灵香草中总黄酮的提取工艺研究

时珍国医国药２０１０年第２１卷第７期ＬＩＳＨＩＺＨＥＮ　ＭＥＤＩＣＩＮＥ　ＡＮＤ　ＭＡＴＥＲＩＡ　ＭＥＤＩＣＡ　ＲＥＳＥＡＲＣＨ　２０１０ＶＯＬ．２１　ＮＯ．７　◇带０齐０与炮带０◇　灵香草中总黄酮的提取工艺研究　杨瑞云，李远，梁凤琴，兰艳素，楚利敏，管海波，银小玲　５４１００４）　（广西师范大学药用资源化学与药物分子工程教育部重点实验室，广西桂林摘要：目的研究灵香草中总黄酮的最佳提取工艺。方法采用正交实验，考察了溶剂浓度、液料比、提取时间、提取次数　对灵香草中总黄酮提取量的影响。结果灵香草中总黄酮最佳提取工艺为６０％乙醇，液料比１０：１，提取３次，２　ｈ／次。　结论该工艺简单易行，是灵香草中提取总黄酮的有效途径。　关键词：灵香草；　总黄酮；提取工艺；正交实验　ＤＯＩ标识：ｄｏｉ：１０．３９６９／ｉ．ｉｓｓｎ．１００８－０８０５．２０１０．０７．０７１　中图分类号：Ｒ２８４．２　文献标识码：Ａ　文章编号：１００８－０８０５（２０１０）０７—１７１８－０２　Ｓｔｕｄｙ　ｏｎ　ｔｈｅ　Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ　Ｃｏｎｄｉｔｉｏｎ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ｔｏｔａｌ　Ｆｌａｖｏｎｏｉｄｓ　ｆｒｏｍ　Ｌｙｓｉｍａｃｈｉａ　ｆｏｅｎｕｍ－—　ｇｒａｅｃｕｍ　Ｈａｎｃｅ　ＹＡＮＧ　Ｒｕｉ—ｙｕｎ，ＬＩ　Ｙｕａｎ，ＬＩＡＮＧ　Ｆｅｎｇ—ｑｉｎ，ＬＡＮ　Ｙａｎ—ＳＯ，ＣＨＵ　Ｌｉ—ｍｉｎ，ＧＵＡＮ　Ｈａｉ—ｂｏ，ＹＩＮ　Ｘｉａｏ—ｌｉｎｇ　（Ｋｅｙ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　ｆｏｒ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　ａｎｄ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ　ｏｆ　Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ　Ｒｅｓｏｕｒｃｅｓ，Ｍｉｎｉｓｔｒｙ　ｏｆ　Ｅｄｕｃａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｃｈｉ—　ｎａ，Ｇｕａｎｇｘｉ　Ｎｏｒｍａｌ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｇｕｉｌｉｎ　５４１００４，Ｃｈｉｎａ）　Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ　Ｔｏ　ｓｔｕｄｙ　ａｎｄ　ｏｐｔｉｍｉｚｅ　ｔｈｅ　ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ　ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｔｏｔａｌ　ｆｌａｖｏｎｏｉｄｓ　ｉｎ　Ｌｙｓｉｍａｃｈｉａ　ｆｏｅｎ．ｍ—ｇｒａｅｃｕｍ　Ｈａｎｃｅ．Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｏｒｔｈｏｇｏｎａｌ　ｔｅｓｔ　ｗａｓ　ｃａｒｒｉｅｄ　ｏｕｔ　ｔｏ　ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅ　ｔｈｅ　ｅｆｆｅｃｔｓ　ｏｆ　ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｓｏｌｖｅｎｔ，ｔｈｅ　ｒａｄｉｏ　ｌｉｑｕｉｄ　ｔｏ　ｍａｔｅｒｉａｌ，　ｔｉｍｅ　ｏｆ　ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ，ａｎｄ￣ｅｑｕｅｎｃｙ　ｏｆ　ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ　ｏｎ　ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ　ｒｅｓｕｈｓ　ｏｆ　ｔｏｔａｌ　ｆｌａｖｏｎｏｉｄｓ　ｆｒｏｍ　Ｌｙｓｉｍａｃｈｉａｆｏｅｎ￣，ｍ—ｇｒａｅｃｕｍ　Ｈａｎｃｅ．　Ｒｅｓｕｌｔｓ　Ｔｈｅ　ｏｐｔｉｍｕｍ　ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ　ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ　ｗａｓ　ｔｏ　ｅｘｔｒａｃｔ　Ｌｙｓｉｍａｃｈｉａ　ｆｏｅｎ．ｍ—ｇｒａｅｃｕｍ　Ｈａｎｃｅ　ｉｎ　６０％ｅｔｈａｎｏｌ　ｗｉｔｈ　ｔｈｅ　ｒａｔｉｏ　ｏｆ　ｌｉｑｕｉｄ　ｔｏ　ｍａｔｅｒｉａｌ　ａｔ　１０：１　３　ｔｉｍｅｓ，ｗｉｔｈ　２　ｈｏｕｒｓ　ｆｏｒ　ｅａｃｈ　ｔｉｍｅ．Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ　Ｔｈｅ　ｏｐｔｉｍａｌ　ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ　ｉｓ　ｓｉｍｐｌｅ　ａｎｄ　ｆｅａｓｉｂｌｅ，ａｎｄ　ｃａｎ　ｐｒｏｖｉｄｅ　ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ　ｆｏｒ　ｆｕｒｔｈｅｒ　ｒｅｓｅａｒｃｈ　ｏｆ　Ｌｙｓｉｍａｃｈｉａ　ｆｏｅｎｕｍ—ｇｒａｅｃｕｍ　Ｈａｎｅｅ．　Ｋｅｙ　ｗｏｒｄｓ：Ｌｙｓｉｍａｃｈｉａ　ｆｏｅｎ．ｍ—ｇｒａｅｃｕｍ　Ｈａｎｃｅ；Ｔｏｔａｌ　ｆｌａｖｏｎｏｉｄｓ；　Ｏｒｔｈｏｇｏｎａｌ　ｔｅｓｔ；Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ　ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ　灵香草Ｌｙｓｉｍａｃｈｉａ　ｆｏｅｎｕｍ—ｇｒａｅｃｕｍ　Ｈａｎｃｅ为报春花科排草　２．１．１　芦丁标准溶液的配制精密称取已干燥至恒重的芦丁标　属植物…，主产于广西、广东、云南等地，有“香中之王”的称号，　准品５　ｍｇ，用８０％甲醇定容至５０　ｍｋ容量瓶中，摇匀即配得０．１０　是一种重要的天然香料来源。同时，灵香草全草入药，味甘，性　ｍｇ／ｍｌ芦丁标准液。　平，归肺、胃经，具有解表、止痛、行气、驱蛔的功效　，极具药用　２．１．２测定波长的选择精密量取２．０　ｍｌ芦丁工作液于１０　ｍｌ　研究价值。本课题组在对灵香草化学成分的研究中，发现其中富　容量瓶中，加８０％甲醇溶液至５　ｍｌ，加入５％亚硝酸钠溶液０．３　含黄酮类成分。黄酮类化合物在自然界分布广泛，具有抗肿瘤、　ｍｌ，摇匀，放置６　ｍｉｎ后，加１０％硝酸铝溶液０．３　ｍｌ，摇匀，放置６　抗氧化、抗菌消炎、抗衰老等功效。然而迄今针对灵香草中总黄　ｍｉｎ，加１０％氢氧化钠溶液１．５　ｍｌ，再加８０％甲醇定容，放置１５　酮提取工艺的研究尚未见报道。本文通过正交实验优选灵香草　ｍｉｎ。以试剂空白做参比，在２６０～６００　ｎｍ波长范围内进行紫外　中总黄酮的最佳提取工艺条件，为开发和利用灵香草中的黄酮类　光谱扫描，确定５０５　ｎｍ为最大吸收波长。　成分提供理论参考。　１材料与仪器　２．１．３标准曲线的制作和回归方程的建立分别精密量取对照　品溶液０．０，０．５，１．０，２．０，３．０，４．０，５．０　ｍｌ置于１Ｏ　ｍｌ容量瓶中，　１．１材料灵香草２００７—０７采于广西金秀县，自然风干后，在真　各加８０％甲醇溶液至５　ｍｌ，再加０．３　ｍｌ　５％亚硝酸钠溶液，摇匀，　空干燥箱中以６Ｏ℃干燥至恒重，粉碎备用；芦丁标准品（中国药　放置６　ｍｉｎ后，加１０％硝酸铝溶液０．３　ｍｌ，摇匀，放置６　ｍｉｎ，加　品生物制品检定所）；所用试剂均为分析纯。　１０％氢氧化钠溶液１．５　ｍｌ，用８０％甲醇溶液定容至１０　ｍｌ，摇匀，　１．２仪器ＴＵ一１９０１双光束紫外可见分光光度计（北京普析通　放置１５　ｍｉｎ后，以空白液作参照，在５０５　ｎｍ波长处测定吸光度。　用仪器有限公司）；ＢＳ１２４Ｓ型电子天平［赛多利斯（北京）科学有　以芦丁浓度（　）和吸光度（ｙ）绘制标准工作曲线（见图１），并作　限公司）］；Ｒ一１００１型旋转蒸发仪（郑州长城科工贸有限公司）；　最小二法线性回归，得线性回归方程：Ｙ＝５．８０３　８Ｘ＋０．０５０　７，相　ＤＺＦ一１Ｂ型真空干燥箱（上海跃进医疗器械厂）。　２方法与结果　关系数为　：０．９９９　４。　２．１　总黄酮含量的测定　收稿日期：２００９－０５－２６；修订日期：２００９－０９—１４　基金项目：国家“９７３”计划前期研究专项（Ｎｏ．２００７ＣＢ５１６８０５）；　２．１．４样品液的制备和黄酮含量的测定精密称取２０　ｇ已干燥　至恒重的灵香草样品，按单因素实验和正交实验中不同的提取条　件进行回流提取。提取液过滤后减压浓缩，用８０％甲醇定容至　２５０　ｍｌ，精密吸取样品溶液０．３　ｍｌ置１０　ｍｌ容量瓶中，用８０％甲　醇定容至刻度，摇匀，冷藏备用。　精密量取样品液０．１　ｍｌ，按“２．１．３”项操作的方法测定吸光　广西科技厅应用基础研究专项（桂科基０７３１０５０）；　广西医药产业人才小高地项目（Ｎｏ．０８０９）　度。由回归方程计算样品总黄酮的含量。　作者简介：杨瑞云（１９７８－），女（汉族），广西桂林人，现任广西师范大学化　２．２单因素实验　学化工学院副教授，博士学位，主要从事天然有机化学研究工作．　・２．２．１　乙醇浓度对总黄酮提取的影响称取灵香草药材６份，每　１７ｌ８・　ＬＩＳＨＩＺＨＥＮ　ＭＥＤＩＣＩＮＥ　ＡＮＤ　ＭＡＴＥＲＩＡ　ＭＥＤＩＣＡ　ＲＥＳＥＡＲＣＨ　２０１０ＶＯＬ．２１　ＮＯ．７　时珍国医国药２０１０年第２ｌ卷第７期　份２０　ｇ，分别以１０％，３０％，５０％，７０％，８０％，９５％的乙醇回流提　的要求，我们选择１．５　ｈ左右的时间作为考察对象。　取，用１０倍量的液料比第１次提取２　ｈ，第２次提取１　ｈ，合并两　２．２．４提取次数对总黄酮提取的影响称取灵香草药材５份，每　８　次提取液，浓缩得浸膏，按照“２．１．４”项配制样品溶液并测定其　份２０　ｇ，用５０　ｍｌ　８０％乙醇回流提取２　ｈ，提取次数分别为１，２，３，　吸光度。由回归方程计算出供试样品中总黄酮的含量。　４，５次，过滤，浓缩得浸膏，按照“２．１．４”项测定吸光度，计算样品　不同浓度乙醇对提取的影响如图２所示。实验结果表明，　中总黄酮的含量。提取次数对总黄酮含量的影响如图５所示。　７０％乙醇的提取效果较好，往后随着乙醇浓度的加大，黄酮含量　结果表明随着提取次数增加，总黄酮的含量也增加。但提取３次　反而下降，有可能是随着乙醇浓度的增加，某些脂溶性杂质的溶　后，含量变化曲线已较为平缓。考虑到生产工艺对时间的要求和　出的量增加，干扰因素增多。　溶剂量的损耗，提取次数以３次为宜。　０　０　０１　０　０２　０　０３　０　０４　０　０５　０　０６　浓度Ｃｌｍｇ・ｒｎＩ　图１芦丁标准曲线　图４提取时间对灵香草总黄酮提取的影响　口Ｅ，暑　砸　“９　８　７　６　５　４　３　２　１　Ｏ　提取次数　图５　提取次数对灵香草总黄酮提取的影响　图２　乙醇浓度对总黄酮提取的影晌　２．２．２液料比对总黄酮提取的影响称取灵香草药材５份，每份　２．３正交实验采用　（３　）正交实验设计，结合单因素实验结　２０　ｇ，分别用液料比为８：１，１２：１，１６：１，２０：１，２５：１的８０％　果，进一步考察乙醇浓度（Ａ）、液料比（Ｂ）、提取时间（Ｃ）、提取次　乙醇回流提取２　ｈ，过滤，浓缩得浸膏，按照“２．１．４”项配制样品　数（Ｄ）对黄酮含量的影响，以确定最佳提取工艺条件。正交实验　溶液并测定吸光度，计算出样品中总黄酮的含量。　因素设计见表１，实验结果见表２，方差分析见表３。　液料比对提取的影响如图３所示。从图中可知，随着液料比　从表２可知，在实验范围内影响灵香草总黄酮提取的主次因　增加，黄酮含量也在不断增大。但当溶剂量大于１０倍时，提取率　素为Ｄ＞Ａ＞Ｃ＞Ｂ，即提取次数＞乙醇浓度＞提取时间＞液料　增加缓慢，即灵香草中黄酮类化合物溶出量已趋向最大值。从环　比。从表３方差分析可知提取次数和乙醇浓度为显著因素，其它　境保护和节约溶剂的角度出发，我们选择液料比１０：１左右作为　两个为不显著因素。通过综合以上因素，确定最佳提取工艺条件　考察对象。　为Ａ。Ｂ２Ｃ２Ｄ３，即６０％乙醇、液料比１０：１、２　ｈ／次、提取３次。　表１因素水平表　２．４最佳提取工艺条件的验证按上述最佳提取工艺条件进行　３次验证试验。结果见表４。由验证结果可知，按最佳工艺条件　图３　液料比对灵香草总黄酮提取的影响　得到的总黄酮含量为０．９８％，均高于其他各正交实验值，ＲＳＤ＝　２．２．３提取时间对总黄酮提取的影响称取灵香草药材５份，每　０．６４％（ｎ＝３），说明此工艺条件稳定、可行。　２．５精密度实验精密量取同一测试样品，按照“２．１．４”项测定　份２０　ｇ，用１００　ｍｌ　８０％乙醇回流提取，提取时间分别为０．５，１．０，　吸光度，重复测定６次。结果见表５。ＲＳＤ为０．７６％，表明本方　１．５，２．０，２．５　ｈ，过滤，浓缩得浸膏，按照“２．１．４”项测定吸光度，　计算样品中总黄酮的含量。　法精密度良好。　提取时间对总黄酮提取的影响如图４所示。结果表明，提取　２．６稳定性实验取同一样品，按照“２．１．４”项测定吸光度，每　１．５　ｈ后总黄酮总量增长速度有所减缓。考虑到生产工艺对时间　隔５　ｍｉｎ测１次吸光度，ＲＳＤ为１．１０％，表明样品溶液在ｌ　ｈ内测　定基本稳定。见表６。　・】７】９・　时珍国医国药２０１０年第２１卷第７期ＬＩＳＨＩＺＨＥＮ　ＭＥＤＩＣＩＮＥ　ＡＮＤ　ＭＡＴＥＲＩＡ　ＭＥＤＩＣＡ　ＲＥＳＥＡＲＣＨ　２０１０ＶＯＬ．２１　ＮＯ．７　表２正交设计及数据处理　表６稳定性实验结果　３讨论　正交实验结果表明，在乙醇热浸提取灵香草中总黄酮时，各　因素对提取量的影响大小次序为：提取次数＞乙醇浓度＞提取时　间＞固液比，其中提取次数的影响最大，固液比的影响最小。在　选定的水平范围内，随着回流温度和固液比的增大，提取量亦提　高，但由于本试验中使用的固液比值较大，提取充分，故对灵香草　总黄酮提取量的影响较小。从极差分析中可见，乙醇提取灵香草　总黄酮的最佳工艺条件是Ａ。Ｂ　ｃ：Ｄ　，即６０％乙醇，液料比１０：　编号　总黄酮含量（％）　平均含量（％）　ＲＳＤ（％）　１，２　ｈ／次，提取３次。按此方案提取，所得总黄酮含量最高。该　工艺简单易行，稳定性好，是灵香草中提取总黄酮的有效方法。　参考文献：　［１］龚复俊，王有为．广西灵香草挥发油化学成分［Ｊ］．植物资源与环　境学报，２００４，１３（３）：５９．　［２］　江苏新医学院．中药大辞典，下册［Ｍ］．上海：上海科学技术出版　社，１９８６：２４７０．　［３］杨瑞云，何瑞杰，李远，等．正交试验法优选广豆根中总黄酮提　取工艺［Ｊ］．中药材，２００９，３２（３）：４４１．　复方千黄凝胶成型工艺研究　姜平川，李　嘉，陈　锋，麦少洁，杨炯珍　（广西中医药研究院，广西南宁５３００２２）　摘要：目的优选复方千黄凝胶的最佳成型工艺。方法以凝胶的外观颜色，均匀细腻度，光泽度，粘稠度为指标，采用正　交设计法，对凝胶剂基质中卡波姆、羟丙基甲基纤维素钠（ＨＰＭＰ）、甘油、丙二醇的投料量进行优选。结果凝胶剂基质最　佳投料量为卡波姆２．０％，羟丙基甲基纤维素钠１．５％，甘油２０％，丙二醇１５％。结论复方千黄凝胶成型工艺切实可行．　为工业化生产提供了依据。　关键词：复方千黄凝胶；　成型工艺；　正交实验　ＤＯＩ标识：ｄ０ｉ：１０．３９６９／ｉ．ｉｓｓｎ．１００８＿（）８０５．２０１０．０７．０７２　中图分类号：Ｒ２８３　文献标识码：Ｂ　文章编号：１００８－０８０５（２０１０）０７—１７２０－０２　复方千黄凝胶由复方千黄洗液改剂型而成，由岗松油、大叶　１仪器与试药　桉油、满山香油等中药提取物加上凝胶基质制成。主要用于湿热　１．１仪器ＪＭ—Ｌ６５胶体磨（中国鼎邦机械制造有限公司）；电　下注所致的阴部瘙痒，或灼热痛，带下量多，色黄；霉菌性、滴虫性　子天平ＦＡ１００４（上海精科天平）；ＩＭ０—２Ｆ电动搅拌机（杭州仪　阴道炎见以上症候者。其制备中有关药材的提取工艺已经另文　表电机有限公司）。　报道，本工艺就复方千黄凝胶基质的成型进行了研究。　１．２试药羟丙基甲基纤维素钠（ＨＰＭＰ）、卡波姆、甘油、丙二　醇、月桂氮卓酮（国药集团化学试剂有限公司，化学纯）；无水硫　收稿日期：２００９￣６４６；　修订日期：２００９—１０－２Ｏ　酸钠（广东汕头市西陇化工厂，分析纯）。　基金项目：广西壮族自治区科技攻关项目（Ｎｏ．０６３０００２—１Ｄ）　２方法与结果　作者简介：姜平川（１９６３一），女（汉族），山东乳山人，现任广西中医药研究　２．１凝胶剂的制备工艺…取羟丙基甲基纤维素钠、卡波姆，加　院副研究员，学士学位，主要从事植物化学、新药开发研究工作．　水适量，搅匀，浸泡４～５　ｈ，使充分溶胀，加入月桂氮卓酮搅拌混　・１７２０・