QX100 Droplet Digital PCR System与转基因作物检测

与转基因作物检测 陈寅清 前段时间纪录片《舌尖上的中国》热播，美味固然是一种享受，但吃得放

心、安全更是头等大事。其中转基因作物带来的食品安全问题也一直是多年来讨论的热点，并直接影响到国际贸易和公众对转基因产品的接受程度。为保障在农产品进出口贸易中的利益，许多国家纷纷制定了较为严格的管理。例如日本规定转基因作物的成分超过5％时，必须进行标识；而欧盟的现行标准为0.9％；我国的标准最为严格，只要产品中含有转基因作物成分就需要进行标识1。 国内的主要转基因作物是玉米、大豆、水稻、油菜和棉花等等，主要的外源基因是抗虫、抗除草剂基因。作为能够实现绝对定量的“第三代PCR”——QX100微滴式数字PCR系统，在转基因作物（Genetically Modified Organism, GMO）含量检测这个领域内大有可为，从长远来看将对转基因作物的检测带来彻底的改变。

目前在确定转基因作物的含量时采取定量PCR中的标准曲线法，即依赖于已知浓度的标准品（Certified Reference Materials Calibrants, CRMCs），在转基因作物检测领域，该标准品的确定与认证更加严格。在我国由隶属于中国计量科学研究院的全国标准物质计量技术委员会来完成CRMCs标准品的认证工作。

CRMCs主要分为两类：质粒标准品（Molecular Plasmid CRM）和基体标准品（Plant Matrix CRM）。质粒标准品中往往将种属的参考基因(reference

按比例稀释后分别得到gene)、导入的外源基因(transgene)构建在一个质粒中2，

参考基因和外源基因的标准曲线，然后分别得到样品中两者的含量进而计算出转基因作物的质量百分比3。而基体标准品则是将纯转基因作物与非转基因作物按一定比例进行混合进而制成粉末，通过比较样品中的ΔCt（Ct transgene- Ct reference

2

gene）来得到转基因作物的质量百分比。但基体标准品存在批次间的一致性以及线性范围有限（0～5％）的问题2。

首先，QX100的出现提供了一种完全可靠的核酸标准品的标定方法，因为 通过QX100绝对定量的方式可以确定CRMCs的绝对量（copies/ul）。目前确定质粒标准品的方法还是传统的OD检测或荧光染色法（如Pico Green、Hoechst 33258等），最后通过下面的公式换算到拷贝数。

此外，研究还发现质粒的不同构象也会影响到含量的测定4。因此QX100微滴化绝对定量的方法最终满足了对核酸标准品进行准确标定的要求，并能够避免CRMCs不同批次之间的差异。

之前质检总局下属的中国计量科学研究院已经中标一套QX100，主要也将 用于核酸标准品的制定。最近通过和上海交通大学国家转基因生物分子特征验证测试中心合作进行了转基因玉米标准品的测定，与之前在Fluidigm平台上得到的结果进行对比后，该中心实验室对于QX100的反馈如下：

1. QX100上得到的结果与Fluidigm 12.765 Digital Array IFC上的结果一致 2. QX100的实验成本便宜，每个样品约50RMB，而采用Fluidigm的芯片

每个样品的成本约250RMB

3. 由于QX100可以将样品微滴化到20,000份，而Fluidigm只能将样品分为765份，所以QX100的线性范围更好，无需对样品进行稀释。而Fluidigm 12.765 Digital Array IFC建议的工作浓度为200～500 copies/ul，如果样品的浓度超出该范围，则需要对样品稀释

4. 如果样品浓度低于200 copies/ul，QX100依然能够进行准确标定。在测

试中，QX100能准确测到1.6 copies/ul的低浓度。而Fluidigm根本不能满足这种低浓度条件下的检测要求。 (上述2、3、4点充分说明了独特的微滴化技术在实现数字PCR方面QX100 对于Fluidigm的优势)

其次从长远来看，QX100的出现使得转基因作物的检测最终可以彻底摆脱对于CRMCs标准品的依赖。根据转基因作物检测的计算方式：

GMO percentage(%)= transgene/reference gene×100%2

QX100的性能已经完全能满足上述的应用。例如用FAM通道直接测定transgene的含量(X copies/ul)；用VIC通道直接测定reference gene的含量(Y copies/ul)；两者的比值(X/Y 100%)即为转基因作物的质量百分比。

QX100对于转基因作物含量测定这一应用性的意义在于：虽然利用QX100可以使得标准品更加准确，但ddPCR可以使实验室彻底不需要标准曲线。在这个方面数字PCR可以彻底取代目前的定量PCR。也就是说每个省级出入境检验检疫局的植物检疫实验室或食品检疫实验室、农科院农业质量标准与检测技术研究所、各农产品质量安全中心等相关实验室以及有关食品生产企业的质检部门都可以在QX100平台上进行转基因作物含量的检测。

QX100的出现肯定会给转基因作物的检测带来一种性的变化，虽然短期内还不会取代传统的CRMCs方法，也必将涉及到很多国家的相关法规，但长远来看，QX100作为转基因作物含量检测的平台将进入每个相关的实验室，市场巨大。

Reference

1. Buh Gasparic M, Tengs T, La Paz JL, Holst-Jensen A, Pla M, Esteve T, Zel J, Gruden K. Comparison of nine different real-time PCR chemistries for qualitative and quantitative applications in GMO detection. Anal Bioanal Chem. 2010 Mar;396(6):2023-9.

2. Andreas Pardigol, Stéphanie Guillet, Bert Pöpping. A Simple Procedure for Quantiifcation of Genetically Modified Organisms using Hybrid Amplicon Standards. Eur Food Res Technol (2003) 216: 412-420.

3. Michaela Höhne, Christelle Rosa Santisi, Rolf Meyer. Real-time Multiplex PCR an Accurate Method for the Detection and Quantification of 35S-CaMV Promoter in Genetically modified maize-containing food. Eur Food Res Technol (2002) 215: 59-.

4. Lin CH, Chen YC, Pan TM. Quantification bias caused by plasmid DNA conformation in quantitative real-time PCR assay. PLoS One. 2011;6(12):e29101.