葡萄酒的气相色谱分析

葡萄酒的气相色谱分析

第一部分 分析方法的设置

在葡萄成熟期和葡萄汁发酵过程中，存在着许多生物和微生物现象。这些现象的争相作用就转化出多种化学物质。另外，这些不同的物质又可以起纯化学反应，或被微生物作用再产生出新的化学成分。这一系列持续不断的变化过程，使得葡萄酒的成分极为复杂。因此提出葡萄酒的分析方法，应能够无变化地分离这些物质，而且对于定量具有明显感官特性的极微量成分，应该具有极高的灵敏性。近年来，人们选用气相色谱法分析研究葡萄酒，做了大量工作，成绩十分显著，可以分析400多种挥发性的芳香物质。本文是笔者试图对在实际分析工作中应该注意的主要问题的总结，同时介绍一些比较成熟的分析方法。

一、实验技术上的注意事项

1.对仪器的两点改进

直接注射酒样于气相色谱仪中，是一种最简单的分析方法，通常给出的结果也是最精确的；在可能的情况下，应尽量使用这种方法。但一些不挥发的物质会停留在注射器中，产生热解作用而干扰分析结果；另外，一些衍生物是不稳定的，如某些酸的三甲基硅烷脂，它们的分解可被注射器的金属内壁催化。这两件事应当注意。为克服这种现象，须对仪器稍加改进。可采用在注射器中插入一个石英玻璃管，使其具有最大的化学惰性，并很容易卸下来清洗（在分析未发酵的葡萄汁或含有很多糖的葡萄酒时，每三次注射后清洗一次）。这是一种极简单而又实用的方法。在研究三甲基硅烷衍生物的时候，出现硅铺满了检测器的内壁使其失去灵敏性的现象；为了避免这一点，须改进检测器。可在位于检测器内部的小帽上焊接一个直径4毫米的不锈钢烟管，下部装一个喇叭形的玻璃小帽，硅烟被烟管引

向外面，达到火焰顶部；或者在检测器出口处加一烟囱小帽可获得同样效果。对1/8寸的经典柱，氢气流量减小为25毫升/分，空气流量增大到450毫升/分，在这种情况下，检测器虽不是最灵敏的，但硅烟能很快被排出，硅的沉积物减少90%以上，一般10次2微升注射后清洗电极就够了。

2.色谱元件

使用的色谱柱应该与分析的物质相适应。一般用经典的不锈钢柱，在分析低温稳定产品时用铜柱，在分析一些与金属接触会分解的产品时用石英柱。担体粒度一般用0.18到0.25毫米，或0.10到0.18毫米（即用23号或24号和25号标准筛滤器过筛）的。随着分析种类的不同，担体或者被加热活化，或者相反除去活性。例如分析醇和脂时，担体被加热到850℃，保持4小时，可以得到乙酸乙脂、甲醇、乙醇等峰的好的分辨率；相反，在分析游离酸，或三甲基硅烷衍生物时，必须使担体尽可能老化。担体chromososorbw被六甲基二硅氨烷处理，可以减少峰的拖尾。

尽管有许多文献叙述了各种固定相的可用性，但对于给定的分析，为了得到最好的测定结果，经常还是要做试验。我们用Carbwax400和Hallcomid M1801的混合成分用于分析蒸馏酒中的挥发物质。在进行游离挥发酸的分析时，应当在常用的固定相中加入1%的磷酸。

3.分析条件

每次分析都要校准柱中的气体流量、柱温和样品的注射体积。在实际应用中，对一个普通的1/8吋柱，最佳流量是20到25毫升/分。

炉温的选择是使一次分析用不太长的时间（15到45分钟）便可得到使各个峰很好的分离的色谱图。在分析被溶剂萃取的物质成分或分析多羟基组份的三甲基硅烷衍生物时，可能不得不采用一个重现性结果不够理想的温度程序。

样品注射体积对1/8吋柱来说通常是2微升，最多不超过5微升。但对1/4吋的制备柱可以是50或60微升。注射器的温度要比柱子使用的最高温度高50℃，检测器的温度应该高于柱温几十度。注射样品浓度一般在10毫克/升以上。由于仪器引起的背景噪声；火焰的变化；被载气带入的固定液的损失所造成的基线改变等，这些变化都会改变峰面积，使得小于10毫克/升浓度的物质很难测出。对于浓度过低的物质需要进行浓缩，一般采用惰性气体提取法、有机溶剂萃取法和用矿物盐和饱和醇相中的水使有机成分浓缩等方法。

一些多羟基化物由于分子之间存在氢键而不挥发，为了用气相色谱来研究这些物质，就需除去氢键。醇功能团上的氢可以被乙酰基或三甲基硅烷取代或被酸脂化，生成的新化合物是热稳定的，尽管它们的分子量比原先大，但还是能很好地挥发。

4.离子交换树脂的应用

对化学成分过于复杂的酒，最好用离子交换树脂进行族分离来分别分析，避免过多的色谱图。用5—7毫升阴离子树脂Bio—Red Dowex2×8或AG2×8处理5毫升酒样，可以固定酒里的酸，然后被6N的甲酸溶液洗出，能够获得较好的色谱分离。用10毫升Amberlite IRA400 OHˉ型树脂处理3毫升酒样，可以固定糖和酸，使多元醇在流出液和水洗液中全部得到回收，这对单独研究多元醇是很方便的。

MERCKⅢ阴离子树脂可以不经预先活化处理，只要在水中充分溶胀后，保存在30%的乙酸溶液中即可使用，但给出的结果不如其他树脂好。

二、定性分析

在好的色谱测定条件下，每个物质的保留时间是不变的，所以鉴定一个物质的保留时间就可以识别它。然而这种鉴定往往不是一目了然的，尤其是对某些未知峰，除了用已知文献资料对照查找外，往往还需采用不同的技术来确证。

1.离子交换

Dowex2或MerckⅢ型树脂可固定酒中的酸，然后被甲酸洗脱。这些柱同样可以检出会在流出液和水洗液中的中性物质。Amberlite IRA400的OHˉ除去糖。

2.皂化

用KOH溶液皂化一个酒可以除去脂，随后的萃取液中将不存在这些脂。使一个酒保持PH12.3，在40℃连续通氮气24小时，它的色谱图与对照样品比较，相当于脂的峰已经消失。

3.水解

酸水解一个酒可以鉴定海藻糖。用3N盐溶液回流2小时，将酒水解，它的三甲基硅烷脂的色谱图表明，海藻糖全部消失，转化为葡萄糖。

4.还原

用氢硼化钠还原醛糖变为醛糖醇。当酒中存在木糖时，木糖醇的峰明显增加。若酒中存在相应于其它醛糖的多元醇时，不可能用这种方法。

5.生成各种衍生物

利用特性反应生成衍生物可精确地鉴定物质，而且可以生成不同类型的衍生物使得同系物很好地分离。山梨糖醇、甘露糖醇和己六醇的三甲基硅烷衍生物是分离不好的，但乙酰基衍生物分离就较好。当然也可以选用不同的柱子来分离。

6.化学处理

化学处理如萃取可以鉴定一些物质。比如在Saccharomyces cidri发酵液中加入一滴硫酸，用氮气处理2小时后，萃取物色谱图中的缩醛峰几乎全部消失了；同样，用乙醚萃取酒中的挥发酸，然后用2M的NaHCO3溶液清洗使之消失。用通氮气法可进行许多单一脂的浓缩以及最高分子量为C10的乙脂的浓缩。这些脂可以被浓缩500倍，而醇只能浓缩10到20倍。用己烷萃取也可得到高浓度的高分子量的脂。用乙醚萃取脂肪酸效果也很好。

7.注射纯物质

在同样的条件下注射纯物质，对比它们的保留时间，来鉴定色谱图中的未知物，是常用的方法。为了消除温度和其他客观因素的影响，最好是同时注射纯物质和样品，即在样品中加入一点纯物质，使得相一致的峰增高1到2厘米。这些纯物质必须是单一的峰，不能有任何分离。

8.注射同系物

在没有纯物质用于鉴定未知物时，有时可以注射相同系列的同系物。比如，所有的线性脂肪酸可以用于鉴定未知脂肪酸。我们知道这些物质的保留时间对数量与分子的碳原子

数成线性关系，它可以测定在这个系列中，未知物是否可能出现。

9.光谱法鉴定

对一些用以上叙述的方法难以鉴定的未知物，需进行收集物质用于红外分光光度鉴定，或色质谱联合使用可以鉴定完全未知的新物质。

三、定量分析

1.内标准的选择

定量醇我们不用丁醇—1做内标，因为在葡萄酒中总是存在着少量的丁醇—1，有时在蒸馏酒中它的量还是较大的。戊醇—1在定量高级醇时，它的保留时间太长，同样不能使用。直接注射酒样定量甲醇、乙酸乙脂和高级醇时，我们用4—甲基戊醇—2做内标。定量乳酸乙脂、乙酸乙脂、2，3—丁醇和丙醇，选用3—羟基乙酸乙脂做内标。定量丙三醇和2，3—丁二醇用5—甲基-3-己醇做内标。庚酸可作为定量有机酸的内标准。2—甲基丙基丁醇或己基己脂可被选用定量脂的内标。定量葡萄酒中的防腐剂可用十一酸做内标。对混合分层的浓缩物定量时用4—甲基戊醇—1做内标。?—苯基乙酸乙脂可作为单一定量?—苯基乙醇的内标，因为它们的浓度系数非常接近。定量多羟基化物时选用香草酸做内标，也可用戊二酸做内标。定量糖和多元醇选用季戊四醇做内标。

2.参考溶液的配制

定量分析需要用纯物质配置与酒样相同的已知化学成分的参考溶液，用与酒样相同的方法处理这个溶液，随后做标准曲线来证明方法的可靠性。配制的溶液含有10%的乙醇，

调pH到3左右。

3.重现性的测定

一种定量方法能够使用，首先需要知道它的重现性，即经过对同样方法处理的同样产品的10个样品分析结果看其再现性是否良好。也要测定其平均偏差。我们通常习惯测定这10个分析结果的平均偏差，基本上可以确定这种操作的定量精确性。在直接注射酒样的色谱定量中，其精密度是3%，但在酒通过离子交换树脂并在真空下浓缩的衍生物，平均偏差可能达到15%。

4.标准曲线的测定

按照葡萄酒中的成分，精确地配制各种不同浓度的溶液来测定检测器的应答和浓度之间的关系。一般做5次测定就够了。当一个物质在色谱图中出现几个峰时，需计算它们的总面积。如还原糖的?和?两种形式都要计算在内。在我们进行的所有定量中，标准曲线都是经过原点的直线。

5.测定加入的已知量物质

葡萄酒的成分是非常复杂的，人们常常担心其中的一些物质与另外的物质相互作用而干扰定量分析。常常用同样的方法测定，而得到的结果都有些差异，如测定配制的参考溶液，结果很好，而测定酒样就差一些。为了消除疑虑，我们可以先单独地测定酒样，然后加一定量的各种已知物于该酒样中，再来定量，加入酒中的物质的浓度顺序应当与酒中原来物质的浓度次序一样。加入的量应当被准确地测定出来。

6.结果的表达

按下面公式计算一个物质的浓度：

c=C×h/H×I/I

c－样品中该物质的浓度；

C－对照溶液中该物质的浓度；

h－样品中该物质的峰面积或峰高；

H－对照溶液中该物质的峰面积或峰高；

i－样品中内标准的峰面积或峰高；

I－对照溶液中内标准的峰面积或峰高。

7.色谱法定量与化学法定量的比较

由于葡萄酒中的许多成分可以用化学法定量，所以我们可以比较色谱法和化学法定量的结果，便知其优劣。对于酸、醇和脂其结果是完全可以比较的。对糖而言，如果在酒中的相对含量是很大的，其结果也是完全一样的，但对于酒中的还原糖，用不同的化学分析法和色谱法的结果比较，变化很大。因为葡萄酒中有些还原物质如半乳糖酸和一些醛糖酸同样消耗菲林溶液，处理方法不同，结果并不能完全表示还原糖。同样在化学法和色谱法之间，定量多元醇的结果也是有差别的。

第二部分 酒中主要成分的定量分析

用气相色谱法定量酒的化学成分，一般来说更正确一些，因为它可以测定各个物质的个体浓度，而化学法一般只是定量一个总体。在对葡萄酒进行深入的研究过程中，我们不仅要了解各种成分的总体特性，而且必须了解对酒质起重要作用的各主要成分的个体特性和相互关系以及随着环境条件的改变这些成分的演变，这样我们就能有目的地改变环境条件，使有益成分增加，无益成分减少，按照消费的需要生产出各种各样的酒。

在气相色谱法定量中，对有足够含量的挥发性物质，尽量用直接注射法测定；对含量微小的挥发性物质必须事先浓缩，比如用通惰性气体冷凝捕集浓缩，或溶液分层分离浓缩，或用有机溶剂萃取浓缩等；对不挥发性物质需予先生成挥发性的衍生物进行测定。下面介绍一些目前比较成熟的分析方法，也是葡萄酒研究中最常用的方法。

（一）直接注射酒样定量分析

在葡萄酒的挥发性物质中，丙三醇、2，3—丁二醇、乙酸乙酯、乳酸乙酯、乙酸、丙酸、甲醇和一些高级醇有足够的含量，可以直接注射酒样进行定量分析。

1. 丙三醇和2，3—丁二醇的定量

丙三醇和2，3—丁二醇是酒精发酵的产物，它们存在于一切葡萄酒中。丙三醇在葡萄酒中的含量是除乙醇外最高的有机物，通常在4~20克/升之间。它们虽然可以用分析其他多元醇的方法去定量，但在实际应用中用直接注射酒样来定量更为方便。

操作方法：于20毫升酒样中加入2毫升1，4—丁二醇内标准溶液（20克1，4—丁

二醇溶于1升10%的酒精水溶液中），在电磁搅拌下充分混合均匀。注射2微升该混合液于Chromosorb101柱来分析丙三醇，于Tenax GC柱来分析2，3—丁二醇。如果在1，4—丁二醇处有峰，也可用1，6—乙二醇做内标准（40克/升的10%酒精水溶液）。

2. 乙酸乙酯、甲醇、正丙醇、2—甲基丙醇—1、2—甲基丁醇—1和3—甲基丁醇—1的定量

在葡萄酒中乙酸乙酯常占挥发酯的80%以上，它也是酒精发酵中的产物，对酒的气味有明显影响。它的含量过高会使酒带有刺激性的酸味。甲醇来源于葡萄果浆的水解，它的致死剂量约为100毫升，对人体极其有害，必须严格控制其含量。杂醇油也是酒精发酵时氨基酸被酵母代谢后的产物，它们的含量太高时对白葡萄酒的味觉性质有损害。定量这些物质对评价酒的质量有一定参考价值。

操作方法：于50毫升酒样中加入5毫升4—甲基戊醇—2标准溶液（1克/升的10%酒精水溶液），电磁搅拌均匀，以（Carbowax400 4%+Hallcomid M1801 1%）测定。

2

微升注入

C+H

柱

参考溶液用1升10%的乙醇溶液中含：100毫克甲醇和2—甲基丙醇—1，50毫克乙酸乙酯，25毫克丙醇—1，12.5毫克丁醇—1，58毫克2—甲基丁醇—1，192毫克3—甲基丁醇—1。

3. 2—苯基乙醇的定量

这个高级醇用直接注射法定量是很困难的，还很少有人采用这种方法。我们研究用2米长的F.F.A.P柱，在140℃下以12醇—1为内标（500毫克/升的50%乙醇溶液）直接

注射定量，最大平均偏差5.8%。此法对甜酒也可应用，因它的峰与来自糖分解的峰互不干涉，但需经常清洗注射器插头。2—苯基乙醇具有愉快的香味，而它的感知极限较低（约为50毫克/升），增加它的含量是有益的。在酒中它的含量常在10毫克/升以下。

4. 乳酸乙酯、乙酸、丙酸和2，3—丁二醇的定量

乙酸在葡萄酒中的含量可达到350毫克/升，它是酒精发酵时被酶氧化乙醇生成的，另外细菌氧化糖或乙醇也可生成乙酸，在酒中其他的脂肪酸含量都比乙醇小得多。丙酸的含量大约从2.9毫克/升到5.6毫克/升的范围内波动。2，3—丁二醇有左旋和内消旋两种异构体，结果计算需加在一起。

操作方法：于20毫升酒样中加入2毫升3—羟基乙酸乙酯内标溶液（5克/升的20%乙醇水溶液），搅拌均匀，以2微升注入D.E.G.C—H3PO4柱中。

对照溶液有两种配制：第一种含有200毫克/升乙酸和20毫克/升丙酸，第二种是50毫克/升的乳酸乙酯和600毫克/升的2，3—丁二醇（70%的左旋型和30%的内消旋型混合，它们是被制备色谱收集的）。

（二）萃取法定量酯、挥发酸和防腐剂

对于在葡萄酒中含量极微而又具有明显感官特性的物质，不能用直接注射法测定，需对酒样做前处理。有机溶剂萃取法就是先用有机溶剂萃取浓缩葡萄酒中的一些芳香物质，然后用气相色谱定量。

1. 用毛细管柱定量酯类化合物

一些高分子量的酯常具有花香或水果香味，构成葡萄酒的一定感官特性，定量分析这些酯对葡萄酒工艺的研究和对酒质的评价都是有意义的。在葡萄酒中，绝大部分的酯是由酶酯化生成的，只极少部分是化学酯化生成的。

操作方法：50毫升酒样加入20毫升辛醇标准溶液（30毫克辛醇于1升20%的乙醇水溶液），用1︰1体积的乙醚乙烷溶剂萃取4次，取2微升萃取液注入W.C.O.T毛细管空心柱（固定相为F.F.A.P）。温度程序为：起始温度50℃保持1分钟，然后以3℃/分的速率升温至190℃保持10分钟。

参考溶液（1升20%的乙醇水溶液中含有：乙酸异戊酯2.5毫克，乙酸乙酯1.5毫克，乙醇2.3毫克，异戊醇12.0毫克，乙酸己酯1.0毫克，辛酸乙酯2.0毫克，癸酸乙酯1.5毫克，琥珀酸乙酯4.0毫克，乙酸2–苯基乙酯1.0毫克，2—苯基乙醇12.0毫克，十二酸乙酯2.0毫克。）

2. 挥发酸的定量

葡萄酒中的挥发酸是发酵 二级产物，其中乙酸和乳酸的含量最多，其他脂肪酸含量都很小，但它们的感官作用是不可忽视的。

操作方法：取50毫克酒样加1毫升庚酸内标溶液（15%的乙醇溶液），中和至pH7.5，在50℃下减压蒸干，以10%的乙醇洗残渣于分液漏斗中，调到pH2，用5毫升CH2CL2萃取，反复三次得15毫升萃取液。注射2微升该萃取液于D.E.G.S—H3CO4柱。

对照溶液用1升20%乙醇水溶液（含300毫克的乙酸，5毫克的丙酸，1毫克异丁酸，1毫克异戊酸，6.71毫克己酸，7.71毫克辛酸，5.毫克癸酸，4.7毫克十二酸）。

3. 防腐剂己二烯酸的测定

己二烯酸又称山梨酸，它不是葡萄酒中的天然成分，但作为一种防腐剂被允许应用。在葡萄酒中，山梨酸的含量在200毫克/升以下，在果酒中不允许存在。山梨酸的定量可通过直接注射酒样于D.E.G.S或D.E.G.A—H2PO4，或者F.F.A.P—H3PO4柱来进行。但由于酒中其他成分的拖带使它的小峰不是总能检测出来的。我们采用乙醚萃取山梨酸，效果很好，最大相对误差在6%以下。

操作方法：取20毫升酒样，被1毫升1/3H2SO4酸化，加入2毫升十一酸内标溶液（1克/升50%的酒精水溶液），用10毫升乙醚萃取，注射2微升于D.E.G.S—H3PO4柱，在150℃下测定。

（三）生成衍生物定量不挥发物质

存在于葡萄酒中的糖、多元醇、固定酸、酚类和一些醇、酸是不挥发的，如用气相色谱来研究它们，须将其变为可挥发性的衍生物使氢键松散。这些物质的分子中都含有活泼的氢原子能够实现酰基化转化，生成甲氧基、乙氧基、醚和硅酰基衍生物（T.M.S）。从这些衍生物出发来研究酒中的多羟基化物，我们认为硅烷化的方法比较好。

操作方法：T.M.S衍生物是在无水条件下形成的。取5毫升酒样放入9毫升的青霉素小瓶中，在45℃下减压蒸干，于残留物中加入0.2毫升吡啶，0.7毫升（CH3）3—Si—NH—Si（CH3）3和0.1毫升三氟乙酸，小评用涂有聚四氟乙烯膜的橡胶盖盖住，避免被硅烷混合物侵蚀，盖帽上再用铝盖压紧在瓶口上。然后将小瓶放在60℃的加热器保持30分钟，使两相混合。随后在常温下放置数小时便可注射入仪器中。在这样的情况下，酸的衍生物在数周内是稳定的，糖和多元醇的衍生物可以保存几个月甚至数年不变。小瓶盖上的铝帽有

可撕开的部分，用时撕开铝盖，微量注射器的针头穿过橡胶插入瓶中抽取样品，注射量是1微升，色谱柱用QF（4米×1/8吋），温度程序从80℃升到180℃，以每分钟2℃速率升温。

内标准：分析酸用20克/升50%乙醇水溶液的香草酸，分析多元醇和糖用1.5克/升或15克/升的季戊四醇水溶液。 对照样品用1升10%的乙醇溶液，其中含：①3克酒石酸，3克苹果酸，3克乳酸，0.5克丁二酸，0.5克柠檬酸，0.05克柠苹酸。②350毫克葡萄糖，340毫克果糖，200毫克海藻糖，50毫克阿糖醇，25毫克木糖醇，200毫克甘露糖醇，60毫克山梨糖醇，200毫克左旋己六醇和70毫克丁四醇。

李德鹏2010-05-29