微生物综合实验报告——利用多管发酵法检测水中大肠杆菌群数量

微生物综合实验报告

实验题目：水质微生物学分析——利用多管发酵法检测水中大肠杆菌群数量

组员姓名：xxx

作者单位：南京工业大学生物与制药工程学院

专业班级：生物工程类1001班

指导老师：xxx

摘要：实验采用自来水作为样品，对样品进行接种，分离，纯化，培养得到具有不同特征的肠杆菌。通过对肠杆菌的数量和形态特征的分析，确定自来水是否被污染和污染程度。

关键词：水源；肠杆菌；数量；污染

前言：水是制药和食品行业使用最为广泛的原料，也是赖以生存和发展的物质基础。水与药品、食品中的其他原料一样，必须符合既定的质量标准，如果水被污染就会影响多批次产品。另外，对微生物实验室来说，水是各种培养基、缓冲液、检测剂的主要组成部分。近年来，由于国际上一些地区和国家频繁发生恶性事件，饮用水安全和卫生问题引起了全球的关注，饮水安全已经成为全球性的重大战略性问题。世界卫生组织调查表明：在发展中国家，各类疾病有8%是因为饮用了不安全、不卫生的水而传播的，每年大约有2000万人死于饮用不卫生的水。必须严格控制水的微生物学质量，以保证医药食品产品、培养基、试剂等的质量的可靠性以及人类饮用水的安全。 我国饮用水水质微生物学指标：

细菌总数≤80 CFU/mL 总大肠菌群 每 100 mL 水样中不得检出 耐热大肠菌群 每 100 mL 水样中不得检出

国际上目前主要的水质标准是世界卫生组织（WHO）制定颁发的《饮用水水质准则》

制药用水微生物监测是为了监控控制性微生物从而将水中微生物含量维持在一定水平。没有必要将水中存在的所有微生物都监测出来，只针对对产品对人具有潜在危害的致病性的微生物进行监控。流行病学研究确认，水携带的病原菌的存在与肠道来源的细菌相关，肠道病原微生物进入水体，随水流传播可引起肠道病爆发流行，所以必须对水中病原微生物严格监控。但要从水体中直接检出病原微生物比较困难，它们在水中的数量很少且培养条件苛刻，分离和鉴别都比较难，即使样品检测结果是阴性也不能保证没有病原微生物的存在。因此，常用指示微生物作为水体中病原微生物的监测指标。大肠菌群细菌在人的肠道和粪便中数量很多，受到粪便污染的水容易被检出，且检测方法比较简易。所以，常以大肠菌群为微生物评价水的卫生质量。大肠菌群是一群需氧或兼性厌氧的、在37℃培养24~48h能发酵乳糖产气的革兰氏阴性无芽孢杆菌，包括埃希菌属（Escherichia)、柠檬酸杆菌属（Citrobacter）、肠杆菌属（Enterobacter）、克雷伯菌属（Klebsiella）。大肠菌群数是指每升水中含有的大肠菌群的近似值，根据水中大肠菌群的数目即可判断水源是否被粪便污染，并推断水源受肠道病原菌污染的可能性。本实验主要通过多管发酵法检测水中大肠菌群的数量。 1、材料和方法 1.1 方法： 1.1.1 水样 自来水 1.1.2 培养基

乳糖蛋白胨培养基：蛋白胨2.4g；牛肉膏0.72g；乳糖1.2g；氯化钠1.2g；1.6%溴甲酚紫溶液0.24mL；蒸馏水240mL；pH7.4（分装于试管中，内含倒置杜氏小管）。 3倍浓度乳糖蛋白胨培养基：蛋白胨1.05g；牛肉膏0.315g；乳糖0.525g；氯化钠0.525g；1.6%溴甲酚紫溶液0.105mL；蒸馏水35mL；pH7.4（分装于试管中，内含倒置杜氏小管）。

伊红-美篮(EMB)培养基：伊红-美篮(EMB)培养基粉末4.24g；蒸馏水100mL；pH7.2；（倒入培养皿中，制成平板）。 1.1.3 灭菌水 作阴性对照。 1.1.4 接种大肠埃希菌的水样 作阳性对照。 1.1.5 试剂盒染色剂

草酸铵结晶紫染液、路歌碘液、番红染液。 1.1.6 仪器设备

超净工作台、恒温培养箱、显微镜、高压蒸汽灭菌仪等。 1.1.7 其他

灭菌移液管、载玻片、接种环、酒精灯、香柏油、二甲苯、无菌水、擦镜纸等。 1.2 实验方法： 1.2.1 初发酵试验 1.2.1.1 标记试管

取5支3倍浓度乳糖蛋白胨培养基试管，标记加水量10mL；5支乳糖蛋白胨培养基试管，标记加水量1mL；5支乳糖蛋白胨培养基试管，标记加水量0.1mL。

取2支3倍浓度乳糖蛋白胨培养基试管，标记阳性对照和阴性对照和加样量10mL；2支乳糖蛋白胨培养基试管，标记阳性对照和阴性对照和加样量1mL；2支乳糖蛋白胨培养基试管，标记阳性对照和阴性对照和加样量0.1mL。 1.2.1.2 接种

用移液分别取10mL水样加入标记好的3倍浓度乳糖蛋白胨培养基试管内；分别取1mL水样加入标记好的乳糖蛋白胨培养基试管内；分别取0.1mL水样加入标记好的乳糖蛋白胨培养基试管内，轻轻摇匀。

1.2.1.3 制备阳性对照

用移液分别取接种E.coli的水样10mL、1mL、0.1mL加入以上标记好的试管中。 1.2.1.4 制备阴性对照

用移液分别取灭菌水10mL、1mL、0.1mL加入以上标记好的试管中。 1.2.1.5 培养

将以上接种后的所有试管放入37℃培养箱中培养48h。 1.2.1.6 观察实验结果

观察记录各加水量产酸产气的试管数，即为阳性管数。若有a支3倍浓度培养基试管产酸产气，有b支1倍浓度培养基加水量1mL的试管产酸产气，有c支1倍浓度培养基加水量0.1mL的试管产酸产气，则阳性组合为a-b-c。根据大肠菌群存在的管数查大肠菌群检数表得出每100mL水样中大肠菌群 MPN，报告每升水样中大肠菌群数。对于表中未列出的组合，可利用Thomas公式计算最大可能数。

MPN/100mL=(阳性管数*100）/exq（阴性管中水样体积*全部试管中水样体积） 单位（mL） 1.2.2 平板分离 1.2.2.1 划线接种

将产酸产气试管中的培养物在EMB平板上进行划线接种，于37℃培养箱培养24h 1.2.2.2 观察培养后的菌落特征 菌落特征类型：

菌落深紫色，有金属光泽——典型大肠菌群菌落； 菌落深紫色，无金属光泽——典型大肠菌群菌落； 菌落粉红色，黏稠状，不透明——非典型大肠菌群菌落； 其他特征。 1.2.2.3 镜检

挑选呈以上三种菌落特征的菌种进行革兰氏染色，用显微镜观察革兰氏染色结果和有无芽孢。 1.2.3 复发酵试验

1.2.3.1 再次接种

将镜检确认为革兰氏阴性、无芽孢的菌落接种于乳糖蛋白胨培养基中，于37℃培养箱中培养24h。 1.2.3.2 观察结果

观察培养24h后的菌种产酸产气的情况，产酸产气的可最终确认为大肠菌群菌落 1.2.3.3 计算结果

根据复发酵试验结果再次计算100mL水样中大肠菌群 MPN 。 2、结果与分析 2.1 初发酵结果

2支3倍浓度培养基试管产酸产气，有2支1倍浓度培养基加水量1mL的试管产酸产气，有0支1倍浓度培养基加水量0.1mL的试管产酸产气,所以阳性组合为 2-2-0。查附表得每100mL水样中大肠菌群MPN为9。（表2-1） 2.2 平板分离结果

3倍浓度培养基试管中的菌群划线接种得到深紫色、无金属光泽的菌群和粉红色的菌群；1倍浓度培养基加水量1mL的试管中的菌群划线接种得到深紫色、有金属光泽的菌群。 2.3 镜检结果

菌群深紫色，有金属光泽的典型大肠菌群菌落——革兰氏阴性，无芽孢； 菌群深紫色，无金属光泽的典型大肠菌群菌落——革兰氏阴性，无芽孢； 菌群粉红色，黏稠状，不透明的典型大肠菌群菌落——革兰氏阴性，无芽孢。 （表2-3） 2.4 复发酵结果

经24h培养后，有9支试管产酸产气，可认定为大肠菌群细菌

MPN/100mL=(阳性管数*100）/exq（阴性管中水样体积*全部试管中水样体积）=9

接种水样量 10mL 阳性管数 2 1mL 0.1mL 2 0 (表2-1） 菌群特征 深紫色，有金属光泽 深紫色，无金属光泽 粉红色，粘稠状，不透明 革兰氏染色结果 阴性 阴性 阴性 有无芽孢 无 无 无 （表2-3） 3、结论与讨论

经过一系列的实验表明，该水样中存在大肠菌群。并且，大肠菌群存在的数量已经超出生活饮用水的卫生标准规定。

心得体会：这次实验验证了自来水中存在大肠菌群及其数量标准。通过对整个实验的把握、计划及实验步骤的实施，可以看出，在实验当中我们还是缺少对整体实验的细致了解和计划。对实验可能出现的结果不能提前预测分析，缺少对问题的深入理解。这次实验同时也体现了许多我们操作上的不规范，不能完全按照无菌接种计术来完成实验，导致误差变大，和轻微我污染。 4、致谢

感谢实验过程中袁丽红老师的方法原理指导和仪器操作方面的指导，以及组员的团结合作。 5、参考文献

《生活饮用水中氨氮检测方法的研究》 《安全饮用水保障集成技术研究》

《饮用水中微囊藻毒素降解机理与去除技术研究》 6、贡献率：50%