饲料中糖皮质激素类药物含量的UPLC—MSJ／MS检测方法的研究

旦料工业》・２００９年第３Ｏ笸第７期　饲料中糖皮质激素类药物含量的　Ｕ　ＰＬ　Ｃ—ＭＳ／ＭＳ检测方法的研究　贾振民班付国　吴宁鹏宋志超　摘要试验建立了饲料中９种糖皮质激素类药物含量的ＵＰＬＣ—ＭＳ／ＭＳ检测方法。饲料中的糖　皮质激素类药物经甲醇振荡提取，浓缩蒸干，溶解后用碳黑固相萃取柱串接氨基固相萃取柱净化后，　液相色谱一串联质谱法测定，外标法定量。９种药物在２～１００　ｎｇ／ｍｌ浓度范围内呈线性相关，相关系数在　０．９９７－０．９９９　５，方法在饲料中最低检测限（Ｌ０Ｄ）为２　ｋｇ；定量ｔ：￣（ＬＯＱ）为５　ｐ￣ｇ／ｋｇ。此方法在空白饲　料中添加５～２０　ｎｇ／ｇ浓度范围内，平均回收率在５５．１％～８８．２％，批内变异系数为３．３％～１９．１％，批间变异　系数为４．２％～１３．５％。该方法具有较好的灵敏度、准确度和精密度，能完全满足饲料中此类药物含量的　检测，可以作为此类药物的标准化检测方法。　关键词饲料；糖皮质激素；液相色谱一串联质谱（ＵＰＬＣ—ＭＳ／ＭＳ）　中图分类号Ｓ８ｌ６．１７　糖皮质激素类药物为类固醇激素类药物之一　目　的松、倍氯米松、地塞米松、倍他米松、醋酸氟氢可　前临床上常用的药物包括泼尼松（Ｐｒｅｄｎｉｓｏｎｅ１、泼尼松　的松和醋酸可的松均为Ｓｉｇｍａ公司生产，纯度大于　龙（Ｐｒｅｄｎｉｓｏｌｏｎｅ）、甲基泼尼松龙（Ｍｅｔｈｖｌｐｒｅｄｎｉｓ０ｎｅ１、地　９８．０％。甲酸、甲醇、乙腈为色谱纯；其它试剂均为分析　塞米松（Ｄｅｍｘａｍｅｔｈａｓｏｎｅ１、倍他米松（Ｂｅｔａｍｅｔｈａｓｏｎｅ１、　纯；迪马公司碳黑固相萃取柱（５００　ｒａｇ／６　ｍ１）和Ｗａ—　倍氯米松（Ｂｅｃｌｏｍｅｔａｓｏｎｅ１、醋酸氟氢可的松（Ｆｌｕｄｒｏｃｏｒ—　ｔｅｒｓ公司氨基固相萃取柱（５００　ｍｇ／６　ｍ１）。　ｔｉｓｏｎｅ　Ａｃｅｔａｔｅ）、醋酸可的松（Ｃｏｒｔｉｓｏｎｅ　ａｃｅｔａｔｅ１、氢化可　１．２仪器　的松（Ｈｙｄｒｏｃｏｒｔｉｓｏｎｅ），这类药物由于其良好的抗炎、抗　液质联用仪（Ｗａｔｅｒｓ　ＡＣＱＵＩＴＹ　ＵＰＬＣ和Ｑｕａｔｔｒｏ　免疫、抗毒素和抗休克作用，所以在兽医临床防治动物　Ｐｒｉｍｉｅｒ配电喷雾电离源）；高速离心机，德国Ｈｅｒａｅｕｓ　疫病上被广泛应用。目前，糖皮质激素类药物已能人工　公司；旋转蒸发仪，瑞士Ｂｕｃｈｉ公司；电子天平，瑞士　合成。此外，这类药物同Ｂ一受体激动剂和合成类固醇　ＭＥＴＹＬＥＲ公司；振荡器，德国ＩＫＡ公司。　激素一样．具有增加体重，产生脂肪再分配作用，因此　１．３试验方法　这类药物被一些养殖户超标超量使用和滥用。由于此　１．３．１　色谱条件　类药物会对人体产生严重的毒副作用，所以，我国规定　色谱柱：ＢＥＨ　Ｃｌ８（１００　ｍｉｎｘ２．１　ｍｍ，１．７　ｍ）。流动相：　这些药物禁止在饲料中添加使用，而且对于用作治疗　Ａ相为乙腈，Ｂ相为０．１％甲酸水溶液，流速０．３　ｍｌ／ｍｉｎ；　目的的一些药物使用，如地塞米松和倍他米松，也制定　柱温３０℃，进样量５　ｌ。梯度洗脱程序：０～８　ｒａｉｎ　２５％　了严格的最大残留限量。国家规定地塞米松和倍他米　流动相Ａ线形变化为３５％；８～９　ｍｉｎ　３５％流动相Ａ线　松在肌肉、肝脏和肾脏中的最大残留限量为０．７５　ｎｇ／ｇ。　形变化为８０％；９～１０　ｍｉｎ　８０％流动相Ａ线形变化为　为了保障食品安全，维护人体健康，提高人民生活水平，　２５％：１Ｏ～１２　ｒａｉｎ流动相Ａ为２５％。　有必要建立一种有效合理的标准化检测方法。　１－３．２试剂配制　ｌ材料与方法　洗脱液：二氯甲烷＋甲醇（７０＋３０，Ｖ１＋Ｖ２）；乙腈溶　ｔ．１药品和试剂　液：乙腈＋水溶液（３０＋７０，Ｖ１＋Ｖ２）。　对照品：泼尼松龙、泼尼松、甲基泼尼松、氢化可　１．３．３质谱条件　扫描方式为负离子扫描；检测方式为多反应监测；　电离方式为电喷雾离子源（ＥＳＩ３，源温ｌｌ０℃、雾化温　贾振民，河南省饲料产品质量监督检验站，高级畜牧师，　度３００　ｏＣ、锥孔气流速５０　Ｌ／ｈ、雾化气流速６５０　Ｌ／ｈ；碰　４５０００８，河南省郑州市经三路９１号。　撞室压力３．５ｘ１０　ｍｂａｒ；毛细管电压、锥孔电压、碰撞　班付国、吴宁鹏、宋志超，单位及通讯地址同第一作者。　能量等应优化至最优灵敏度。９种糖皮质激素的保留　收稿Ｅｌ期：２００９—０２—１０　时间￣ＩＩ［Ｍ＋ＨＣＯ０］一离子、特征离子见表１。　贾振民等：饲料坚　匮　素　垫　全童　二　兰　型垄　丝堑窒　表１　９种糖皮质激素的保留时间和　［＋ＨＣＯ０］－￣子、特征离子　高速离心１０　ｍｉｎ，取上清液适量，供液相色谱一串联质　谱仪测定。　１．３．６回收率与精密度　在空白饲料中分别添加５、１Ｏ、２０　ｎｇ／ｍｌ三个不　同浓度的９种糖皮质激素类药物进行准确度试验，　每个浓度做６个平行样，计算回收率及批内、批间变　异系数。　１．３．７检测限与定量限　注：ａ定量离子。　添加适量混合标准溶液于５　ｇ空白饲料中，经提　１．３－４标准曲线　取后测定，依据信噪比Ｓ／Ｎ＞３（按ＰｔＰ算）为检测限。信　取对照品适量，用３０％乙腈溶液配制成混合标样　噪比Ｓ／Ｎ＞１０（按ＰｔＰ算）为定量限。　２、５、１０、２０、５０、１００　Ｉ，ｚ　工作液；依照浓度由／ｂＮ大的　２结果与分析　次序，按上述色谱和质谱条件进样分析，以浓度为横　２．１标准曲线　坐标，选择特征离子的峰面积为纵坐标作图，计算线　以各特征离子质量色谱峰面积为纵坐标，浓度为　性方程和相关系数。　横坐标，绘制标准曲线，各药物的回归方程及相关系数　１．３．５样品处理　见表２。从表２可以看出，在浓度为２～１００．ｇ／ｍｌ范围　称取试样５．０　ｇ（准确至０．０ｌ　ｇ），置于５０　ｍｌ离心管　内，９种药物呈线性相关，相关系数在０．９９７～０．９９９　５。　中，加甲醇１５　ｍｌ，旋涡混合ｌ　ｍｉｎ，震荡提取１５　ｍｉｎ．　标准品特征离子质量色谱见图１。　１０　０００　ｒ／ｍｉｎ离心１０　ｍｉｎ，移取上清液。重复提取一　表２　９种糖皮质激素类药物标准曲线　次，合并上清液。于４０℃下旋转蒸至近干。加入４　ｍ１　甲醇溶解残渣，再加入１６　ｍｌ水，混匀。１０　０００　ｒ／ｍｉｎ离　心１０　ｍｉｎ，移取上清液，备用。碳黑固相萃取柱依次用　二氯甲烷、甲醇、水各６　ｍｌ活化，取备用液全部过柱。　用１　ｍｌ甲醇淋洗，抽干。将预先用６　ｍｌ洗脱液活化好　的氨基固相萃取柱串接在碳黑固相萃取柱下方。６　ｍｌ　洗脱液洗脱，收集洗脱液，于５０℃下氮气吹干。残余物　用３０％乙腈溶液０．５　ｍｌ溶解，涡旋混匀．１０　０００　ｒ／ｍｉｎ　垫触　。，。　。，，　ＭＲＭ　。：劳　ｓ４　ＥＳ４－　７４３　５ｏ　・ｏ０　５０　ｏ０　。５０　ＭＲＭ：　叩ｅｃ№ｎｎｅｌｓＥｓ，　４”４”　‘　。。　。　。　。　。　。　＿４。ｓ　‘　，　”ＭＲＭ：　。　．。　，　镭　图１　９种糖皮质激素类药物的标准品特征离子质量色谱（２０　ｎｇ／ｍ１）　ｏ　堡　釜　塑　主塑垒丛塾查塞堑　全量　２．２准确度与精密度　回收率与批间、批内变异系数见表３。从表中可　以看出，本方法在空白饲料中进行５　，２０　ｎ　ｍｌ的添　＝　，Ｍ曼检测方法的研究　加，方法的回收率为５１．１％～８８．２％，批内变异系数为　３．３％－１９．１％，批间变异系数为４．２％～１３．５％。其添加样　品特征离子质量色谱见图２。　表３饲料中９种糖皮质激素类药物添加回收率试验结果（ｎ：６）　添加浓度（ｎｇ／ｍ１）　５．０　测定参数　药物名称　１０．０　２０．Ｏ　●ｐｌｋ０‘倥Ｐｐｂ－１　图２空白饲料添加特征离子质量色谱（２０￣ｇ／ｍ１）　２－３检测限与定量限　ＨＬＢ＋氨基柱、碳黑＋氨基柱对糖皮质激素的净化效　检测限（ＩＪ０Ｄ）：添加适量混合标准溶￣（１ＯＯ　ｎ咖１）于　果。结果发现，单一采用Ｃ　ＨＬＢ、碳黑固相萃取柱，净　我们采用正　５　ｇ空白饲料中，经提取后测定，依据信噪比Ｓ／Ｎ＞３（按　化效果均不理想，而且回收率较低。因此，ＰｉＰ算），９种糖皮质激素类药物的检测限为０．５　ｎ咖ｌ，定　量限为１．０　ｎｇ／ｍ￣。　３讨论　相和反相两种性质的固相萃取柱联合应用净化的方　法．先后比较了ＨＬＢ＋氨基柱、碳黑＋氨基柱对提取液　的净化效果，结果发现碳黑＋氨基柱对其净化效果较　好，且回收率稳定，重现性较好。　３．１本方法采取了甲醇的提取效果，结果发现，采用　甲醇分两次直接提取糖皮质激素类药物．能获得更　３．３本方法在采用乙腈定容上机时．结果显示药物　高的回收率。而且采用甲醇提取．能起到初步净化的　峰形出现脱尾现象．因此在定容溶液中加入适量的水　作用　３．２本方法先后比较了Ｃ　Ｈ［Ｂ、碳黑固相萃取柱和　后，发现药物的峰形得到改善，能显著提高药物信号　的强度。这可能是与水能改善药物的离子化程度有　词料工业》・２００９年第３０酋鲤Ｚ墅　纛辕蘸寨蠢　景绍红胡占云　张世华　糜　摘　要农作物，尤其是谷物上的各类真菌在运输或存储期间会产生毒枝菌素这种次生代谢产　物。毒枝菌素致使世界农作物产量减少多达２０％，造成全球的经济损失。对生猪饲养有巨大影响的毒　枝菌素，主要发现在未加工的饲料原料中有很高的浓度，像玉米、大麦这种谷物。这种毒枝菌素有黄曲　霉毒素Ｂ　（ＡＦＢ　）、玉米赤霉烯ｆｉ￣（ＺＥＮ）、呕吐毒素（ＤＯＮ）、赭曲霉素（ＯｒｒＡ）和烟曲霉素（ＦＵＭ）。这些毒　物的影响和结果主要取决于内脏吸收的程度和速度、体内的分布、组织的定位、生物转化和它们的排　泄多少。还有就是这些猪饲料的来源及运输方式。上述提到的危害作用主要由毒物的混合和代谢，或　消除这些毒物在组织间的相互作用来决定的。文章的重点是阐述毒枝菌素的基本代谢步骤、毒性动力　学和在猪体内产生的临床症状。　关键词毒枝菌素；代谢；毒物学；猪　￥８１６．３　中图分类号生长在农作物。尤其是谷类上的各类真菌在运输　部和外部因素共同影响真菌的生长和毒素的产生。　或存储期间会产生毒枝菌素这种次生代谢产物。毒枝　菌素可以造成世界农作物产量减少多达２０％。植物在　枝菌素，而环境和农作物易感染的因素是极其复杂难　控制的。　内部因素包括含水量、ｐＨ值、缓慢进行的氧化还原反　应，而外部因素可以影响毒物的产生，包括湿度、温度　摄取真菌毒素后引起的临床毒物学症状已经在　家养动物和实验室动物身上反应出来了．并且是从减　生长的季节可以被真菌和毒素感染，然后就会产生毒　和氧气。　有些真菌如珠镰孢菌素，是在收割前感染：而其　缓生长到死亡。如果摄取了某种尚不引起明显的临床　它的像青霉菌是收割后感染的，还有一种尤其特殊的　毒作用反应水平的毒素，就会抑制机体的免疫系统对　曲霉菌是收割前和后都可以感染的。存在真菌就暗　感染疾病后的反应，淋巴Ｔ和Ｂ细胞活性的降低、免　示毒枝霉素已经产生了，没有真菌不代表没有毒枝　疫球蛋白的减少、干扰素产生和活性的降低都可以证　菌素，认识到这点很重要。在特定的培养基上，有内　明这种毒物导致的免疫抑制。尽管现在某些毒物对特　定细胞和分子引起的免疫抑制的作用机制还不是很　清楚。但是这种免疫抑制通过各种不同的机制直接或　　景绍红，重庆市畜牧科学院，高级畜牧师，４０２４６０，重庆市　间接地抑制了ＤＮＡ、ＲＮＡ和蛋白质的合成。荣昌县城昌州中段７７０号。　毒物的化学结构在生物作用上有可变性，它的毒　性作用主要是在试验动物上研究的。而不是在动物和　人体上。真菌在动物食品上的作用还不完全清楚。它　窜　妊宣　｝始童　妊　窜　；拿－Ｎ６－－－－￣－船　；，，业窖；章妇　窖；拿　夸‘鲁富　业鼗逝　夸　ｒ专　｝宣；｝　ｊ｝夸　辛妇盥　胡占云、张世华，单位及通讯地址同第一作者。　收稿日期：２００９—０２—０２　宣　船夸　专；窖毫　穹　｝夸　关。因此，本方法确定乙腈一水（３０：７０）溶液为上机进　Ｈｒ、［Ｍ＋ＨＣＯＯ］一等多种形式，在负离子模式下，这些化　样溶液。　３．４根据欧盟２００２／６５７／ＥＣ要求，要确证该类物质至　合物全扫描的分子离子［Ｍ＋ＨＣＯＯ］一响应最高，这些结　果与崔晓亮等的报道相符。因此选择目标化合物的　少需要４个识别点（ＩＰ），因此，我们分别选择了加成　ｆＭ＋ＨＣＯＯ］一作为碰撞诱导解离的母离子。除醋酸氟氢　离子『Ｍ＋ＨＣＯＯ］一为母离子以及对应的两个响应较强　可的松和醋酸可的松外，其它７种糖皮质激素的特　的特征子离子作为定性定量依据。这样１个母离子１　征碎片离子为ｆＭ—Ｉｑ一和［Ｍ—Ｈ—ＣＨ　Ｏｌ一，醋酸氟氢可的　个ＩＰ点，对应两个子离子各１．５个ＩＰ点，刚好满足４　松和醋酸可的松的特征碎片离子为『Ｍ—Ｈ１一和『Ｍ—Ｈ—　个ＩＰ点的要求。采用流动注射泵连续进样进行质谱　ＨＣＯＯＣＨ３］一。　参数优化，分别采用ＥＳＩ＋比ＥＳＩ一离子模式进行调谐。　发现糖皮质激素类药物准分子离子峰有『Ｍ＋Ｈ］＋、『Ｍ—　（参考文献若干篇，刊略，需者可函索）　（编辑：刘敏跃，ｌｍ—ｙ＠ｔｏｍ．ｃｏｒｎ）