细胞毒性实验方案

1. 准备材料： DMEM(高糖) 胰酶 双抗(青霉素/链霉素） DAPI MTT(5mg/mL) DMSO PBS 4%多聚甲醛 指甲油 6孔培养板 96孔培养板 超薄载玻片 培养瓶(25mL) 一包 0.45μm滤膜 灭菌： 50mL，10mL，5mL离心管 两种头 2.实验方案

本实验所用的材料为载药的通过二硫键桥连透明质酸的夹心二氧化硅（SiO2-SS-HA/DOX），在高谷胱甘肽条件下，二硫键断裂，透明质酸脱离，同时夹心二氧化硅中药物得以释放。本实验的目的为测定透明质酸修饰的夹心二氧化硅（SiO2-SS-HA/DOX）的细胞毒性。实验组为SiO2-SS-HA/DOX、SiO2-SS-HA、DOX，空白对照组为纯细胞,分别采用HepG2人肝癌细胞为肿瘤细胞模型和L929成纤维细胞为正常细胞模型。

采用HepG2人肝癌细胞为肿瘤细胞模型，实验组为SiO2-SS-HA/DOX、SiO2-SS-HA、DOX，空白对照组为纯细胞。培养基中含有10% (v/v) FBS和1% (w/v) 双抗(青霉素/链霉素)。配制不同浓度的SiO2-SS-HA/DOX、SiO2、HA、DOX药物载体培养基溶液。

(1).以HepG2人肝癌细胞为肿瘤细胞模型: 培养基的配置：双抗 1% 血清12% DMEM 87% 具体操作步骤： 细胞的复活：

①将冻存于液氮中的细胞取出，迅速放入37℃温水中，使细胞快速溶解。 ②将悬浮的细胞移至离心管中，加5mL无血清培养基，1000rmp,5min离心去上清，再加5mL有血清培养基，转移至培养瓶中。（每次转移时，将之前的离心管洗涤，并用移液来回吸，使液体混合均匀。）

③将培养瓶放入培养箱中培养。 细胞的传代：

将0.25%的胰酶分装至小离心管中，每个管中2mL，冻存于-20℃，每次使用一管，避免反复冻融。

①将培养瓶从培养箱中取出，盖子旋紧，喷75%的酒精放入超净台。 ②将培养液倒入废液缸，残留培养基用吸管吸干净，操作完成后，培养瓶口

用火烧。

③加入2mL胰酶将瓶底铺满，消化2-3min，于显微镜下观察细胞形态，呈圆形，即消化完毕，加入2mL 12% DMEM终止消化，用吹打，使细胞悬浮。

④将细胞悬浮液移入10mL离心管中，1000rmp,5min,离心。

⑤迅速倒掉上清，加入6mLDMEM培养基，分装至两个培养瓶中，再各加入2mLDMEM，至5mL，于37℃，5%的CO2培养箱中培养48h。

⑥下一次传代步骤同①-⑤。

细胞存活率测定方法（布板，加样）： ①同传代步骤①-④。

②给每个离心管中加入定量的培养基，并用移液来回吸，使液体混合均匀，将所有含有细胞的培养基转移到一个50mL离心管中，最终使液体体积为30mL。

③96孔板中每个浓度设计5个复孔，每块板设一组空白调零孔，内加培养液，不含细胞与药物，一组空白对照组，只加培养基和细胞，不加药物。除过空白调零孔，每孔加入100μL含细胞的培养基。将孔板放入培养箱中，培养箱保持一定的湿度，5% (v/v) CO2，温度保持在37℃，培养22小时。

④将0.03g谷胱甘肽加入到10mL培养基，充分溶解，浓度为0.003g/mL,取2微升的0.003g/mL谷胱甘肽溶液加入到10mL的培养基中，将这两个浓度含谷胱甘肽的培养基替换部分原来的培养基，作为对照，不需要加谷胱甘肽的孔换上新鲜培养基，将孔板放入培养箱中，培养箱保持一定的湿度，5% (v/v) CO2，温度保持在37℃，培养2小时，具体的加样孔见图一。

⑤将1.2mg的SiO2-SS-HA/DOX样品溶到3mL的培养基中，分成两份，其中一份里加入1.5mL的培养基，再将稀释后的含液样的培养基分成两份，其中一份加入1.5mL新鲜培养基，依此类推，便得到一个浓度梯度的SiO2-SS-HA/DOX样品。SiO2-SS-HA样品的浓度配制方法同上。

⑥将0.918mg的SiO2-SS-HA/DOX样品溶到3mL的培养基中，剩下的步骤同⑤。

⑦将配制好的载体溶液替换原来96孔板中的培养基，如图1所示。将孔板放入培养箱中，培养箱保持一定的湿度，5% (v/v) CO2，温度保持在37℃，培养24小时。

⑧配制5 mg/mL的MTT溶液，将孔板中的培养更换成MTT溶液，将孔板放

入培养箱中，培养箱保持一定的湿度，5% (v/v) CO2，温度保持在37 ℃。培养4小时后，将孔板中的培养基取出，用PBS溶液清洗3次，然后向每孔加入100 μL的DMSO，溶解孔中的甲瓒，采用酶标仪测定，波长设定为490nm

图1药物载体布板示意图

⑵.以L929 成纤维细胞为正常细胞模型:

实验组为SiO2-SS-HA/DOX、SiO2-SS-HA、DOX，空白对照组为纯细胞。实验目的为测定药物载体溶液对正常细胞的细胞毒性。

培养基的配置：双抗 1% 血清12% DMEM 87% 具体操作步骤： 细胞的复活：

①将冻存于液氮中的细胞取出，迅速放入37℃温水中，使细胞快速溶解。 ②将悬浮的细胞移至离心管中，加5mL无血清培养基，1000rmp,5min离心去上清，再加5mL有血清培养基，转移至培养瓶中。（每次转移时，将之前的离心管洗涤，并用移液来回吸，使液体混合均匀。）

③将培养瓶放入培养箱中培养。 细胞的传代：

将0.25%的胰酶分装至小离心管中，每个管中2mL，冻存于-20℃，每次使用一管，避免反复冻融。

①将培养瓶从培养箱中取出，盖子旋紧，喷75%的酒精放入超净台。 ②将培养液倒入废液缸，残留培养基用吸管吸干净，操作完成后，培养瓶口用火烧。

③加入2mL胰酶将瓶底铺满，消化2-3min，于显微镜下观察细胞形态，呈圆形，即消化完毕，加入2mL 12% DMEM终止消化，用吹打，使细胞悬浮。

④将细胞悬浮液移入10mL离心管中，1000rmp,5min,离心。

⑤迅速倒掉上清，加入6mLDMEM培养基，分装至两个培养瓶中，再各加入2mLDMEM，至5mL，于37℃，5%的CO2培养箱中培养48h。

⑥下一次传代步骤同①-⑤。

细胞存活率测定方法（布板，加样）： ①同传代步骤①-④。

②给每个离心管中加入定量的培养基，并用移液来回吸，使液体混合均匀，将所有含有细胞的培养基转移到一个50mL离心管中，最终使液体体积为12mL。

③96孔板中每个浓度设计5个复孔，每块板设一组空白调零孔，内加培养液，不含细胞与药物，一组空白对照组，只加培养基和细胞，不加药物。除过空白调零孔，每孔加入100μL含细胞的培养基。将孔板放入培养箱中，培养箱保持一定的湿度，5% (v/v) CO2，温度保持在37℃，培养22小时。

④将所有加样的孔换成新鲜培养基，作为与癌细胞④的对照。将孔板放入培养箱中，培养箱保持一定的湿度，5% (v/v) CO2，温度保持在37℃，培养2小时。

⑤将0.4mg的SiO2-SS-HA/DOX样品溶到1mL的培养基中，分成两份，其中一份里加入0.5mL的培养基，再将稀释后的含液样的培养基分成两份，其中一份加入0.5mL新鲜培养基，依此类推，便得到一个浓度梯度的SiO2-SS-HA/DOX样品。SiO2-SS-HA样品的浓度配制方法同上。

⑥将0.306mg的SiO2-SS-HA/DOX样品溶到1mL的培养基中，剩下的步骤同⑤。

⑦将配制好的载体溶液替换原来96孔板中的培养基，如图2所示。将孔板放入培养箱中，培养箱保持一定的湿度，5% (v/v) CO2，温度保持在37℃，培养24小时。

⑧配制5 mg/mL的MTT溶液，将孔板中的培养更换成MTT溶液，将孔板放入培养箱中，培养箱保持一定的湿度，5% (v/v) CO2，温度保持在37 ℃。培养4小时后，将孔板中的培养基取出，用PBS溶液清洗3次，然后向每孔加入100 μL的DMSO，溶解孔中的甲瓒，采用酶标仪测定，波长设定为490nm

细胞存活率采用百分比表示:细胞存活率=(ODtreated--ODblank /ODcontrol-ODblank)×100%。ODblank是只有培养液，没有细胞的培养孔的吸光值，0Dcontrol为不含药物载体含细胞和空白培养基的培养孔中所测吸光值，ODtreated为含药物载体培养孔所测吸光值。细胞相对存活率根据吸光值计算。

图2正常细胞组的药物载体布板示意图