超氧化物歧化酶SOD的分离纯化技术

一、 实验原理：

通过对绿豆种子的研磨破碎获得SOD粗酶，经过硫酸铵分级分离、透析除盐和浓缩等过程，除去粗酶液中的杂质及干扰蛋白，采用葡聚糖（Sephadex G-100）凝胶层析得到纯化的SOD酶。

二、 实验材料与方法：

<一>材料:绿豆种子,市售新鲜绿豆种子浸泡蒸馏水24小时备用.

<二>试剂:葡聚糖（sephadexG-100或G150）, NaCl（AP）, 磷酸氢二钠（AP）, 磷酸二氢钠（AP）, 三羟甲基氨基甲烷（Tris）, 盐酸（浓盐酸），硫酸铵（AP）, PEG6000, 考马斯蓝G250 , 磷酸 ，乙醇（AP） ， 牛血清蛋白BSA , 连苯三酚(焦性没食子酸), 甲硫氨酸( methionine) , NBT（氮兰四唑 Nitroblue Tetrazdinna）, 核黄素 , EDTA(钠盐) , 超氧化物歧化酶（sigma公司）,

<三>仪器:

离心机

WFZ-UV2000 型紫外分光光度计

201×7（717）强碱性苯乙烯系阴离子交换树脂

匀浆机、各型号烧杯、试管、量筒、带毛塞试管、漏斗、移液、移液管、玻璃棒、

<四>实验方法和步骤：

1. 称量25g 绿豆+250ml pH7 0.05 mol/L pb液，匀浆，两层纱布过滤，离心（3000rpm）15Min 取清液，取少量样为样①，测量SOD活性、蛋白质含量测量，计算SOD总活性单位及活性单位。 2. 所得清液测量总体积，缓慢40％饱和（NH4）4℃2SO4 至浓度为19.4g/100ml，冰箱静置分层。

3. 离心（3000rpm） 取清液，取少量为样②，测量SOD活性、蛋白质含量测量，计算SOD总活性单位及活性单位。

4. 步骤3中的清液缓慢加入硫酸铵至75%饱和度（8.7g/100ml）（过程充分搅拌），5℃至分层，离心（3000rpm） 取沉淀，取样③，计算SOD总活性单位及活性单位。

5. 装入透析袋中，于蒸馏水中5℃透析过夜。

6. 透析后溶液用滤纸过滤得清液，重新装入透析袋中用PEG浓缩。 7. 装柱：1）排气泡 加蒸馏水 留15％体积水 2）100mL G100 一次装完

3）静置10min 打开出液口 排过量洗脱剂

4）保留离胶面2－3cm 接洗脱瓶 平衡30min 理想流速

△注意 ①胶面始终保持水层 ②洗脱瓶：pH7, 0.02MPb 8. 层析过程

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①样品：浓缩液 离心 过滤 体积31mL 取样④ ②上样：5％上样量2－3mol

③洗脱:1mL/min,3mL/支，共收100－120mL *测（1）A280值

（2）SOD活性（粗略） 20支管 每支3mL （3）搜集活性峰并测酶活性

9．比活力、得率及纯化倍数计算：

SOD的比活力按下面公式计算:

三、结果与讨论：

<一> SOD活性及蛋白质测定结果： 1．蛋白质含量测定：

表1. 牛血清制作蛋白质标准曲线（牛血清单位为0.1mg/ml） 蛋白质(mg) 0 0.01 0.02 0.03 0.04 0.050 A(nm) 0 0.088 0.192 0.239 0.341 0.415

0.450.40.35y = 0.0082x + 0.0067R2 = 0.9939A595-OD值0.30.250.20.150.10.0500102030405060蛋白含量/ug

图1. 牛血清制作蛋白质标准曲线（牛血清单位为0.1mg/ml）

<二 >硫酸铵分级分离、透析除盐和浓缩过程

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表2. 连苯三酚测样品SOD活性(A325)

连苯三酶/ul △A’

酚/ul

样① 50 50 0.021 样② 55 20 0.025 样③ 57 48 0.033

表3. 考马斯蓝G-250测样品蛋白含量(A595)： 样品体积OD平均值 第一次测量 第二次测量

/ul （nm）

样① 10 0.566 0.558 0.562 样② 10 0.291 0.293 0.292 样③ 120 0.115 0.120 0.118

根据蛋白质标准曲线求出蛋白质含量： 样① 0.067mg 样② 0.035mg 样③ 0.016mg

（三）葡聚糖凝胶层析分离纯化SOD实验结果

表4. 葡聚糖G100凝胶层析洗脱曲线（以A280吸收作为蛋白质含量的相对值） 试管号 （1） （2） （3） （4） （5） (6) (7) 吸光值(nm) 0.059 0.079 0.019 0.083 0.048 0.044 0.04

试管号 (8) (9) (10) (11) (12) (13) (14) 吸光值(nm) 0.024 0.021 0.03 0.017 0.031 0.023 0.018 试管号 （15） （16） （17） （18) （19) (20) 吸光值(nm) 0.019 0.011 0.013 0.018 0.020 0.023

0.20.180.160.140.120.10.080.060.040.02002468- 3 - A280-OD10121416182022试管号图2. 葡聚糖Sephadex G100凝胶层析分蛋白质洗脱曲线

经连苯三酚粗测，（3）号管颜色最浅，而根据蛋白质洗脱曲线看出（3）号管位于蛋白质含量峰上，所以选取（3）号管作为目的试管收集SOD，测量其准确SOD活力和蛋白含量，计算SOD比活力。

表6. 考马斯蓝G-250测收集试样的蛋白含量(A595)：

豆液 试管3

稀释倍数 ——

第一次测量 0.121

第二次测量 0．115

平均值（nm）

0.118

计算得：

加入酶量相当的酶活力单位(unit)=（△A-△A’）/△A*2 样① (0.078-0.021)/0.076*2=1.51 样② (0.063-0.025)/0.063*2=1.21 样③ (0.074-0.041)/0.074*2=0. 试管3 (0.074-0.0)/0.074*2=0.

提取液的总活力(unit)=加入酶量相当的酶活力单位*（反应液总体积/取样液体

积）*稀释倍数

样① 1.51*（219/0.050）=6613.8 样② 1.21*（221/0.055）=4862 样③ 0.*（50/0.048）=929.05 试管3 0.*（3/0.065）=24.92

SOD总得率为：总得率=最后样品活率/样1活率*100% =24.92/6613.8*100% =0.3768%

SOD的比活力为=总活力（units）/总蛋白量（mg） 样① 6613.8/1467.3=4.51 样② 4862/773.5=6.29 样③ 929.05/80 =11.61 试管3 24.92/2.95=8.45

纯化倍数=比活2/比活1 ① 6.29/4.51=1.40 ② 14.45/4.51=3.20 ③ 8.45/4.51 =1.87

（四）实验总结及讨论：

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根据以上数据，计算各步提纯中酶的总活力：

A325 加样体积（ml 总体积（ml） 总活力（U）

样① 0.031 0.05 221 6613.8 样② 0.025 0.055 219 4862 样③ 0.041 0.057 50 929.05

试管（3）

0.143

0.30

3

24.92

总蛋白含量计算：

样① 样② 样③ 试管（3）

取样蛋白质含量

（mg）

稀释倍数

加样体积（ml）

总体积（ml）

总蛋白含量(mg)

0.067 0.035 0.016 0.118

—— —— —— ——

0.01 0.01 0.01 0.12

219 221 50 3

1467.3 773.5 80 2.95

纯化步骤

粗酶液（样①）

40%硫酸铵盐析（样②） 透析后(样③）

葡聚糖凝胶层析（试管3)

总活力（U） 总蛋白（mg） 比活(U/ mg pro.) 纯化倍数

1467.3 6613.8 4.51

4862

1156.25

76.209

773.5 80 2.95

6.29 14.45

8.45

1.40 3.20 1.87

70006000总活力（U）500040003000200010000012345试管号

图3.各纯中SOD总酶趋势

化步骤活变化

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图4.各纯化步骤中SOD总蛋白含量变化趋势

1614比活(U/ mg pro.)1210820012345试管号

图5. 各纯化步骤中SOD比活变化趋势

1.可以看出，在25g绿豆中随着不断的分离提纯，总活力不断减小，比活力不断上升，最后总纯化倍数为1.87，活性得率为0.3768%，没有达到预期效果。

2. 为什么要从植物中提取SOD？

初步验证阶段。国外SOD主要应用于医疗、保健方面，有以动物血液及内脏为原料制取SOD的报导，但存在着成本高、含有致热因子等缺陷，因此，适用范围极为有限。尤其是近年来受“疯牛病”的影响，许多国家和地区抵制以动物血液及内脏为原料制取的超氧化物歧化酶，使得超氧化物歧化酶在国际市场上极为紧缺。

从植物，特别是人们日常经常食用的蔬菜、瓜果、野生植物及粮食中提取SOD，使用安全性非常高，避免了可能发生的交叉感染。利用全新的生物技术从植物中提取SOD，具有明显的社会和经济效益，市场前景广阔。从植物中提取SOD的主要工艺流程为:植物→打浆→超滤分离→有机溶剂去杂→柱层析精制→超滤浓缩→冷冻干燥→产品

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3.用Tric-HCl而不用磷酸缓冲液的原因

因为反应物连苯三酚在酸性条件下稳定，在碱性条件下能自氧化。而SOD活力的测定是依靠SOD抑制连苯三酚的自氧化实现的。磷酸缓冲液pH大约为7点多，无法提供连苯三酚自氧化需要的碱性环境。

4.邻苯三酚加入量对测量的影响

邻苯三酚的浓度是决定其自氧化速率高低的一个主要因素，浓度越高，自氧化速度越快，相同单位的SOD对邻苯三酚自氧化的抑制程度就越小，从而使得测量结果越低。

所以为使结果具有可重复性，必须严格控制测定液中邻苯三酚的终浓度保持相同。

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