ｌ６ｌ（２）：８５１．８５８　ｌ１　Ｅｎｎｅｔｔ　ＡＢ，Ｋａｉｇｌｅｒ　Ｄ，Ｍｏｏｎｅｙ　ＤＪ．Ｔｅｍｐｏｒａｌｌｙ　ｒｅｇｕｌａｔｅｄ　ｄｅｌｉｖｅｒｙ　ｏｆ　ＶＥＧＦ　ｉｎ　ｖｉｔｒｏ　ａｎｄ　ｉｎ　ｖｉｖｏ．Ｊ　Ｂｉｏｍｅｄ　Ｍａｔｅｒ　Ｒｅｓ　Ａ　２００６；７９（１）：　ｌ７６一ｌ８４　ｌ２　Ｗｕ　ＺＪ，Ｚｈａｎｇ　Ｈ．Ｙ＿ｕ　Ｌ．ｅｔ　ａ１．Ｃｏｎｓｔｕｒｃｔｉｏｎ　ｏｆ　ｈｕｍａｎ　ＶＥＧＦｌ６５　ｇｅｎｅ　ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｐｌａｓｍｉｄ　ａｎｄ　ｉｔｓ　ｅｆｆｅｃｔ　ｏｎ　ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｖａｓｃｕｌａｒ　ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ　ｃｅｌｌｓ．Ｈｅｐａｔｏｂｉｌｉａｒｙ　Ｐａｎｃｒｅａｔ　Ｄｉｓ　Ｉｎｔ　２００５：４（３）：　３６４．３６９　ｌ　３　Ｓｔａｌｍａｎｓ　Ｉ．Ｒｏｌｅ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｖａｓｃｕｌａｒ　ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ　ｇｒｏｗｔｈ　ｆａｃｔｏｒ　ｉｓｏｆｏｒｉｌｌＳ　ｉｎ　ｒｅｔｉｎａｌ　ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ　ａｎｄ　ＤｉＧｅｏｒｇｅ　ｓｙｎｄｒｏｍｅ．Ｖｅｒｈ　Ｋ　Ａｃａｄ　Ｇｅｎｅｅｓｋｄ　Ｂｅｌｇ　２００５；６７（４）：２２９．２７６　ｌ４　Ｈｓｉｏｎ￣ＳＸ．Ｍｏｏｎｅｙ　ＤＪ．　Ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｖａｓｃｕｌａｒｉｚｅｄ　ｂｏｎｅ．　Ｐｅｒｉｏｄｏｎｔｏｌ　２０００　２００６；４ｌ：ｌ０９一ｌ２２　ｌ５　Ｙａｎｇ　Ｊ，Ｚｈｏｕ　ｗ’Ｚｈｅｎｇ　ｗ’ｅｔ　ａ１．Ｅｆｆｅｃｔｓ　ｏｆ　ｍｙｏｃａｒｄｉａｌ　ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉ０ｎ　ｏｆ　ｍａｒｒｏｗ　ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ　ｓｔｅｍ　ｃｅｌｌｓ　ｔｒａｎｓｆｅｃｔｅｄ　ｗｉｔｈ　ｖａｓｃｕｌａｒ　ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ　ｇｒｏｗｔｈ　ｆａｃｔｏｒ　ｆｏｒ　ｔｈｅ　ｉｍｐｒｏｖｅｍｅｎｔ　ｏｆ　ｈｅａｒｔ　ｆｕｎｃｔｉｏｎ　ａｎｄ　ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ　ａｆｔｅｒ　ｍｙｏｃａｒｄｉａｌ　ｉｎｆａｒｃｔｉｏｎ．Ｃａｒｄｉｏｌｏｇｙ　２ｏｏ６：ｌ０７（１）：　ｌ７—２９　１６　Ｈｕａｎｇ　ＹＣ，Ｋａｉｇｌｅｒ　Ｄ，Ｒｉｃｅ　ＫＱ　ｅｔ　ａ１．Ｃｏｍｂｉｎｅｄ　ａｎｇｉｏｇｅｎｉｃ　ａｎｄ　ｏｓｔｅｏｇｅｎｉｃ　ｆａｃｔｏｒ　ｄｅｌｉｖｅｒｙ　ｅｎｈａｎｃｅｓ　ｂｏｎｅ　ｍａｒｒｏｗ　ｓｔｒｏｍａｌ　ｃｅｌｌ—ｄｒｉｖｅｎ　ｂｏｎｅ　ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ．Ｊ　Ｂｏｎｅ　Ｍｉｎｅｒ　Ｒｅｓ　２００５；２０（５）：８４８—８５７　ｌ７　Ｌａｈｔｉｎｅｎ　Ｍ，Ｂｌｏｍｂｅｒｇ　Ｂａｌｉｕｌｉｓ　Ｑ　ｅｔ　ａ１．Ｉｎ　ｖｉｖｏ　ｈ—ＶＥＧＦｌ６５　ｇｅｎｅ　ｔｒａｎｓｆｅｒ　ｉｍｐｒｏｖｅｓ　ｅａｒｌｙ　ｅｎｄ０ｔｈｅｌｉａｌｉｓａｔｉ０ｎ　ａｎｄ　ｐａｔｅｎｃｙ　ｉｎ　ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ　ｖａｓｃｕｌａｒ　ｇｒａｆｔｓ．Ｅｕｒ　Ｊ　Ｃａｒｄｉｏｔｈｏｒａｃ　Ｓｕｒｇ　２００７；３ｌ（３）：３８３—３９０　ｌ　８　Ｗｅｎｇ　Ｗ＿ａｎｇ　Ｍ，Ｌｉｕ　Ｗ，ｅｔ　ａ１．Ｒｅｐａｉｒ　ｏｆ　ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ　ａｌｖｅｏｌａｒ　ｂｏｎｅ　ｄｅｆｅｃｔｓ　ｂｙ　ｔｉｓｓｕｅ—ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ　ｂｏｎｅ．Ｔｉｓｓｕｅ　Ｅｎｇ　２ｏｏ６：ｌ２（６）：ｌ５０３一ｌ５ｌ３　ｌ９　Ｇｏｌｄｓｔｅｉｎ　ＡＳ．Ｅｆｆｅｃｔ　ｏｆ　ｓｅｅｄｉｎｇ　０ｓｔｅ０ｐｒ０ｇｅｎｉｔ０ｒ　ｃｅｌｌｓ　ａｓ　ｄｅｎｓｅ　ｃｌｕｓｔｅｒｓ　ｏｎ　ｃｅｌｌ　ｇｒｏｗｔｈ　ａｎｄ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ．Ｔｉｓｓｕｅ　Ｅｎｇ　２００ｌ：７（６）：８ｌ７—８２７　ＶＥＧＦ基因修饰兔骨髓间充质干细胞的　研究：ｌ：：ｌ：☆　徐松柏　，赵刚　，赵红光　，许侃　，于洪泉　，候宜　吉林大学第一医院，　神经外科，　核医学科，吉林省长春市　１３００２１；　吉林大学再生医学科学研究所生物化学教研室，吉林省长春市　ｌ３００２ｌ　徐松柏☆，男，１９７８年生，吉林省吉林市人，汉族，吉林大学第一医　院在读博士，主要从事颅骨组织Ｘ－程学的研究　通讯作者：赵刚，教授，博士生导师，吉林大学第一医院神经外科，　吉林省长春市　１３００２１　国家自然科学基金资助课题（３０４７１７６８／Ｃ０３０３０３０７）“组织Ｘ－程材料栓　塞颅内动脉瘤的实验研究”　；吉林省自然科学基金资助课题　（２００３０５３６２２）“转基因技术构建组织Ｘ－程化颅骨修复材料的实验　研究”　摘要　背景：血管内皮生长因子的应用是组织工程组织血管化的有效手段。　但是，血管内皮生长因子价格昂贵，并且半衰期非常短，很难在体内　保持有效的作用浓度。故本实验将其转入组织工程的种子细胞——骨　髓间充质干细胞中，使骨髓间充质干细胞能够有效地分泌血管内皮生　长因子，从而达到促进血管生成的目的。　２３９０　徐松柏　等ＶＥＧＦ基因修饰兔骨髓阚充硬干细匏的研究　目的：探讨应用人血管内皮生长因子１６５进行基因修饰的可行性，为　血管化组织工程组织的构建及缺血性疾病的治疗奠定实验基础。　设计：观察对比实验。　单位：吉林大学第一医院和吉林大学再生医学科学研究所。　材料：实验于２００３—０６１２００４—０８在吉林大学再生医学科学研究所吉林　大学重点实验室（生物安全实验室二级）完成。健康新西兰大耳白兔　由吉林大学实验动物中心提供。４．０～５．０月龄，体质量２１５￣３１５　ｋｇ，雌　雄兼用，实验过　巾对动物处置均　：麻醉状态、无菌条件Ｆ完成，符　合动物伦理学标准。实验药品及试剂：Ｈａｍ　Ｆ１２培养基（ＧＩＢＣＯ公司），　噻唑蓝（ＭＴＴ）（Ｓｉｇｍａ公司），ｐＬＸＳＮ—ＫＤＲｐ．ＶＥＧＦ１６５与ｐｃＤＮＡ３．０载　体由本实验室自备，ＥＬＩＳＡ检测试剂盒（深圳晶美生物公司），感受态　大肠杆菌ＤＨ５￣ｔ、限制性内切酶ＢａｍＨ　Ｉ、Ｘｈｏ　Ｉ、ＨａｎｄｌＩＩ、ＥｃｏＲ　Ｉ和　标准ＤＮＡ分子（Ｐｒｏｍｅｇａ公司）。　方法：分离、培养新西兰大白兔骨髓间充质十细胞。构建并鉴定　ｐｃＤＮＡ３．０一ＶＥＧＦ。　真核表达载体，利用脂质体介导其转染骨髓问充　质干细胞，采用ＥＬＩＳＡ方法榆测转基因骨髓问充质干细胞的人血管内　皮生长因子蛋白表达，ＭＴＴ法检测转基因骨髓间充质干细胞表达物　对血管内皮细胞增殖活性的影响，设单纯培养骨髓问充质干细胞及　ｐｃＤＮＡ３．０转染骨髓问充质干细胞组为对照组。　主要观察指标：①重组质粒双酶切和基因测序分析。②ＡＢＣ—ＥＬＩＳＡ法　观察质粒转染后的骨髓间充质干细胞的人血管内皮细胞生长因子蛋　白表达。③通过ＭＴＴ法检测人血管内皮生长因子１６５基因转染骨髓　间充质干细胞培养上清对血管内皮细胞增殖的影响。　结果：①构建的质粒用Ｈｉｎｄ　ＩＩＩ和Ｘｈｏ　Ｉ双酶切、琼脂糖凝胶电泳鉴　定结果与预期完全相同，ＰＣＲ和酶切鉴定正确后行测序鉴定，测序　结果正确，证明所构建的质粒为ｐｃＤＮＡ３．０一ＶＥＧＦ１６５重组质粒。②　ＡＢＣ—ＥＬＩＳＡ法检测结果表明，人血管内皮生长因子１６５基因重组载　体转染骨髓问充质干细胞后２４　ｈ，即有较高水平的人血管内皮生长因　子１６５蛋白表达，４８及７２　ｈ呈Ｆ降趋势，但与对照组比较，差异显　著（Ｐ＜０．０５）。③ＭＴＴ法检测人血管内皮生长因子１６５基因转染骨　髓问充质干细胞培养上清对血管内皮细胞增殖的影响，结果显示，含　２％，４％，８％，１６％和３２％转染人血管内皮生长因子１６５基因的骨髓间　充质干细胞培养上清促血管内皮细胞增殖率均高于对照组（Ｐ＜　０．０５）。　结论：人血管内皮生长因子１６５基因可成功地转染至骨髓问充质干细　胞中，并可进行有效地表达。　关键词：骨髓问充质干细胞：血管内皮生长因子；基因；转染；骨髓　祖代细胞：组织工程　ｒ｝１图分类号：Ｒ３９４．２文献标识码：Ａ　文章编号：１６７３　８２２５（２００８）ｌ２－０２３８７—０４　徐松柏，赵刚，赵红光，许侃，于洪泉，候宜．ＶＥＧＦ基因修饰兔骨髓　间充质干细胞的研究…．中国组织工程研究与临床康复，２００８，　１２（１２）：２３８７－２３９０　【ＷＷＷ．ｚｇｌｃｋｆ．ｃｏｒｎ／ｚｇｌｃｋｆｆｅｊｏｕｒｎａｌ／ｕｐｆｉｌｅｓ／０８－１２１１２ｋ－２３８７（ｐｓ）．ｐｄｆｌ　ｆＥｄｉｔｅｄ　ｂｙ　Ｊｉ　Ｈ／Ｗａｎｇ　Ｌ）　Ｐ．Ｏ．Ｂｏｘ　１２００，Ｓｈｅｎｙａｎｇ　１１０００４　ｋｆ２３３８５０８３＠ｓｉｎａ．ｃｏｍ