实验指导

实验一 人类基因组DNA提取及琼脂糖凝胶电泳分析.

实验二 质粒DNA的提取及电泳分析 实验三 聚合酶链式反应及其产物分析 实验四 DNA的性酶切及电泳分析

实验一 人类基因组DNA提取及琼脂糖凝胶电泳分析 实验目的：

1．熟悉分子生物学实验的操作特点。

2．掌握人类基因组DNA提取的基本原理。 3．熟悉人类基因组DNA提取的基本方法。 4．熟悉琼脂糖凝胶电泳的原理和操作。 实验原理：

用细胞裂解液裂解细胞膜，收集细胞核，加入SDS破裂核膜，用蛋白酶K使核蛋白降解成小片段并从DNA上解离下来，经苯酚﹑氯仿抽提去除蛋白质，无水乙醇沉淀DNA，75%乙醇洗涤DNA沉淀，真空干燥后，溶解于TE中即得到高分子量的DNA。 本次实验使用的试剂盒系直接加入裂解液裂解细胞后，用蛋白酶K使核蛋白降解成小片段并从DNA上解离下来，并使用RNaseA降解RNA,再利用特殊硅基质膜吸附DNA的特性，可快速、高效地纯化回收基因组DNA。 操作步骤：

细胞裂解与RNase/蛋白酶K 消化

1. 取100 μl抗凝全血置于1.5ml Eppendorf离心管中，再加入100 μl裂解液和20 μl RNaseA/蛋白酶K液，用移液器来回吹打混匀，室于55℃温浴35分钟，其间来回颠倒离心管几次，直至溶液呈水溶状。

2. 加入10μl 3M的NaAc(pH 4.8)，随后加入1250 μl结合缓冲液，充分振荡混匀，12，000 rpm离心30秒。 DNA与吸附柱结合

3．用移液器Tip转移上清并加入到离心吸附柱（套好收集管）中，放置1分钟，12，000 rpm离心30秒，倒掉收集管中的废液。

注意：待转移上清约1300μl，离心吸附柱容量约650 μl，故需每次转移上清650 μl到离心吸附柱中，离心，倒掉收集管中的废液，重复实验操作步骤3。 DNA的纯化

4. 再加入600 μl洗涤缓冲液（washing buffer）到离心吸附柱（套好收集管）中，12，000 rpm 离心30秒。

5．重复步骤4一次，12，000 rpm 离心3分钟以充分除去洗涤缓冲液。

6．小心取出离心吸附柱，弃收集管，将离心吸附柱套入一个干净的1.5ml Eppendorf 离心管，并加入50 μl洗脱缓冲液(elution buffer) 到离心吸附柱中(洗脱缓冲液一定要加在离心吸附柱的正中)，放置1分钟，于12，000 rpm 离心30秒。 7．取出Eppendorf 离心管，其中便是所提取基因组DNA。 DNA的琼脂糖凝胶电泳

8．取8 -10μl基因组DNA,并加入2 μl上样缓冲液，混匀，加样到1％琼脂糖凝胶点样孔

中,电泳。

实验二 质粒DNA的提取及电泳分析 【实验目的】

1．掌握碱裂解法小量提取质粒DNA的原理和方法。 2．掌握琼脂糖凝胶电泳检测质粒DNA方法。

3．熟悉质粒DNA提取与真核细胞核DNA提取的异同点。 【实验原理】

在pH值为12.0～12.6的碱性环境中，在去垢剂SDS的作用下，细菌的细胞壁与细胞膜均破裂，释放出大量的染色体DNA、RNA及质粒DNA。此时，所有双链DNA解聚成单链，但质粒DNA仍保持环状。当pH值恢复到中性时，在高盐浓度下，大分子量的染色体DNA只是部分复性，相互交织成不溶性的网状结构，与细胞碎片、部分蛋白质和大分子量的RNA一起沉淀，并可通过离心除去。而环状的质粒DNA可以完全复性，溶解于上清中，从而达到初步分离的目的。

本试剂盒采用改进SDS-碱裂解法裂解细胞，离心吸附柱内的硅基质膜在高盐、低pH值状态下选择性地结合溶液中的质粒DNA，再通过漂洗液将杂质和其他细菌成分去除，最后以低盐、高pH值的洗脱缓冲液将纯净质粒DNA从硅基质膜上洗脱。 【操作步骤】

1．取1.5ml过夜培养的菌液，12000 rpm，离心30s，弃上清，尽可能倒干，收集菌体沉淀。

2．用100μl 溶液I（50mmol/L Tris-HCl pH8.0, 10mmol/L EDTA）重悬菌体沉淀，Tip吹打至彻底悬浮。

3．加入150μl 溶液II（0.2mol/L NaOH, 1% SDS），轻轻颠倒混匀4~6次，使充分菌体充解，室温放置5 min，直至溶液变得清亮。

4．加入150μl 溶液III（4mol/L 盐酸胍，0.5mol/L KAc pH4.2），立即温和颠倒混匀4~6次。室温放置5 min，12000 rpm离心10 min，小心吸取上清。

5．加入400μl 结合缓冲液（5mol/L 盐酸胍，20mmol/L Tris-HCl pH6.6, 37.5%乙醇）于离心吸附柱中，然后将步骤4中的上清加入吸附柱中（不要将沉淀移入吸附柱），混匀,套入收集管中，12000 rpm离心30 s，倒掉收集管中的废液。

6．加入750μl 漂洗液（20mmol/L NaCl, 2mmol/L Tris-HCl pH7.5, 80%乙醇）于离心吸附柱中，静置1min ，12000 rpm离心15 s，倒掉收集管中废液。 7．重复步骤6一次。

8．再次于12000 rpm空离心2 min, 尽量除去漂洗缓冲液中的乙醇。

9．取出离心吸附柱，将其套入一个干净的1.5ml Eppendorf管中，在硅基质膜部位加入50μl洗脱缓冲液（10mmol/L Tris-HCl, 1mmol/L EDTA pH8.0)，室温放置2 min，12000 rpm离心1 min。

10．丢弃离心吸附柱，溶液中含有目的质粒DNA，置于4℃或－20℃保存。 【注意事项】

1． 所用器具必须严格清洗，最后要用双蒸水冲洗3次，凡可以进行灭菌的试剂与器具都要经过高压蒸汽灭菌，防止外源性核酸酶对DNA的降解以及其他杂质的污染。

2． 细菌培养容器最好用三角烧瓶，其容量至少应为培养液体积的四倍，从而保证氧气的供应。细菌培养不要超过16 h，否则细菌会崩解，引起细菌大量死亡，导致质粒丢失。 3． 溶液I在用前加入RNase A，并置于4℃保存。

4． 在碱裂解提质粒的方法中，关键之一是加入溶液III的时机，这决定了DNA变性与复性的时间。既要使溶液II 与染色体DNA充分作用使之变性，又要保证质粒DNA不会因作

用时间过久而发生不可逆的变性。若质粒变性过度，将引起提取效率下降、内切酶切割困难等一系列问题。因此，加入溶液II切忌剧烈振荡，时间不应超过5 mins。

5． 加溶液溶液III离心后，倘若上清中还有微小白色沉淀，可再次离心后取上清。 6． 本试剂盒优点：快速、方便；产量高、纯度好；毒性低：采用硅基质膜离心柱纯化质粒DNA，不需酚、氯仿抽提。

实验三：聚合酶链式反应及其产物分析

实验目的：熟悉PCR反应的原理；掌握PCR反应的操作步骤以及PCR反应参数的选择与优化；掌握PCR产物的琼脂糖凝胶电泳检测方法。

实验原理：PCR扩增是模拟天然DNA复制过程，利用DNA聚合酶在体外（试管中）扩增一对引物之间特异性DNA片段的方法。其主要热循环过程可分为三个步骤： （1）高温变性（denature）：提供DNA复制的有效模板。 （2）低温退火（anneal）：引物与模板DNA复性，提供游离3’-OH端供DNA复制起始； （3）中温延伸（extend）：依赖Mg2+，DNA聚合酶催化合成与模板互补的新的DNA分子。

以上变性、退火、延伸三个过程组成一个循环周期；常循环25～40周期，经过n轮循环后，靶DNA的拷贝数理论上呈2n增长；循环进行完毕，通常最后还在DNA聚合酶最适温度下延伸5～10分钟。

操作步骤：本次实验程序如下：

（1）标记一个洁净的200uL反应管，向其中依次加入： ddH2O 36 uL

10×PCR反应缓冲液 5uL 2mmol/L dNTPs 5uL 上游引物 1uL 下游引物 1uL DNA模板 1uL

Taq DNA聚合酶 1 uL 总体积：50uL

混合均匀后，盖紧管盖，离心5S，使反应成份均匀富集于管底。

（2） 加石蜡油50～100μl于反应液表面以防蒸发（此步骤根据PCR仪而定，如带高温热盖PCR仪不需加入）。

（3） 在PCR仪上设置反应循环参数，本次实验为：94℃ 30s，56℃ 30s，72℃ 30s，循环数为30，最后于72℃充分延伸10 min后终止反应（16℃ 3 min）。 （4） 置反应管于PCR仪上进行热循环。

（5） 反应完毕后，常取5～10％反应产物（如本次5uL）进行琼脂糖凝胶电泳，通过溴乙锭染色，在紫外灯下观察扩增产物的质量，正常DNA电泳带应清晰、整齐，并通过与已知分子量大小的DNA标志物比较，初步了解产物大小是否与预期吻合。

注意事项：

1. 戴手套操作，避免污染 2．冰上操作 结果分析：

实验四 DNA的性酶切及电泳分析

实验目的：

1．掌握性核酸内切酶消化DNA的原理。 2．掌握重组质粒DNA的酶切鉴定方法。 3．掌握琼脂糖凝胶电泳分析酶切结果。 基本原理

性核酸内切酶是一类能识别双链DNA中特定碱基顺序的核酸水解酶（水解磷酸二酯键）。根据酶的识别切割特性、催化条件及是否具有修饰酶活性，可分为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型三大类。通常所指的DNA性核酸内切酶就是Ⅱ型酶。 主要试剂

重组质粒DNA 插入片段300bp

本实验所用性核酸内切酶为EcoRⅠ，其识别顺序为： 5′----G↓AATT C----3′ 3′----C TTAA↑G----5′

磷酸二脂键断裂 产生5′粘性末端。 操作步骤

1. 反应体系的建立：

⑴ 在一无菌1.5 ml Eppendorf管中加入： 无菌双蒸水 7 μl 10×酶切缓冲液 2 μl

质粒DNA(100 ng/μl) 10 μl EcoRⅠ(5 U/μl) 1 μl 总体积为20μl

⑵ 轻轻混匀，12000 rpm离心5 sec。 2. 37 ℃水浴1 h。

3. 将Eppendorf管置65 ℃水浴中10 min，通过加热使酶失活以终止反应。 4. 12000 rpm离心5 sec，将管盖及管壁上的水离下。

5. 取10 μl消化产物，与2 μl 6×上样缓冲液混匀，琼脂糖凝胶电泳检测消化效果，电泳条件：约100 V 30～60 min。 6 结果观察。 操作注意事项：

1. 吸样量一定要准确

2. 为了不使酶污染而导致浪费，最后才加酶 3. 要求在冰上操作，并充分混匀，

4. 开启Eppendorf管时，手不要接触到管盖内面，以防污染。

5. 样品在37 ℃与65 ℃保温时，将离心管盖严，以防水进入管内造成实验失败。 性内切酶酶解中常见的问题和原因 1． DNA完全没有被性内切酶切割：①性内切酶失活；②DNA不纯，含有SDS、有机溶剂、EDTA等；③非性内切酶最佳反应条件；④酶切位点被修饰；⑤DNA上不存在该酶的识别顺序。

2． DNA切割不完全：①性内切酶活性下降或稀释不正确；②DNA不纯或反应条件不佳；③酶切位点被修饰；④部分DNA溶液粘在管壁上；⑤酶切后DNA粘末端退火。 3． DNA片段数目多于理论值：①性内切酶星号活力；②存在第二种性内切酶污染；③样品DNA中含有其它DNA。